De cuong luan van TN thien Nhan

Do bệnh chưa có thuốc đặc trị nên việc thử nghiệm một số kháng thể giúp cải thiện sức đề kháng của tôm sú là một trong những biện pháp giúp ngăn ngừa sự phát sinh dịch bệnh và có thể thự[r]

MỤC LỤC Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình nuôi thủy sản 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Ở việt Nam 2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm 2.3 Sơ lược bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm 2.3.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh đốm trắng 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý: 2.3.3 Phân bố bệnh và loài cảm nhiễm .8 2.3.4 Phương thức lan truyền và khả bùng phát bệnh 2.3.5 Phương pháp chẩn đoán .9 2.3.6 Phòng bệnh 2.4 Sơ lược bệnh phát sáng trên tôm .10 2.5 Các chế miễn dịch giáp xác .11 2.6 Sơ lược sản phẩm AA-NutriTMfocus 12 Phần 3: 13 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .13 3.1 Vật liệu nghiên cứu 13 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 13 3.1.3 Hóa chất .13 3.2 Phương pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Chuẩn bị vi khuẩn Vibrio 14 3.2.2 Chuẩn bị nguồn WSSV 14 3.2.3 Nguồn kháng thể .15 3.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 15 3.3 Phương pháp chạy PCR (Theo OIE, 2006) 18 3.4 Phương pháp phân tích mô bệnh học .23 3.5 Phương pháp xử lý số liệu .26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Nuôi trồng thủy sản Việt Nam nói chung và Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng phát triển ngày càng nhanh, đã và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn đất nước Nó không mang lại nguồn kim ngạch xuất to lớn cho quốc gia mà còn góp phần đảm bảo an ninh lương thực, xóa đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho người lao động Bên cạnh cá tra, cá basa thì tôm sú là mặt hàng chủ lực đem nguồn ngoại tệ cho đất nước Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất Thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2010, sản lượng xuất tôm nước ước đạt 240.000 tấn, với giá trị đạt khoảng 2,08 tỷ USD đó tổng sản lượng tôm sú gần 333.000 tấn, giá trị xuất tôm sú ước đạt 1,45 tỷ USD (http://agribank.com.vn) Do lợi nhuận từ tôm mang lại nên người dân không ngừng mở rộng vùng nuôi, chuyển đổi từ hình thức nuôi quãng canh truyền thống sang nuôi bán thâm canh và thâm canh Bênh cạnh suất cao thì dich bệnh bùng phát và trở nên phức tạp Theo báo cáo Cục Thú y, đến cuối tháng 5-2011, nước đã thả nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng (TTCT) trên 558.000 ha; đó, các tỉnh ĐBSCL thả nuôi trên 547.000 Diện tích thiệt hại tính đến ngày 2/6/2011 tỉnh khu vực ĐBSCL đã lên đến gần 53.000 ha, chiếm gần 10% diện tích thả nuôi và 98% diện tích thiệt hại nước Sóc Trăng là tỉnh có diện tích thiệt hại lớn với trên 19.000 ha, Bạc Liêu có diện tích thiệt hại gần 8.600 ha, Cà Mau và Trà Vinh tỉnh thiệt hại gần 6.600 Theo Tổng cục Thủy sản, tỷ lệ tôm bệnh chết nhiều thuộc vùng nuôi giáp biển Đông với 75,3%, vùng biển Tây thiệt hại 11% và đối tượng nuôi thiệt