Từ thập kỉ truớc enzyme đã đuợc sử dụng trong công nghiệp chế biến nhung mới chỉ có tính chất kinh nghiệm thuần tuý. Công nghệ enzyme ra đời là một buớc buớc phát triển ứng dụng của enzyme. Ngày nay việc nghiên cứu enzyme đã buớc vào một giai đoạn mới, một giai đoạn của sự tích hợp của nhiều ngành khác nhau nhu hoá học protein, sinh học phân tử....Do đó, có đuợc những hiểu biết đầy đủ hơn về tính chất hóc học, cấu trúc, động học....Tạo điều kiện để sản xuất enzyme ở qui mô lớn, giảm giá thành sản sản phẩm, hiệu quả ứng dụng ngày càng cao.
Đô án chuyên môn GVHD: 5.1 Trang Đô án chuyên môn GVHD: 5.2 Cá c hệ enzyme sản xuất nước mắm 5.3.7 .Hệ enzyme Metalo-protease 5.3.2 Hệ enzyme serin-protease 5.3.3 Hệ enzyme acid-protease 5.3 Vỉ sinh vật sản xuất nước mắm 5.4 Qu ỉ trình sản nước mắm 5.5 Ng uyên liệu xử lý nguyên liệu 5.6.1 Hả i sản 5.6.2 Nư ớc 5.6.3 Mu ối 5.6.4 Nấ m mốc Asp.oryzae 5.7 Một sổ nguyên nhân dẫn đến nước mắm chất lường cách phòng chữa 5.7.1 Chượp chua 5.7.2 .Ch ượp đen 5.7.3 .Ch ượp thối 5.7.4 .Nư ớc mắm thối Trang Đô án chuyên môn GVHD: 5.8 Bả o quản KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 36 36 36 37 38 39 39 39 39 39 40 40 41 41 42 42 43 44 Trang MỞ ĐẦU Một thành tựu to lớn khoa học công nghệ thơi gian gần nghiên cứu enzyme, đặt trung cho phát triển khoa học tự nhiên chục năm qua, khám phá cấu trúc hóa học chế tác dụng kỳ diệu enzymexúc tác sinh học Enzyme đóng vai trị quan trọng nghành công nghiệp đại Truớc enzyme enzyme đuợc dùng nghiên cứu áp dụng sản xuất thuờng đuợc thu nhận từ động vật, thực vật Trong năm gần nguời ta bắt đầu ý đến nguồn enzyme vô phong phú rẻ tiền Đó nguồn enzyme đuợc tách chiết từ vi sinh vật Các vi sinh vật có tốc độ phát triển nhanh tạo luợng enzyme vô lớn thời gian ngắn, đồng thời enzyme có hoạt lực xúc tác cao Do đó, chúng đuợc ứng dụng cho sản xuất enzyme Qua nhiều năm việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nhu nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất sản phẩm đuợc tạo nhiều Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease cao (giá trị bn bán 187.2 triệu USD) Do đó, hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme sản xuất Các chế phẩm thu đuợc sau q trình ni cấy sản xuất enzyme chua phải chế phẩm có độ tinh khiết cao protein chiếm 20 - 30% Với để tài: “Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mổc Aspergillus, oryzae ủng dụng sản xuất nước mắm ” nhằm thu đuợc chế phẩm có độ tinh khiết cao ứng dụng lĩnh vực khác đời sống xã hội cần thiết CHƯƠNG TỔNG QUAN VÈ ENZYME Enzyme protein có khả xúc tác cho phản ứng hoá học với mức độ đặc hiệu khác nhiệt độ tuơng đối thấp Enzyme có tất tế bào sống chất xúc tác sinh học Enzyme có đầy đủ tính chất chất xúc tác, nhung enzyme có hiệu suất xúc tác lớn tất chất xúc tác hữu vơ khác Enzyme khơng xúc tác cho phản ứng thể sống mà sau tách khỏi hệ thống sống, điều kiện định chúng giữ đuợc hoạt tính xúc tác.Các chất tham gia phản ứng enzyme xúc tác gọi chất enzyme, ký hiệu S.E có tính đặt hiệu cao nghĩa emzyme tác dụng chất định Từ thập kỉ truớc enzyme đuợc sử dụng cơng nghiệp chế biến nhung có tính chất kinh nghiệm tuý Công nghệ enzyme đời buớc buớc phát triển