Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trục tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Ket quả đã chứng minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không đế lại những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh.
1 Phần MỞ ĐÀU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, người có xu hướng trở dần với tính chất thiên nhiên thơng qua việc sử dụng số chất có hoạt tính sinh học hay phương pháp sinh học đế ứng dụng công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường đế chữa bệnh Lý đơn giản người hiếu mặt trái sử dụng chất hóa học, chất kháng sinh Những chất có hiệu nhanh chóng hậu mà mang lại lớn Trong chăn nuôi nuôi trồng thủy sản trước người ta thường dùng chất kháng sinh đế phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm tôm, cá Việc sử dụng kháng sinh thời gian dài đế lại nhiều hậu không mong muốn kháng thuốc vi khuẩn rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng dẫn đến khó điều trị Nghiêm trọng tồn dư kháng sinh thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm, gây cản trở cho việc xuất làm thiệt hại lớn chăn nuôi Đe khắc phục tình trạng này, nhà khoa học nghiên cứu sử dụng trục tiếp vi sinh vật sống, có lợi thường gọi “probiotic” Ket chứng minh lợi ích vi khuẩn có lợi việc phòng điều trị số bệnh chăn nuôi, thủy sản cho người Điều quan trọng khơng đế lại hậu hay di chứng sử dụng loại hóa chất thuốc kháng sinh Xuất phát từ vấn đề tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ chăn ni thủy sản 1.2 MỤC ĐÍCH Xác định môi trường tối ưu vi khuẩn Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi thú y nuôi trồng thủy sản 1.3 YÊU CẦU 1.3.1 Đổi vói Bacillus subtilis S Thực việc nuôi cấy Bacillus subtilis nhiều loại môi trường khác đế xác định xem môi trường làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease amylase nhiều S Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis s Kiếm tra chất lượng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản 1.3.2 Đổi vói Lactobacillus acidophilus Phân lập từ chế phẩm Antibio Hàn Quốc sản xuất Tìm mơi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối tạo acid lactic cao Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacỉllus acidophilus Kiếm tra chất lượng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản Phần VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIÊM ••• 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THựC HIỆN Khóa luận thực từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 phịng thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường đại học Mở Bán Cơng thành phố Hồ Chí Minh 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN cứu 2.2.1 Giống vi khuẩn • Bacillus subtilis ATCC - 6633 cung cấp từ khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh • Lactobacỉllus acidophilus phân lập từ chế phẩm Antibio Hàn Quốc sản xuất 2.2.2 Thiết bị - dụng cụ • Thiết bị: tủ ấm, tủ sấy, giá đỡ ống nghiệm, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, giấy đo pH, kính hiển vi, cân, máy lắc, đường kế, bếp điện • Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, pipet, micropipet, đầu type vô trùng, que cấy trang, đũa thủy tinh, khăn giấy 2.2.3 Hóa chất • Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, íuschin, lugol • Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH IN, HC1 IN, H 202 30%, dầu soi kính, cồn • Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt 0,02%, dung dịch casein 0,1% 2.2.4 Môi trường ni cấy 2.2.4.1 Đối với Bacillus subtilis • Mơi trường