hại lớn là tôm sú với 60,4%, còn TTCT thiệt hại 19,5% (http://cucktbvnlts.gov.vn/) Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh chết trên diện rộng từ năm 1993 đến đã gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế cho người nuôi tôm Các chương trình nghiên cứu liên quan đến việc xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi ĐBSCL cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận xuất bệnh đốm trắng White spot syndrome virus (WSSV) (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2003 ) Do bệnh chưa có thuốc đặc trị nên việc thử nghiệm số kháng thể giúp cải thiện sức đề kháng tôm sú là biện pháp giúp ngăn ngừa phát sinh dịch bệnh và có thể thực thông qua các quá trình cho ăn Vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng sản phẩm AA-NUTRI TM Focus lên khả đề kháng bệnh đốm trắng ( White spot desease) và bệnh phát sáng (Vibrio) tôm sú ( Penaeus monodon )” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Tìm hiểu ảnh hưởng sản phẩm AA-NUTRITM FOCUS lên khả đề kháng bệnh đốm trắng và bệnh phát sáng tôm sú làm sở khoa học cho việc ứng dụng sản phẩm này vào thực tiễn 1.3 Nội dung nghiên cứu - Xác định ảnh hưởng sản phẩm AA-NUTRITM FOCUS lên khả đề kháng bệnh đốm trắng tôm sú bột và tôm thịt - Xác định ảnh hưởng sản phẩm AA-NUTRITM FOCUS lên khả đề kháng bệnh phát sáng tôm sú bột và tôm thịt 1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 2-5/2012 Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại Học Cần Thơ Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình nuôi thủy sản 2.1.1 Trên giới Nghề nuôi trồng thủy sản có lịch sử phát triển lâu đời Nhưng nhìn chung, nó thực rõ nét năm gần đây Tổng sản lượng thủy sản tăng nhanh (13% giai đoạn 1985-1995) đạt 116,1 triệu năm 1995 và sau 11 năm tăng lên 144 triệu năm 2006 Sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng nhanh, bình quân 7,6%/năm, với 24,6 triệu năm 1995 (21,2% tổng sản lượng thủy sản trên toàn giới) và 50 triệu vào năm 2006 chiếm 34,7% (Lê Xuân Sinh, 2010) Thực tế cho thấy, năm gần đây nghề nuôi tôm ven biển đã là động lực phát triển kinh tế số quốc gia Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Philippines, Việt Nam và Ecuador (Nam Mỹ) (Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2008) Trên giới nay, nghề nuôi trồng thủy sản ngày càng đóng vai trò quan trọng nghiệp phát triển kinh tế xã hội các quốc gia Năm 1975, sản lượng tôm nuôi trên giới là 50.000 lên 200.000 năm 1985, đó khoảng 70% sản lượng tôm đến từ các quốc gia Châu Á Năm 1988, sản lượng tôm nuôi trên giới đạt 450.000 tấn.Từ năm 1995, nghề nuôi tôm trên giới bắt đầu tăng chậm lại dịch bệnh vius xảy trên toàn cầu Tuy nhiên , sản lượng tăng nhiều công nghệ áp dụng, sản lượng tôm toàn cầu năm 1996 đạt 900.000 (FAO, 1999 trích dẫn từ Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004) Đến năm 2000, tổng sản lượng tôm nuôi trên giới đã đạt đến 45,71 triệu ( tăng 6,3% so với năm 1999), năm 2001, đạt 48,42 triệu (FAO, 2001 trích dẫn Lê Xuân Sinh, 2003) Sản lượng nuôi trồng thủy sản giới (bao gồm thực vật thủy sinh) năm 2002 đạt 51,4 triệu tấn, trị giá 60 tỉ USD tăng 6,1 % sản lượng so với năm 2000 Trong đó sản lượng nuôi trồng thủy sản chủ yếu từ các quốc gia Châu Á chiếm 91,2 % tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản giới Trung Quốc là quốc gia có sản lượng nuôi trồng thủy sản lớn chiếm 71,2 % năm 2002 (FAO, 2006)( trích dẫn Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008) 2.1.2 Ở việt Nam Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260km suốt từ Bắc vào Nam là tiềm to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000ha năm 1985 lên đến 295.000 năm 1998 với 30 tỉnh có nuôi tôm sú (Bộ thủy sản 1999) Năm 1999 tổng diện tích nuôi tôm sú miền Bắc là 39.429 ha, miền Trung là 12.530 ha, miền Nam là 238.279 (http://agriviet.com) Tình hình phát triển thủy sản Việt Nam trải qua nhiều giai đoạn, ngày càng phát triển sau năm Diện tích nuôi trồng thuỷ sản tăng đặn theo năm suốt từ 1981 tới nay, từ 230 nghìn năm 1981 lên 384,6 nghìn năm 1986 Năm 1981, tổng sản lượng thuỷ sản đạt 596.356 (trong đó khai thác đạt 416.356 tấn, nuôi trồng đạt 180.000 tấn), giá trị kim ngạch xuất đạt 11,2 triệu USD Năm 1986, tổng sản lượng đạt 840.906 (khai thác đạt 598.040 tấn, nuôi trồng đạt 242.866 tấn), kim ngạch xuất thuỷ sản 100 triệu USD Năm 1991, diện tích nuôi trồng thuỷ sản đạt 520.000 ha, sản lượng đạt 335.910 Đến năm 1996 diện tích nuôi trồng thuỷ sản là 585.000ha, sản lượng nuôi trồng đạt 411.000 Năm 2000, diện tích nuôi là 652.000ha, sản lượng đạt 723.110 thì đến năm 2003, tổng sản lượng thuỷ sản đã đạt 2.536.361 (khai thác 1.426.223 tấn, sản lượng nuôi 1.110.138 tấn), giá trị kim ngạch xuất đạt 2.240 triệu USD (Thái Thanh Dương, 2005)( trích dẫn Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008) Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 năm 2000, đến 2005 là 959.900 ha, nuôi tôm công nghiệp và bán công nghiệp 36.559 (Tạp chí Thủy sản, 2006) Diện tích nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ ĐBSCL chủ yếu tập trung các tỉnh: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Kiên Giang, Bến Tre Đến năm 2008, tỉnh Cà Mau diện tích nuôi đạt 248.957 ha, Bạc Liêu 125.529 ha, Kiên Giang 90.253 ha, Sóc Trăng 47.918 ha, Bến Tre 35.692 ha, Trà Vinh 56.424 (Bảng 2.2) Bảng 2.2: Diện tích nuôi thủy sản nước mặn, lợ vùng ĐBSCL (đơn vị tính ha) Tỉnh 2004 2005 2006 2007 2008 Long An 5.158 6.135 6.175 6.225 6.281 Tiền Giang 6.430 6.717 6.662 6.767 6.242 Bến Tre 36.955 37.366 35.398 35.858 35.692 Trà Vinh 23.277 27.722 38.209 44.044 56.424 Sóc Trăng 32.842 55.349 48.088 49.526 47.918 Bạc Liêu 115.616 116.791upload.123doc.net.095119.802 125.509 Cà Mau 248.174 248.406 251.856 248.088 248.957 Kiên Giang 69.321 82.936 81.613 84.490 90.253 22 69 27 37 45 Toàn vùng 537.795 581.491 586.123 595.577 617.341 Hậu Giang (Nguồn: Sở thủy sản, Sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008) Ở ĐBSCL tôm sú chiếm tỷ trọng lớn các đối tượng nuôi nước mặn, lợ Năm 2008, diện tích nuôi tôm sú vùng ĐBSCL đạt 583.290 ha, chiếm 94,48% tổng diện