ứng dụng enzyme Ngày việc nghiên cứu enzyme buớc vào giai đoạn mới, giai đoạn tích hợp nhiều ngành khác nhu hoá học protein, sinh học phân tử Do đó, có đuợc hiểu biết đầy đủ tính chất hóc học, cấu trúc, động học Tạo điều kiện để sản xuất enzyme qui mô lớn, giảm giá thành sản sản phẩm, hiệu ứng dụng ngày cao Sử dụng enzyme sản xuất nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động, giảm ô nhiễm môi trường Cùng với phát triển khoa học enzyme học, việc ứng dụng enzyme ngày mở rộng, phát triển tầm cao hơn, không lĩnh vực truyền thống mà vực tạo sản phẩm 1.1 Tình hình nghiên cứu Trước kỉ XVII việc sử dụng enzyme có tính chất kinh nghiệm tuý người xưa biết dùng vi sinh vật nguồn enzyme trình lên men sản xuất bánh mì, sản xuất giấm, rượu vang Thế kỉ XVII đến nửa đầu kỉ XVIII đề khái niệm lên men Vanhemom người Hà Lan lần quan sát tượng tạo thành chất khí khác khơng khí trình lên men Năm 1659, Silvius lần nêu lên rằng, bản, tất q trình sống q trình hóc học Nửa cuối kỉ XVIII có thí nghiệm enzyme chẳng hạn nhu cơng trình nghiên cứu khả tiêu hố thịt dày Cơng trình Reaumur (nguời Pháp) bắt đầu sau đuợc Sapallanzani (nguời Ý) mở rộng Các tác giả cho thịt vào ống kim loại đua vào nhiều động vật khác thấy thịt bị tiêu hoá Năm 1836, Schwann gọi chất tiêu hoá thịt pepsin (pepxin) Từ năm 1800 nguời ta cịn thấy ruột cịn có enzyme phân giải protein khác Sau Kuhne đặt tên enzyme trypsin Nửa đầu kỉ XIX nguời ta đá tách đuợc số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác có tách dụng thuỷ phân chất tuơng ứng bắt đầu tách đuợc chất tạo nên trình lên men Nửa cuối kỷ XIX tinh đuợc số enzyme nghiên cứu số tính chất enzyme Nửa đầu kỉ XX phát đuợc CoE (Harden Young, 1906) xác định ảnh huởng pH đến hoạt độ enzyme (Sorensen, 1909) nghiên cứu động học phản ứng enzyme (Bayliss, 1919) kết tinh đuợc enzyme xác định đuợc chất hoá học enzyme protein Đã áp dụng thành công phuơng pháp nghiên cứu enzyme hoàn thiện phuơng pháp xác định cấu trúc bậc phân tử enzyme 1.2 Cấu tạo hoá học Các enzyme protein đuợc cấu tạo từ 20L - amino acid (Các amino acid kết hợp với qua liên kết peptid (-CO-NH-) đuợc tạo thành phản ứng kết hợp nhóm a carboxyl amino acid đứng truớc, với nhóm amoha-amin amino acid tiếp theo, loại phân tử nuớc Theo cách kết hợp liên kết peptid nằm mạch thẳng khơng phân nhánh, có hai đầu tận gọi “đầu N” (có nhóm a - amin tự amino acid thứ nhất), kí hiệu dấu “+”và “đầu C” (có nhóm a - carboxyl tự amino acid cuối cùng, kí hiệu dấu Đánh dấu thứ tự gốc amino acid phân tử “đầu N” Trong số truờng hợp đầu N đầu c kết hợp với nhau, phân tử có cấu trúc vịng Giống protein khác, enzyme protein đơn giản, gọi enzyme thành phần protein phức tạp, gọi protein hai thành phần hay holoenzyme Phân tử holoenzyme bao gồm thành phần: phần protein gọi apoenzyme, phần prorein gọi Coenzyme Coenzyme có vai trị quan trọng để thực chức xúc tác, loại bỏ coenzyme làm khả xúc tác Trong số trường hợp, riêng coenzyme chất xúc tác không hiệu kết hợp với apoenzyme Cùng coenzyme kết hợp với apoenzyme khác tạo thành holoenzyme khác nhau, xúc tác cho phản ứng chuyển hoá khác giống kiểu phản ứng Coenzyme có vai trị làm ben enzyme Apoenzyme có vai trị quan trọng