tăng sinh nutrient broth (NB) • Mơi trường giữ giống đếm số lượng tế bào nutrient agar (NA) • Môi trường nhân giống cấpl: môi trường Frage, pepton - gelatin, ri đường + % tinh bột, Edward mơi trường Nomura • Mơi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì 2.2.4.2 Đối với Lactobacỉllus acidophilus • Mơi trường tăng sinh chọn lọc MRSB • Mơi trường phân lập MRSA • Mơi trường ni cấy thử phản ứng sinh hóa • Mơi trường sản xuất: mơi trường sữa đặc có đường mơi trường sữa đậu nành 2.3 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.3.1 Đổi vói Bacillus subtilis Giống gốc Baciỉỉus subtiỉis Nhuộm Grarn, kiểm tra độ Tăng sinh Môi trường NB (nutrient broth) 5% giống Môi trường Nomura Môi trường ri đường +2% tinh bột Môi trường Fragie Môi trường Edwards Môi trường pepton - gelatin 48 giờ, nhiệt độ phòng Kiểm tra SỐ lượng vi khuẩn có lml Hoạt độ enzyme protease Hoạt độ enzyme amylase Chọn môi trường tối ưu 10 % giống Môi trường A Môi trường B Môi trường c Môi trường D Chọn môi trường tối ưu Sản xuất chế phấm chứa Bacillus subtilis Bảo quản, kiếm tra Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Bacillus subtilis Mơi trường E 2.3.1.1 Khảo sát khả tăng sinh khối enzyme Bacillus subtilis môi trường nhân giống cấp Giống chứa Bacillus subtilis tăng sinh môi trường NB có pH = thời gian 24 giờ/37°c Sau 24 cho dung dịch tăng sinh vào loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột %, pepton-gelatin với điều kiện khảo sát: nhiệt độ phòng, pH = 7, lượng giống: 5% thời gian nuôi cấy 48 Sau 48 tiến hành kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase protease Từ kết kiếm tra số lượng hoạt độ enzyme loại môi trường chọn môi trường nhân giống cấp tối ưu đế tiếp tục nhân giống mơi trường nhân giống cấp Thí nghiệm lập lại lần 2.3.1.2 Khảo sát khả tăng sinh khối enzyme Baciỉỉus subtilis môi trường nhân giống cấp Sau chọn lọc môi trường nhân giống cấp tốt tiến hành xác định môi trường nhân giống cấp tối ưu Cách bố trí thí nghiệm thực sau: Môi trường sử dụng môi trường bán rắn bố trí gồm loại mơi trường A, B, c, D E có bổ sung CaCƠ3 2% để ổn định pH môi trường Tất loại môi trường trước đem nuôi cấy hấp khử trùng 121°c 15-20 phút Lượng giống sử dụng môi trường nhân giống cấp 10% với độ ẩm môi trường 60 - 65%, pH = Từng loại môi trường đặt khay nhựa có kích cỡ 0,5 X 0,25 X 0,08 m, khay chứa 0,6 kg mơi trường Trong q trình ni phải giữ ẩm cho môi trường cách phủ vải ẩm Sau thời gian ni 72 nhiệt độ phịng bắt đầu thu hoạch sau đem sản phẩm kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn hoạt độ enzyme amylase, protease Sau kiếm tra tất loại môi trường A, B, c, D E nhằm tìm mơi trường nhân giống cấp cho sinh khối hoạt độ enzyme cao đế tiến hành sản xuất Mỗi mơi trường thí nghiệm lập lại lần 2.3.1.3 Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Sau tìm mơi trường nhân giống cấp tối ưu tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Baciỉỉus subtilis Cách thực tương tự thí nghiệm 2.3.1.2 Sau thời gian ni 72 bắt đầu thu hoạch đem sấy nhiệt độ 40 45°c ngày cho sản phẩm khô hồn tồn Sau đem đóng gói, kiếm tra bảo quản Quy trình sản xuất thực theo sơ đồ 2.2 Nước 60 - 65 % so với nguyên liệu Môi trường nhân giống cấp tối ưu Khoáng hỗn hợp Hấp khử trùng 121 °c 20 -25 phút Làm nguội đến 37°c Đổ lên khay Giống Bacillus subtilis 10% Nuôi 72 nhiệt độ phịng Đánh tơi Sấy khơ 40 - 45°c Xay mịn Chế phẩm chứa Bacillus subtilis Đóng gói, kiếm tra bảo quản Sơ đồ 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis 2.3.1.4 Kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn