Hoàn thiện kỹ thuật lai so sánh hệ gen aCGH trong chẩn đoán một số bất thường nhiễm sắc thể

TW jfcfc «s> «> *4: LỜI CÁM ON Vói lấm lỏng người học trò tắt ca kinh trọng vả biết ưn sâu sic em xin bây tó long cam ơn tới TS.BS Vi Thị Hà - Giang viên Bộ môn Y sinh học - Di truyền • Trường Dại học Y Hã Nội đà tận lính giúp dữ, hướng dẳn tạo diêu kiên tót nhát cho em quã uinh hoc tập vã nghiên cứu dê hốn thành khóa luận Em xin gui lời cam ơn tói cac thầy, cỏ Bớ mơn Y sinh học Di truyền Trường Đại học Y Hả Nội dà giúp đỡ chi bao tịn tinh; cảc bác sỳ va anh chi nội trú Trung tâm tư vấn di truyền Bệnh viộn Dại học Y Ha Nội đà tạo điêu kiện thuận lợi cho em thu thập số liệu thời gian hoan thành khoa hiýn Em xin chán thành câm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đảo lạo Đai học, cac phòng ban chức nâng cua Trường Dại học Y Hà Nội đà giúp đừ, tao diều kiện thuân lợi cho em trmh nghiên cứu học tộp đê có thê hồn thành khóa ln Va ci cung, em xin danh nhùng lời ycu thương, cam ơn đến gia dính, bạn bé ln bẽn khích lệ động viên, ung hộ đê em suốt thời gian thục hiên khóa luận nảy Há Nội 26 thang năm 2021 Sinh Mèn Dinh Thị MỊ Linh LỜI C.XXI ĐOAN Tôi Đinh Tliị Mỳ Linh, sinh viên Y6 chuyên ngành Bác sỳ đa khoa, xin cam đoan khóa luận hỗn tồn lõi thực Cac sổ liệu vả két qua nghiên cưu hỗn tồn trung thục vã khách quan, chưa ũmg đưực cõng bó bát cư công trinh nghiên cữu não khác Hà Nội ngày 26 thang nẳm 2021 Siu 11V ten Dinh Th M Linh -w ã* CN ôG CH VIẫT TÁT aCGH array Comparative Genomic Hybridization BAC Bacterial Artificial Chromosome BTBS Bất thường bấm sinh cDNA complementary DN’A CNP Copy Nunixn Polymorphism CNV Copy Number Variant DNA Deoxyribonucleic Acid FISH Fluorescence In Sim Hybridization HI Haploinsufficient MFISH Multicolor FISH NST Mu cm sac the MLPA Multiplex Ligation - dependent Prcbe Amplification PTTT Phát triên tàm thần PTVĐ Phái uièn vụn dộng QF-PCR Quantitive Fluorescence Polnnetase Chain Reaction SKY Spectral karyotyping UPD Uniparental disomy vưs Variants ofuncertain significance -w •* CN «G MỤC LỤC DẠT VÁN DÉ _ CHƯƠNG I TÔNG QUAN 1.1 Bầt thường bàm sinh 1.1.1 Định nghía 1.12 Nguyên nhãn gây bết thường bỉm sinh 1.13 Dich lẻbấi thươngbám sình — 1.1.4 Một sổ bắt thưởng băm sinh / 1.2 Nhiềm sác thê bất thường nhiêm sác thê _ 1.2.1 Đinh nghía 1.22 Bắt thường nhi vin sắc thê liên quan đền bầt thưởng bầm sinh 1.3 Chi đinh xét nghiêm phát Hộn bất thưởng NST— 10 1.4 Các kỳ thuật phai bát thương NST II 1.4.1 Kỹ thuật lịp kâryotypê I 1.4 Kỳ thuật lai huỳnh quang tọj chỏ 12 1.43 Ky thuụt định lương huỳnh quang PCR 15 1.4.4 Kỷ thuụt MLPA 16 1.5 Kỳ thuật airay