với tính đặc hiệu enzyme tăng hiệu xúc tác Coenzyme.Coenzyme thường chất dẫn xuất vitamin hồ tan nước Vì thiếu vitamin ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme tương ứng tế bào, vi phạm trình trao đổi chất thể, gây nên bệnh đặt trưng 1.2.1 Phân loại Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng enzyme, năm 1961 tiểu ban enzyme học quốc tế trình bày báo cáo, có đề nghị nguyên tắc định tên phân loại enzyme Người ta chia enzyme làm lóp Oxydoreductase' enzyme xúc tác cho phản ứng oxi hoá-khử Transferase', enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị Hydrolase', enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân Lyase', enzyme xúc tác cho phản ưng phân cắt không càn nước Isomerase' enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hoá Ligase (synthetase)', enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu lượng ATP Mỗi lớp chia thành nhiều tổ (dưới lớp), tổ chia thành nhiều nhóm (siêu lớp) Tên enzyme thường gọi' Tên chất đặc hiệu - loại phản ứng xúc tác cộng thêm tiếp vĩ ngữ ase Đơ án chun mơn 1.3 GVHD: Tính chất Enzym có chất protein nên có tất thuộc tính lý hóa protein Đa số enzym có dạng hình cầu khơng qua màng bán thấm có kích thuớc lớn Tan nuớc dung môi hữu phân cực khác, không tan ete dung môi không phân cực Không bền duới tác dụng nhiệt độ, nhiệt độ cao enzym bị biến tính Mơi truờng axít hay bazơ làm enzym khả hoạt động Enzym có tính luỡng tính: tùy pH mơi truờng mà tồn dạng: cation, anion hay trung hòa điện Enzym chia làm hai nhóm: enzym cấu tử (chỉ chứa protein) nhu pepsin, amylase enzym hai cấu tử (trong phân tử cịn có nhóm khơng phải protein) 1.4 Cơ chế tác dụng ([5]) Trong phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ tạo thành phức hợp trung gian enzyme chất mà chất đuợc hoạt hóa, biến đổi tạo thành sản phẩm Nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy trình tạo thành phức hợp enzyme chất biến đổi phức hợp thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự thuờng trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau E + S->ES->P + E ị+Ề substrate the Reaction Enzỹme Hình 1.1 Cơ chế tác dụngcủa enzyme SVTH: Trang Đồ ản chun mơn Trong đó: E Enzyme, GVHD: s chất (Substrate), ES phức hơp enzyme - chất, p sản phẩm (Product) Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với chát liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - chất (ES) không bền, phàn ứng xảy nhanh địi hỏi lượng hoạt hóa thấp Giai đoạn thứ hai: xảy biến đổi chất dẫn tới kéo căng phá vỡ liên kết đồng hóa trị phân tử chất Giai đoạn thứ ba: tạo thầnh sản phẩm, cịn enzyme giải phóng trở lại trạng thái tự ban đầu để quay vịng xúc tác Hình 1.2 Một vỉ dụ minh họa tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tấc độ đến phản ứng ([5]) Phản ứng enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhỉều yếu tố như: nồng độ enzyme, đặc tính nồng độ chất, nhiệt độ, pH môi trường phản ứng, ion kim loại, chất vô hữu khác (có tác dụng kiềm hãm hay hoạt hố enzyme) Các yếu tố hố lý khơng ảnh hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu đối vớỉ phản ứng hố học bình thường mà cịn ảnh hưởng đến cấu trúc không gian, độ bền cấu trúc khơng gian, độ tích điện phân tử enzym, làm thay đổi hoạt độ xúc tác 1.5.1 Ảnh hưởng nồng độ ([E]) Nói chung, điều kiện thừa cở chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào E]:v = k[E] SVTH: Trang [E]2[E] V Đô án chuyên môn 20 40 60 GVHD: 80 Hình 1.3 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến vận toc phản ứng V : vận tốc phản ứng, [E] : nồng độ enzyme [E]i Nồng độ E lớn, sau khoảng thời gian ngắn, vận tốc phản ứng thay đổi theo thời gian Theo sơ đồ nên chọn nồng độ [E] có đuợc phụ thuộc tuyến tính V vào thời gian khoảng thời gian dài hơn, dễ dàng xác định v Do nên tiến hành lựa chọn nồng độ enzyme truớc xác định hoạt độ enzyme nghiên cứu động học phản ứng enzyme 1.5.2 Ảnh hưởng nồng độ chất Tốc độ phản ứng đơn giản phuơng trình hóa học biểu diễn theo phuơng trình động học Michaelis - Menten : K„ + [51 Ở trạng thái đầu, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ chất Nếu điểm đó, tất phân tử enzyme thực chức xúc tác đuợc gọi tốc độ phản ứng tối đa với luợng enzyme xác định, tăng dần luợng chất dung dịch đầu hoạt tính enzyme tăng dần nhung đến lúc gia tăng nồng độ chất không làm tăng hoạt tính Enzyme Đó tất trung tâm hoạt động enzyme đuợc bão hồ chất SVTH: Trang 10 Đơ án chuyên môn GVHD: Hĩnh 4.1 Khay nuôi cấy Thông sỗ kĩ thuật: + Dày 4-5 cm + Cao 1-1,2m Giai đoạn ỉ: Giai đoạn kéo dài từ 10-14 kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy giai đoạn có thay đỗi sau nhiệt độ tăng chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng bắt đầu thay đồi, khơỉ mơỉ trường cịn rời rạc, enzyme mod bắt đầu hình thành Trong giai đoạn không đưa nhiệt độ cao 30oc thời kì đầu giống mln cảm với nhiệt độ Giai đoạn 2: Giai đoạn kéo dài từ 14-18 Trong giai đoạn có thay đồỉ sau: Toàn bào tử phát triển thành sợi nấm phát triển mạnh tạo thành mạng chằng chịt bao quanh hạt mơi trường, nhìn rõ sợi nấm màu trắng xám mắt thường, môi trường kết lại chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môỉ trường cổ thể tăng nhanh lên 40-50°°, chất dinh dưỡng giảm nhanh đồng hóa sợỉ nấm, enzyme prorease tổng hợp mạnh, lượng Ơ khơng khí giảm lượng CO tăng dần, cần phải thơng khí mạnh trì mức nhiệt độ từ 29-30oc tốt Giai đoạn 3: Gỉai đoạn kéo dài từ 10-20 Trong giai đoạn có thay đổi sau Quá trình trao đổi chất yếu dàn, mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng giảm lại, nhiệt độ môi trường giảm, lượng enzyme tạo giảm xuống Do cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu 4.2.3 SVTH: Chế phẩm thô Trang 28 Đồ ản chuyên môn GVHD: Mục đích: Thu chế phẩm enzyme protease, chế phẩm gọi enzyme thơ ngồi thành phần enzyme chúng chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường nước Cách tiến hành' Đe đảm bảo enzyme khơng bị hoạt tính nhanh người ta thường sấy enzyme đến độ ẩm thấp (Thường dùng máy sấy chân không) Nhiệt độ sấy vào khoảng 38-40oc,enzyme protease bị hoạt tính 60-76oc, độ ẩm sau kết thúc sấy nhỏ 10% Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta sử dụng enzyme mà không cần phải tinh Trong trường hợp khác ta phải tiến hành tinh enzyme để bảo quan lâu 4.2.4 Trích ly Mục đích' Tách enzyme enzyme khỏi khối mơi trường Cách tiến hành' Sau nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme Các loại enzyme thủy phân có khả tan nước nên người ta sử dụng chúng dung mơi hịa tan Cứ phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ lọc lấy dịch, phần bã loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc SVTH: Trang 29 Thiết bị: Thiết bị trích ly kỉểu thùng quay Hình 4.2 Máy trích ỉy Thơng số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 25°° + Thời gian 40-60 phút 4,2.5 Kết tủa enzyme Mục đích' Thu nhận dung dịch enzyme Cách tiến hành' Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn suníatmon Trong q trình người ta làm lạnh dung dịch thô tác nhân kết tủa để tránh làm hoạt tính enzyme Cứ phàn dung dịch enzyme thô cho 2-2.5 phần cồn sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh tượng biến tính, khuấy nhẹ để điều kiện lạnh từ 4-7°° thời gian, enzyme tạo thành kết tủa lắng xuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%) Người ta tiếp tục sấy kết tủa 40oc độ ầm giảm xuống 5-8% Đô án chuyên môn GVHD: Thiết bị: Thiết bị kết tủa Thông sổ kĩ thuật: + Nhiệt độ:tiến hành nhiệt độ phòng + Muốũamoni sunfat 80% + Thời gian: 10-18 + Hoạt độ riêng: 162 IU/mg + Hiệu suất: 74% 4.2.6 Ly tâm Mục đích : Tách sinh khối vi sinh vật bã canh truờng Các biến đổi' Sự thay đổi thể tích, khối luợng riêng, nhiệt độ dung dịch, thay đổi hàm luợng chất khơ chất hịa tan pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù thành pha rắn-lỏng Các yếu tố ảnh huởng: Sự chênh lệch khối luợng riêng pha rắn lỏng:chênh lệch nhiều trình diễn dễ dàng hơn, tốc độ quay roto: Tốc độ nhanh trình diễn tốt Thiết bị: Thiết bị ly tâm lắng SVTH: Trang 31 Đơ án chun mơn GVHD: Hình 4.4 Thiết bị ly tâm lắng Thông sổ công nghệ: + Tốc độ quay 10000 rpm +Thời gian 10 phút + Nhiệt độ 40C + Hoạt độ riêng 80 liu/mg + Độ tinh sạch: 4.2.7 Hệ thống sẩy phun Mục đích' Tách nước khỏi dung dich mà khơng làm thay đổi tính chất enzyme nhằm bảo quản lâu Các yếu tổ ảnh hưởng' Nồng độ chất khô nguyên liệu, nồng độ cao làm giảm thời gian bốc hơi, tăng độ nhớt nguyên liệu gây khó khăn cho trình sấy phun Nồng độ thấp làm tốn nhiều thời gian lượng cho trình Nhiệt độ sấy lưu ý đến nhiệt độ biến tính enzyme để điều chỉnh nhiệt độ sấy thích hợp Hình 4.5 Thiết bị sấy phun SVTH: Trang 32 Đơ án chuyên môn GVHD: Thông sổ ỉđ thuật: + Nhiệt độ: 30-300oc + Điện thế: 380V-50Hz-3 pha + Điều kiện: Chống nhiệt + Chế độ làm việc: Liên tục SVTH: Trang 33 CHƯƠNG NGHIÊN cứu SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 5.1 Giói thiệu chung nước mắm Nước mắm dung dịch đạm mà chủ yếu acid amin tạo thành trình thủy phân protein có cá nhờ enzyme protease Ngồi ra, nước mắm dùng điều trị số bệnh đau dày, phỏng, thể suy nhược, cung cấp lượng Nước mắm sản xuất tất hầu châu Á Giả trị dinh dưỡng nước mắm\ Các chất đạm chiếm chủ yếu định giá trị dinh dưỡng nước mắm, gồm loại: + Đạm tổng số + Đạm amin + Đạm amon Ngồi nước mắm cịn chứa đầy đủ acid amin, đặc biệt acid amin không thay thế: valin, bucin, methienin, isokucin, phenylalanin, alanin Và có chất trung gian làm cho nước mắm bị hư hỏng hoạt động vi sinh vật Các chất bay định hương vị nước mắm: + Các chất cacboxyỉ bay hơi\ 407 - 512 mg/100g nước mắm + Các acid bay