hoạt độ enzyme Chế phẩm chứa Baciỉỉus subtilis sau sấy khô tiến hành kiếm tra số lượng phương pháp đếm khóm vi khuẩn đĩa, hoạt độ enzyme amylase theo phương pháp Wolhgemuth, protease phương pháp Gross + Fuld kiếm tra tiêu sau thời gian bảo quản 10,20 30 ngày nhiệt độ phòng 2.3.2.1 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Mầu phân lâp: sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Hàn Quốc sản xuất Quy trình phân lâp: lml Đồng pha loãng mẫu 10 lml lml c c o lml lml lml c o o 10-2 10-3 10-4 1 gam mẫu + 9ml ddNaCl 9°/oo 10-5 10-6 10-7 n\ J 1_ \u T Môi trường phân lập MRSA J Chọn khuấn lạc điến hình, nhuộm Gram thử phản ứng sinh hóa Cấy giữ giống Môi trường giữ giống MRSA Sơ đồ 3.4 Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobaciỉỉus acidophiỉus Cách tiến hành Chế phẩm Antibio (gói/lgam) hịa vào ml nước muối sinh lý (nồng độ 700) sau lắc cho dung dịch trở nên đồng ta dung dịch có nồng độ pha lỗng 10"1 Tiếp theo lấy lml dung dịch 10" cho vào ml dung dịch NaCl 9°/oo ta dung dịch có nồng độ 10" Tiếp tục dung dịch có nồng độ 10" 6, 10"7 Dùng micropipet hút 0,2ml dịch khuẩn nồng độ 10" 6, 10"7 (mỗi nồng độ cho vào đĩa) trang mặt thạch chứa môi trường MRSA đem ủ nhiệt độ 37°c 24 chọn khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc trịn đều, nhơ lên bên ngồi có vịng trong) đem nhuộm Gram cấy giữ giống Những khuẩn lạc nghi ngờ đuợc tăng sinh môi trường MRSB 24 nhiệt độ 37°c để tiến hành thử phản ứng sinh hóa Xác đinh vi khuẩn Lactobacỉllus acidophilus Vi khuẩn Lactobacỉllus acidophilus xác định dựa phương pháp truyền thống như: o Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc bắt màu nhuộm Gram o Thử nghiệm phản ứng sinh hóa 2.3.2.2.Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn độ chua Theme mơi trường sữa đặc có đường Giống chứa Lactobacỉllus acidophilus sau phân lập tăng sinh môi trường MRSB thời gian 24 37°c Sau cho lượng giống 5% vừa tăng sinh vào mơi trường sữa đặc có đường với nồng độ sữa là: 15%, 20% 25% Sau thời gian nuôi 24 giờ, pH = 6,5 - nhiệt độ phịng chúng tơi tiến hành kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn độ chua Theme loại nồng độ 2.3.2.3.Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn độ chua Theme môi trường sữa đậu nành Tương tự thí nghiệm 2.3.2.2 sử dụng 5% giống môi trường sữa đậu nành với nồng độ đậu nành 10%, 15% 20% ứng với nồng độ đậu khảo sát nồng độ đường cho vào 0%, 10%, 15% 20% Những nồng độ ký hiệu sau: o Ở nồng độ 10% đậu có bổ sung hàm lượng đường 0%,10%,15% 20% ký hiệu NAo, NAio, NA15, NA20 o Tương tự nồng độ 15% đậu có: NB0, NB10, NB15 NB20 o Ở nồng độ 20% đậu có: NCo, NCio, NCi5 NC20 Sau thời gian nuôi cấy 24 giờ, pH = 6,5 - nhiệt độ phịng chúng tơi tiến hành kiếm tra độ chua Theme số lượng tế bào vi khuẩn 2.3.2.4.Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứaLactobacỉllus acidophilus Từ kết khảo sát độ chua số lượng vi khuẩn hai loại mơi trường sữa đặc có đường sữa đậu nành chọn môi trường tối ưu đế tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacỉllus acidophilus Sau 24 nuôi môi trường tối ưu nhiệt độ phòng với lượng giống cho vào 5% Chúng bắt đầu thu hoạch đem phối trộn với bột đậu nành khô qua khử trùng (sấy 100°c 2giờ) Tỷ lệ phối trộn 1:1 sau đem sấy nhiệt độ 40 - 45°c ngày cho sản phẩm khơ hồn tồn Sản phẩm xây mịn, đóng gói sau đem kiếm tra bảo quản nhiệt độ phòng 2.3.2.5 Kiếm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm sau sấy khô tiến hành kiếm tra số lượng tế bào vi khuẩn có gam sản phẩm sau thời gian bảo quản 10 20 ngày