CGH ~ 18 1.5.1 Nguyên lý va quy trinh kỷ thuùt 19 1.52 Phân loại array CGH 21 1.53 Mô ta kết - 23 1.5.4 ƠII nhược 2.1.1 Tiêu chuàn chựnbênli nhãn 29 2.12 Cờ màu 20 2.2 Thời man nghiên cửu 29 2.3 Đia diêm nghiên cứu 29 2.4 Phương pháp nưhiên cữu 29 2.5 Phương pháp liến hành 29 2.5.1 Phưcnia nhản lien hanh ■>0 2.52 Các chi tiéu nglnen cứu 44 2.53 Xư lý sô lieu 44 2.5 Đao đức nghiên cứu: 44 2.6 Mò hĩnh nghiên cứu 45 lí-CTNG KÉT AI Ã XV.HIFX rửtĩ 4Á 3.1 KÍt qua rách chiết DNA vá kiêm tra chẩi hiợng DNA tách chiết 46 3-2 Ket qua bước kiểm dịuh sau phàn ứng phân doạn DNA bảng enzyme gắn huỳnh quang, lài DNA mỉu - chung 47 3.3 Hiên thi mòt số kêt cua kí thuật aCOH 51 Đặc diem làm sàng dổi tirợng nghiên cím 52 3.5 Plan lích kết qua bất thưỏng nhi cm sac the Chương BÀN LVẠN ••I 4.1 Lý giai lý chọn kỷ thuỳt aCGH phân tích bầl thường nhiem sac the •••Ml • ••*•••••••••••••!•••• >ltll IMIIMMIIIIIIillKHMiMI ••••••••••• ' Quy trinh kỳ thuật lai so sanh hộ gen (aCGHỊ 59 4.3 Tỵ lộ phải hiộn bấi thường NSTbầng kỳ Ihuýt aCGH ÓI KÉTLUẠN _ _ 64 KIẾN NGHI 65 TÀI LIỆU THAM KHAO TWM*M«K> *4: DANH MỤC BẢNG Bang I I So sánh độ bao phu gcn độ phân giai cua mội sỗ kỳ thuật phát bàt thường NST.— ~ 23 Bang 2.1 Thành phần Digestion Master Mix 35 Bang 22 Chuàn bị Label Master Mk 37 Bang 23 Thé rich mau vả lơng the tích hồn hợp máu đanh đẩu 39 Bang 2.4 Bang đánh giá San lượng thu đưực va Hoai linh dịc ỉuõu cua lửng loai huỳnh quang sau đanh dâu vả tinh 40 Bang 2.5 Thánh phần Hybridization Master Mix 41 Bang 2.6 Ngưởng QC đánh giá tín hiộu lai 42 Bang 3.1 Kct qua nồng độ vả dộ tinh DNA cua 24 màu máu 46 Bang 32 KÌi qua đo nống độ vả dộ tinh DNA cua 24 màu dịch ối 46 Bang 3.3 Dành giá chất lượng gắn huỳnh quang 48 Bang Đánh giâ chẨi lượng tin hiệu lai mầu màu 50 Bang 3.5 Đánh giá chất lượng tin lũệu lai mầu ói 50 Bang 3.6 Đặc diem làm sàng cua đói lượng sau sinh 52 Báng 3.7 Đàc diem lảm sàng cùa đoi lượng trước sinh 52 Bang 3.8.Ty lệ bẩt thường KST dược phát bảng kỳ tbuật aCGH 54 Bang 3.9 Phân loại cácCNV troogmìu máu 55 Bang 3.10 Phân loại cac CNV mầu ôi 55 Bang 3.11 Ty lộ CNV cá mỉu nghiên cửu 56 Bang 4.1 Ưu nhược diêm cũa kí thuật aCGH so với tnột 80 kf thuật phát hiội ihng NST khac • ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ' DANH Mực HÌNH HŨÚ1 1.1 Ti lệ nguyên nhân Uĩ vong ỡtre sơ sinh lại Việt Nam Hĩnh 12 Ti lỹ cãc nguyên nhãn lu vong ờtrc sau so sinh Việt Nam ỗ Hĩnh 13 Ti lộ nguyên nhãn lư vong ơtre dirới tuòi lại Việt Nam Hình 1.4 Cấu trúc nhiêm sác thề Hĩnh 1.5 Sơ dô quy trinh thus hièn FISH •• •• • ••• ••••• •••••••••••■ ••••••• 13 Hĩnh -ó Biêu thi kết qua cua kỳ thuãi QF-PCR