hơi\ 404 - 533 mg/100g nước mắm + Các amỉn bay hơi\ 9,5 - 11,3 mg/100g nước mắm + Các chất trung tỉnh bay hơi\ 5,1 - 13,2 mg/100g nước mắm Mùi nước mắm hình thành chủ yếu hoạt động vi sinh vật yếm khí q trình sản xuất tạo Và số chất khác: + Các chất vô cơ\ NaCl chiếm 250 - 280 g/1 số chất khoáng như: s, Ca, Mg, p, I, Br + Vitamin: Bl, B12, B2, pp 5.2 Bản chất trình sản xuất nước mắm Bản chất quy trình sản xuất nước mắm là: 'ủ Cá + muôi ' nước măm Bản chất trình q trình thủy phân protein cá nhờ hệ Enzyme protease pepton polypeptid peptid 5.3 Các hệ enzyme sản xuất nước mắm 5.3.1 Hệ enzyme Meíalo-proíease acid amin Hệ enzyme tồn nội tạng cá chịu nồng độ muối cao nên từ đầu hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ trở sau Loại enzyme có hoạt tính mạnh, có khả thủy phân rộng rãi loại peptid Đây nhóm enzyme thủy phân trung tính pH tối thích từ 5-7, pl từ 4-5, ổn định với ion Mg 2+’ Ca2+ hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+ 5.3.2 Hệ enzyme serin-protease Điển hình enzyme tripsin tồn nhiều nội tạng cá Hệ enzyme bị ức chế chuỗi acid amin cấu trúc enzyme Đe tháo gỡ chuỗi phải nhờ đến hoạt động men cathepsin B Nhưng lại dễ bị ức chế nồng độ muối cao.Vì để men cathepsin B hoạt động nguời ta thực cho muối nhiều lần Enzyme serin- protease hoạt động mạnh pH từ 5-10, mạnh pH= 5.3.3 Hệ enzyme acid-protease Có thịt nội tạng cá điển hình enzyme cathepsin D Hệ enzyme bị ức chế nồng độ muối khoảng 15% nên thường tồn thời gian ngắn thời kì đầu q trình thủy phân Loại men đóng vai trị thiết yếu sản xuất nước mắm 5.4 Vi sinh vật sản xuất nước mắm Nguồn gốc: + Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, khơng khí ) + Bổ sung hệ enzyme protease sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae + Ngày với phát hiển ngành công nghệ sinh học nói chung ngành cơng nghệ sản xuất chế phẩm enzyme nói riêng người ta thường sử dụng phương pháp sinh vật cách cho thêm chế phẩm enzyme vào nguyên liệu trình ủ chượp làm tăng rõ rệt hình thủy phân rút ngắn thời gian sản xuất từ - 12 tháng xuống - ngày [2], Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm lớn khơng có hương vị thời gian sản xuất ngắn, bị chua tinh bột lên men lactic sinh acid dễ bay cá bị ươn, đắng xác vi sinh vật tồn chất lượng muối có nhiều ion Ca 2+, Mg2+ Và điều cần lưu ý cho thêm vào nguyên liệu lượng enzyme đảm bảo môi trường không ức chế hoạt động enzyme cho vào cấy vào lượng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp protease cao vi khuẩn phải chống chịu với điều kiện bất lợi trình ủ chượp 5.5 Quỉ trình sản nước mắm 5.6 Nguyên liệu xử lý nguyên liệu 5.6.1 Hải sản Nguyên liệu hải sản dùng sản xuất nuớc mắm: cá, tôm, phế thải đông lạnh Nguyên liệu rửa mùn, cát, chọn nguyên liệu tuơi chất luợng nuớc mắm tốt, loại hải sản to phải cắt nhỏ 5.6.2 Nước Đe sản xuất thực phẩm nói chung nuớc mắm nói riêng nuớc cần đạt tiêu chuẩn sau: + Độ cứng trung bình đạt từ - 17% cứng làm ảnh huởng tới thủy phân protein tinh bột + Các chất khoáng chất hữu không vuợt mức 500 - 600 mg/1 nuớc + Số luợng vi sinh vật không 20 - 100 con/cm2 nuớc đặc biệt không chứa vi sinh vật gây bệnh + Chỉ số E coli có lít nuớc khơng vuợt q 20 độ chuẩn E