tích nuôi nước mặn, lợ Trong đó, diện tích nuôi chủ yếu tập trung Cà Mau với 264.522 45% diện tích nuôi tôm vùng Trong năm 2009, tổng diện tích nuôi tôm sú vùng ĐBSCL là 639.803 2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm Ngay từ năm đầu thập niên 90 cùng với phát triển nghề nuôi tôm công nghiệp "dịch bệnh" tôm Việt Nam bắt đầu xuất Theo thống kê Bộ Thủy sản (1995) từ năm 1993 – 1995 dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc làm thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5225 trị giá khoảng 294 tỷ đồng Đến dịch bệnh tồn và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng Thiệt hại lớn là đồng sông Cửu Long Tôm dễ mắc bệnh và thường bị chết vào khoảng 1.5 đến tháng tuổi (http://www.vietlinh.vn/library/aquaculture_doctor/sh99.htm) Theo kế hoạch Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT), năm 2010, các tỉnh ĐBSCL thả nuôi 550.600 tôm sú, giảm gần 16.000ha so với năm 2009, hệ thống tiêu thoát nước thải chưa đáp ứng nhu cầu và chưa ngăn chặn dịch bệnh Ngay từ đầu vụ tôm sú 2010, nắng hạn kéo dài và xâm nhập mặn đã làm thiệt hại nhiều diện tích nuôi tôm sú vùng ĐBSCL Tại tỉnh Kiên Giang tháng đầu năm 2010 đã thiệt hại trên 10.000 tôm nuôi trên đất lúa các huyện thuộc vùng U Minh Thượng, xâm nhập mặn lấn sâu vào nội đồng, nhiều nông dân phải thu hoạch sớm để bù vào chi phí bỏ đầu vụ Tình trạng tôm chết đột ngột Sóc Trăng diễn nhanh, diện tích thiệt hại tăng cách nhanh chóng Không là mô hình nuôi quảng canh cải tiến, lần này đến lượt các diện tích nuôi công nghiệp và bán công nghiệp với kỹ thuật nuôi tiên tiến bị thiệt hại nặng Theo Hiệp hội Tôm Mỹ Thanh, diện tích thiệt hại chủ yếu ao tôm 80 ngày tuổi trở lại.Bảy tháng đầu năm 2010 tỉnh Sóc Trăng đã trên 5.000 ha, tập trung chủ yếu huyện Vĩnh Châu, Trần Đề Các kết xét nghiệm mẫu chưa xác định tác nhân gây bệnh” Theo ông Khởi, diện tích thiệt hại tới đây có thể lên đến 18-20% diện tích nuôi không dừng lại mức trên 11% Theo các chuyên gia Viện trưởng Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, tác nhân gây bệnh tôm chết có thể ký sinh trùng và vi khuẩn công phá vỡ gan tôm Còn theo người nuôi tôm khu vực Trần Đề, dịch bệnh tôm sú có thể lây lan từ nguồn nước xả trực tiếp môi trường ao nuôi tôm thẻ chân trắng bị thiệt hại (Nguồn: Sở NN&PTNT tỉnh Sóc Trăng) Theo Vụ Nuôi trồng Thủy sản (Tổng cục Thủy sản), tính từ đầu năm đến nước có 81.782 nuôi tôm bị thiệt hại, 294% so cùng kỳ năm 2010, đó tôm sú là 78.849 và tôm thẻ chân trắng (TTCT) là 2.933 Tỉnh Sóc Trăng bị thiệt hại nặng nề nhất, chủ yếu trên vùng nuôi thâm canh và bán thâm canh với 28.477 ha, cao cùng kỳ 21.233 ha, chiếm 67% diện tích thả nuôi Tiếp đến Bạc Liêu bị thiệt hại hai vụ là 16.500 Đáng nói, nhiều chủ trang trại dù đã xử lý ao, thả lại tôm giống bị thiệt hại dịch bệnh tái diễn 2.3 Sơ lược bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm 2.3.