lổ Hình 1.7 Các bước tiền hanh kỳ thuật MLPA 18 Hĩnh 1.8 So đồ thê cảc bư ■> I DẠT VÁN DÊ Bẩt Ihường nhiẻm sảo thỏ (NST) rối loạn cấu tribe hoậc số lượng cua mộ! hay nhi cu NST có thê xay NST thương hay NST giới tinh ca hai Nhiêu bắt thường NST dê lại hậu qua nặng nè sây (hai ihai lưu hay lư vong sư sinh gây bệnh lý di truyền, đạc biệt nguyên nhàn gảy bill thương bàm sinh (BTBS) [1] Tuy nhiên có nhùng bat thướng NST không biêu triệu chứng làm sáng lai tniycn cho thè hộ sau NST bắt thường dó Vỉi co biéu kiêu hinh hệ sau Đa sỗ cãc BTBS hiộn đẻu chưa có phương phap điều tri đặc hiệu mare* lại hiệu qua cao Do đo việc phát triền phương pháp thảm dó chân đcỂn trước sinh hay chân đôn BTBS có liên quan đèn rỗi loạn vật chất di truyền tri én vọng dang tich cực dầu nr nghiên cửu phát tri en nhẩm giam thiếu ti lõ màc bệnh, điều tri sơm tư vẩn hịn nhốn gia đinh tìiêu qua luưi ché II lệ bênh di truyền cho 111C sau Theo Tỏ chức Y te Thê giói, ước tinh có khống 6% tre em sinh với BTBS trẽn tồn giới mịi nám dần tới hãng trảm nghìn ca tư vong liên quan [2] Tại Việt Nam theo thông tin từ Tông cục Dãn số - Ke hoạch hỏa gia đinh, mỏi năm cõ khoáng him 40000 tré bi di tật bàm sinh, chiếm 1.5 2% Sũ tri sink số tri tứ vong bất thường bãm sinh khoang lum 1700 tre ($] Các bất thướng bãtn rinh nguyên nhài quan tiọug dàn đốn tứ vong tré sơ sinh tre nhô bệnh mơn rinh vả tàn tật; có nhùng lác dộng đáng kê tói moi cá nhân, gia dinh, he thống châm sốc sức khoe vả tồn xà hội Xíợĩ sổ nguyên nhản di truyền cua BTBS câc biến thè sổ lưựng ban (CNV) xác dinh bảng phương pháp lai sơ sánh hệ geu (aCGH) Giá trị sàng lục cua aCGII xél nghiệm đầu tay tre em với nhiều BTBS đà 59 thưởng dược phât hiên boi aCGH (nhu test đẩu tay) không dưực phải bới kr thuật karyotype tseu chuãn [62] Mộ! nghiên cứu tiến hanh Trẽn 4406 thai phụ chần đoán trước sinh nâm 2012 Wapncr vả cộng đà đưa kết quâ: nong màu có karyotype binh thường, aCGH phát 6% roi loạn bill thướng cẩu trúc NST (mất toặc lập do;m) [63] Tương lự nghiên cứu Kan cụng nâni 2014 có ket qua lù aCÍỈH táng kha phát bat thường NST kbóng cân bàng thêm 6% $0 vói lâm karyotype 3.2% mảu phát CNV bàng aCGH khồng dược phát hi en bâng kf thuật di truyền tế hào thủng thường [64], Từ nghiên cưu dã cỏ aCGIi mang lại ưu diêm vượt trội VC độ phân giãi, cai thiện tỳ lệ phát hiộnbắt thường NST so VỚI phương pháp hi, accessed: 11/23/2020 37 Cirigliano V Voglino G Ordohez E et al (2009) R4»id prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR results of years of clinical experience Prenaỉ Diagn 29< 1) 40 49 38 Schouten J.p, McElgunn CJ Waaijer R et aL (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation­ dependent probe amplification Nucleic Acids Res 30: 12) e57 39 de Boer s and White s J (2017) Genotyping Multiallelic Copy Number Variation with Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLP A) Genotyping, springer New York New York NY 147-153 40 Schotrten J '’an Vught p and Galjaard R.