coli phải lớn 50 + Trong sản xuất nuớc mắm tỷ lệ nuớc cho vào - 10% đủ 5.6.3 Muối Sử dụng muối có tinh thể nhỏ, màu sáng, độ trắng cao, khơng vón cục, khơng bị chát, luợng muối cho vào sản xuất nuớc mắm - 6% so với khối luợng cá Thành phần hóa học muối quan trọng Nếu muối chứa hàm luợng Mg Ca cao làm ức chế hoạt động enzyme làm chất luợng nuớc mắm không tốt cần phải lựa chọn loại muối tốt 5.6.4 Nấm mốc Asp.oryzae Yêu cầu: Chế phẩm sử dụng dạng thô đuợc tinh Tỷ lệ mổc cá\ từ - 4% tính theo chế phẩm enzyme thơ, cá xay nhỏ trộn với enzyme protease Các thành phần nguyên liệu trộn với theo tỷ lệ tiên hành vỉ chuợp theo dõi đến dung dịch có màu nâu tuơi nâu xám xám Riêng nước cốt có màu vàng rơm đến cánh gián Có mùi thơm đặc trưng khơng có mùi chua, lạ chướp chín lấy dung dịch phơi nắng sấy 50°c dung dịch khơng có biến đổi so với mẫu đối chứng nước mắm chín Nếu màu từ vàng rơm cánh gián chuyển sang vàng nhạt, hương vị đặc trưng đục chượp chưa chín Hoặc ta dùng phương pháp để kiểm tra độ chín chượp: lắc mạnh mẫu nước mắm, lắc 30 40 lần sau để n 20 phút mẫu nước mắm khơng biến đổi so với mẫu đối chứng chượp chín 5.7 Một sổ nguyên nhân dẫn đến nước mắm chất lường cách phòng 5.7.7 Chượp chua chữa Hiện tượng', chượp bốc mùi chua, màu xám đượm mùi khó chịu Ngun nhân' + Chua mặn đầu' Do lượng muối lúc đầu nhiều, lượng muối ngấm vào lớp thịt cá phía bên ngồi, bên nội tang chưa kịp ngấm muối, làm cho thịt cá bị nhạt muối, xảy trình phân giải sinh nhiều acid bay phức tạp như: glycogen, glucose bị phân giải yếm khí tạo acid lactic Các chất phân giải hiếu khí tạo acid acetic acd butytic Ngoài chất béo bị thủy phân tạo glycerin acid béo chất đạm khứ amin thành acid béo + Chua nhạt đầu' Cá nhạt muối khơng đủ sức kìm hãm phát triển vi sinh vật phân giải tạo nhiều acid bay phức tạp, làm phát sinh mùi chua, thối nhanh chóng chuyển sang hư thối Cách phịng chữa' + Cần phải cho muối đủ + Náo đảo, phơi nắng kéo rút qua bã chượp tốt + Dùng rượu chuyển acid sang dạng ester có mùi thơm trung hịa NaHC03 + Dùng thính để hấp thụ mùi + Chua mặn đầu tiến hành cho thêm nước lã vào chượp tiến hành chế biến chượp 5.7.2 Chượp đen Hiện tượng: Nước bị xám đen, cá nhợt nhạt mức độ cao hon cá bị đen Nguyên nhân: + Do cá có bùn đất tạp chất khơng mang nhớt bên mà nội tạng cá + Do sắc tố có da, thịt nội tạng cá + Do phân hủy chất khác + Do trộn muối không gây ngưng tụ nhóm amin nhóm aldehyde + Sự oxy hóa chất béo chưa bão hòa Cách phòng chữa: + Xử lý nguyên liệu ban đầu tốt + Cần chọn lựa nguyên liệu ban đầu cho kỹ, tránh nhiễm bẩn + Cho thing rang kỹ bã chượp tốt vào bã chượp đen tiến hành đánh khuấy tăng cường phơi nắng + Dùng chất chống oxy hóa Kmn04, Kcl03, H202 để oxy hóa chất đen + Khi chượp trở mùi kịp thời cho muối vào để ngăn chặn phát triển vi sinh vật + Đun sôi nước bổi, màu đen bị phá hủy bay hơi, vi sinh vật bị tiêu diệt 5.7.3 Chượp thối Hiện tượng: chượp thối đen có mùi thối chượp đen chưa thối Nguyên nhân: chủ yếu muối nhạt sau có địi muối ta khơng kịp thời cho muối vào Khi vi sinh vật hoạt động phân hủy chất có đạm chủ yếu acid amin thành sản vật cấp thấp làm chượp bị thối Cách phòng chữa: + Cần xử lý nguyên liệu cho tốt, tránh nước mưa