phương pháp đếm số lượng tế bào sống trcn thạch 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.4.1 Xử lý số liệu Số liệu xử lý thống kê phần mềm Minitab release 13.20 đế so sánh khác biệt mơi trường Đổi với thí nghiêm ừ~ên Bacillus subtilis Mơi truờng nhân giống cấp môi trường nhân giống cấp dùng dùng trắc nghiệm yếu tố đế xem tác động của: ■ Môi truờng lên số lượng tế bào vi khuẩn ■ Môi truờng lên hoạt độ enzyme amylase ■ Môi truờng lên hoạt độ enzyme protease Đổi với thí nghiêm ừ~ên Lactobacỉllus acidophilus Mơi truờng sữa đặc có đường dùng trắc nghiệm yếu tố đế xem ảnh hưởng nồng độ sữa lên số lượng độ chua L acidophilus Môi truờng sữa đậu nành dùng trắc nghiệm hai yếu tố nồng độ đậu nành hàm lượng đường sữa đậu nành đế: ■ So sánh khác biệt nồng độ đậu hàm lượng đường lên số lượng độ chua Theme sữa ■ Ảnh hưởng nồng độ đậu hàm lượng đường lên số lượng độ chua sữa 2.4.2 Biểu đồ Biếu đồ vẽ phần mềm Excel phiên 2003 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐÓI VỚI BACILLUS SUBTILIS 3.1.1.Kết khả tăng sinh khối enzyme Bacillus subtilis môi trường nhân giống cấp 3.1.1.1 Khả tăng sinh khối Bảng 3.1 Số lượng tế bào B subtilis loại môi trường nhân giống cấp Môi Trường Edward Lặp lại (n) Fragie Nomur a 3 pepton- Rỉ đường + tinh gelatin 2% X(xio10 cfu/g) SD l,5667a 0,21455 l,3600b l,4267b 0,391 0,411 Cv% 13,69 28,78 28,83 bột 0,4537c 0,0773 l,9200d 0,2455 17,05 12,78 Ghi chủ : Chữ a, b, c, d khác biệt mặt thống kê loại môi trường 3.1.1.2 Khả sinh enzyme amylase protease Bảng 3.2 Hoạt độ enzyme amylase protease loại môi trường nhân giống cấpl Môi trường Enzyme Edward Fragie Lặp lại (n) Amylas X(W0/ml) SD e Cv% 8a 16b 0 0 Lặp lại (n) 3 Protease X (Hđp/ml) SD Cv% 8a 0 13,33b 4,6188 34,64 Nomur pepton Rỉ đường + a - 26,67c 9,2376 2% tinh bột 3 a 10,67 265d 4,6188 34,63 43,28 3 16b 0 32c 0 128d 0 Qua kết khảo sát số lượng tế bào/ml, hoạt độ enzyme amylase, protease môi trường nhân giống cấp nhận thấy mơi trường ri đường có bố sung 2% tinh bột môi trường tối ưu loại môi trường khảo sát Từ định chọn môi trường môi trường nhân giống cấp thích hợp đế sử dụng cho mơi trường nhân giống cấp 3.1.2 Kết khả tăng sinh khối enzyme Bacillus subtilis môi trường nhân giống cấp 3.1.2.1 Khả tăng sinh khối Bảng 3.3 Số lượng tế bào B subtilis loại môi trường nhân giống cấp Môi Trường Lặp lại (n) X (x 1010 cfu/g) SD Cv% 3.1.1.2 A B 155,33 345,67a 126,595 b55,229 36,62 35,55 c D E 11,3 3 C Ố8 1,362 11,98 13,26c 1,623 12,24 12,74c 2,619 20,56 Khả sinh enzyme amylase protease Bảng 3.4 Hoạt độ enzyme amylase protease môi trường nhân giống cấp Qua bảng 3.3 3.4 nhận thấy môi trường A B có tương đồng khả sinh enzyme amylase protease Tuy nhiên xét đến khả tạo sinh khối mơi trường A môi trường tối ưu Từ kết khảo sát số lượng hoạt độ enzyme môi trường A, B, c, D E, định chọn môi trường A làm môi trường sản xuất thích họp đế sản xuất chế phẩm chứa B subtilis 3.1.3 Kết kiểm tra sổ lượng B subtilis hoạt độ enzyme sau sản xuất chế phẩm Số lượng tế bào vi khuẩn : 58,9 X o10 cfu/g Hoạt độ amylase: 160 Wo/ml Hoạt độ protease: 80 Hđp/ml 3.1.4 Kết kiểm tra chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản Bảng 3.5 Ket kiếm tra chế phẩm Baciỉỉus subtilis thời gian bảo quản Chế độ Thời điểm bảo quản kiểm tra 10 (ngày) bào (xio9 cfu/g) 118 (W0/ml) 160 protease 80 (Hđp/ml) 20 88,9 160 80 30 68,9 160 80 Nhiệt độ thường Số lượng tế Hoạt độ amylase Hoạt độ Quy đối hoạt độ enzyme amylase protease sang đơn vị quốc tế Hoạt độ amylase 160 W0/g -6576 Ul/ml Hoạt độ protease 80 Hđp/ml - 572,8 Ul/ml iỉ o M