-J (2019) Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (NÍLPA) ÍOT Prenatal Diagnosis of Common Aneupỉoidies Prenatal Diagnosis Sponger New York New York NY 161 -170 41 Bejjani B.A and Shaffer L.G (2006) Application of Array-Based Comparative Genomic Hybridization to Clinical Diagnostics J Mol DiagnJMD, 8(5) 528-533 42 Bqjani B.A Saleki R Ballif B C- et al (2005) Use of targeted array­ based CGH for tire clinical diagnosis of chromosomal imbalance: Is less more? Am J Med Genet A 134 A(3) 259 267 43 Coe BP Lockwood WAV Chari R et al (2009) Comparative Genomic Hybridization on BAC Arrays Microarray Analysis of the Physical Genome Humana Press Totowa NJ 19 44 Davies JJ., Wilson I.M, and Lam W.L (2005) Array CGH technologies and their applications to cancer genomes Chromosome Res 1X3), 237-248 45 Costa J.L., Meijer G Ylsira B., et al (2008) Array Comparative Genomic Hybridization Copy Numbei Profit US’: A New Tool for Translational Research in Solid Malignancies Semin Radial Oncol 18*2) 98-104 46 Ylstra B., van den IJssel p., Carvalho B.r et al (2006) BAC to the future! or oligonucleotides: a perspective for micro array comparative genomic hybridization (array CGH) Nucleic Acids Res 34(2) 445 450 47 Pinkel D and Albertson D.G (2005) Array comparative genomic hybridization and its applications in cancer Nat Genet 37(S6) SI 1-S17 48 Carvalho B Ouwerkerk E Meijer GA et al (20l 60(1) 35 42 69 Di Gregono E Riberi E Belhgni E.F., er al (2017) Copy number vanants analysis in a cohort of isolated and syndromic developmental delayintellectual disability reveals novel genomic disorders, position effects and candidate disease genes Clin Genet 92(4) 415 422 ... kha me Việt Nam Mục tiêu: hoán thiện kỳ thuật lai so sánh hộ gen phàn tich bẩt thường nhiêm sác thè mõ ta số bẩt thường NST phát kỳ thuật lai 50 sánh hộ gen lỉắi tuưng phượng pháp nghiên cứu:... thtựií lai so sánh hệ gen (aCGHi ĩrong phàn lích biỉĩ thướng NST .Võ tã mvt sổ bứi thường NSĨ phai hiịn đirợc bồng kỳ thuột lai Sữ sánh h? ?gen (aCGHh TWM*M«K> «“ *4: CHƯƠNG I TỎNC quan 1.1 Bất thướng... đoạn nhanh dả NSTsố 15 51 Hĩnh 33 Hình anh thèmNST sổ 13 51 *4: HOÀN TIIIẸN KỲ THUẬT I.Al so SÁNH Hf GKN aCCrll TRONG CHAN ĐỐN MỘT SĨ BÁ I THƯỜNG NHIỀM SÁC THÈ TÓM TẲT Hiên kỳ thuật di truyền