vào + Dụng cụ chế biến phải sẽ, không để chượp nơi ẩm thấp, bẩn thỉu + Cần áp dụng kỹ thuật chế biến, đồng thời cần nắm vững tượng cá đòi muối muối đủ kịp thời + Có thể trộn với chượp khác đem nấu + Chượp bị nước mưa nhiểu vào múc riêng phần cho muối vào, tăng cường phơi nắng náo đảo 5.7.4 Nước mắm thối Hiện tượng' Nước mắm thối lên bọt nhỏ nước bị đục, cá màu nâu xám đến xanh xông lên mùi hôi thối Nguyên nhân' + Chượp chưa chín phân giải đến sản vật trung gian, dễ bị đóng von keo tụ mà ta đem kéo rút + Do nước mắm lọc không + Do nước hâm bị nhạt muối hay q nóng tạo nhiệt độ mơi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển + Do bể thùng lọc dụng cụ chứa khơng có lẫn chượp sống + Do nước mắm bị nước mưa hay nước lã đổ vào Cách phòng chữa: + Cần tránh nguyên nhân + Cách chữa dùng nhiệt độ làm bay mùi hôi thối 5.8 Bảo quản Bảo quản' Nhờ muối hàm lượng đạm cao tạo áp suất thẩm thấu lớn ức chế hoạt động vi sinh vật Hàm lượng đạm cao, thời gian bảo quản dài từ hàng năm đến hàng chục năm hương vị dần Dụng cụ chứa phải vệ sinh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NHỊ Kết luận Công nghệ sinh học nuớc ta phát triển, tiếp thu thành tựu công nghệ sinh học giới Do việc sâu tìm hiểu enzyme protease, nguồn thu nhận protease từ vi sinh vật nói chung chủng nấm mốc Asp Oryzae ứng dụng mang lại nhiệm vụ cấp thiết từ làm tiền đề để tìm enzyme nâng cao hoạt lực chúng góp phần đua kinh tế Việt Nam hội nhập với kinh tế giới Kiến nghị Với khả kì diệu mà enzyme mang lại cho nguời, mong muốn thời gian tới nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu để tìm nhiều loại enzyme mới, có tính đặt hiệu độ tinh cao, tận dụng lợi ích mà vi sinh vật mang lại để thay cho loại enzyme đuợc lấy từ động vật, thực vật nhằm thiết lập sản xuất sinh thái bền vững, hòa hợp với thiên nhiên, bảo vệ lồi đơng vật, giảm nhiễm mơi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Thị Diệu Bích (2007), Chế biển thức ăn từ đậu nành lạc, NXB Thanh Hóa [2] , Nguyễn Đức Luơng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia Hà Nội [3] Trần Thị Ngạch (2007), Công nghệ enzyme, Truờng đại học bách khoa Đà Nằng [4] , Luơng Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, NXB nông nghiệp Hà Nội [5] PGS TS Đặng Thị Thu (2004), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà i II TÀI LIỆU INTERNET [6] http://dethhttp://ỉdoc.vn/taỉ-lỉeu/san-xuat-enzyme-protease-tu-vi-sinh-vat.html [7] http://luanvan.net.vn/luan-van/nguon-thu-nhan-va-ung-dung-protease-47430/ [8] thuvỉen.violet, vn/present/show? entry_ỉd= 7748438 [9] http://www.scribd.com ... trình ni cấy sản xuất enzyme chua phải chế phẩm có độ tinh khiết cao protein chiếm 20 - 30% Với để tài: ? ?Nghiên cứu sản xuất protease từ chủng nấm mổc Aspergillus, oryzae ủng dụng sản xuất nước... đường, acid amin Nấm mốc Aspergillus oryzae tác nhân chủ yếu lên men sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc để sản xuất tương Nấm Aspergillus. .. cao sinh từ chất điện giải Phương pháp bảo quản có hiệu với nhiều nhóm vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn virut CHƯƠNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT PROTEASE TỪ CHỦNG NẤMMỐC ASPERGILLUS