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh đốm trắng Bệnh đốm trắng virut có tên gọi White spot syndrome virus (WSSV) gây WSSV có dạng hình trứng, có đuôi phụ đầu, acid nucleic là DNA sợi xoắn kép, dạng vòng, không có thể ẩn, có thể vùi và gen: 305.107bp (Trung Quốc), 292.967bp (Thái Lan), 307.287bp (Đài Loan) (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Vi-rút có ít lớp protein với trọng lượng phân tử từ 15- 28 kilodalton Vỏ bao có đường kính khoảng 120-150 nm và chiều dài 270-290 nm với lớp protein VP28 và VP19, nucleocapsid có đường kính 65-70 nm, chiều dài 300-350 nm với lớp VP26, VP24, VP15 (Vlak et al., 2002) Theo báo cáo hội nghị Quốc tế phân loại vi rút lần thứ 12 (ICTV) tổ chức Paris, WSSV thuộc giống Whispovirus, họ Nimaviridae, loài White spot syndrome, có kích thước khác tuỳ theo các nghiên cứu khác (Bảng 2.4) Bảng 2.4: Kích thước vi rút gây bệnh đốm trắng Thái Lan, Nhật Bản, Đài Loan Kích thước thể vi rút SEMBV (Thái Lan) Kích thước cấu trúc vỏ vi rút 121 x 276 nm 89 x 201 nm WSBV (Đài Loan) 70 – 150 x 350 – 380 nm 58 – 67 x 330 - 350 RV-PJ (Nhật Bản) 83 x 275 nm 54 x 216 nm (Nguồn: Đỗ Thị Hòa, 2004) Hình 2.1 Vi-rút nhuộm âm huyết tương cuả tôm sú nhiễm bệnh WSSV, số thể vi-rút có đuôi (ảnh quan sát kính hiển vi điện tử, vạch kẻ a = 240, b = 150, c = 100 nm) (Graindorge và Flegel, 1999)( trích dẫn Bùi Quang Tề, 2006) Theo OIE (Office International Epizooties) (2009) Virus có thể sống 30 ngày 30°C nước biển điều kiện phòng thí nghiệm và ao nuôi ít 3-4 ngày 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý: Tôm bị bệnh đốm trắng thường có dấu hiệu tiêu thụ thức ăn giảm sút rõ rang, vá biệt có trường hợp tăng cường độ bắt mồi bình thường, sau vài ngày có tượng bỏ ăn Tôm bệnh dạt vào bờ, lờ đờ, tôm yếu tầng mặt với các dấu hiệu đặc trưng là xuất các đốm trắng tròn lớp vỏ kitin đường kính 0,5 – mm, đặc biệt các đốm trắng tập trung giáp đầu ngực Tôm bệnh có chuyển sang màu đỏ Hiện tượng chết có thể xảy sau đó, tỷ lệ chết cao có thể lên tới 100% vòng 3-10 ngày (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Khi tôm bị bệnh đốm trắng, mô số quan mang, dạu dày, biểu mô vỏ kitin, quan tạo máu… có biến đổi đặc thù Những tế bào bị nhiễm virus thường nhân phình to, đó chứa thể vùi, hình cầu, hình trưng bắt màu tím hồng Heamatoxylin (mẫu mô học có nhuộm Heamatoxylin và Eosin) Khi bệnh nặng, các thể vùi thường chiếm hết thể tích nhân tế bào phình to (Đỗ Thị Hoà và ctv, 2004) Ngoài không phải lúc nào trên thể tôm xuất đốm trắng là WSSV gây ra, tôm có thể có biểu đốm trắng trên thể bị nhiễm vi khuẩn rối loạn chuyển hóa canxi, hàm lượng kiềm cao (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) 2.3.3 Phân bố bệnh và loài cảm nhiễm Bệnh đốm trắng lần đầu tiên thông báo Đài Loan –Trung Quốc và Trung Quốc lục địa năm 1991-992, Nhật vào 1993 từ tôm nhập Trung Quốc Sau đó phát thấy bệnh các nơi khác châu Á như: Ấn Độ, Indonesia, Hàn Quốc, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam Ngoài các nước châu Á đã nêu trên, bệnh đốm trắng đã thông báo Mỹ và châu Mỹ La tinh Như năm 1999, bệnh đã phát ít nước thuộc địa châu Mỹ là Columbua, Ecuado, Guatemala, Honduras, Mexico, Nicaragua Panama, Peru và Mỹ (FAO, 2005) Bệnh đốm trắng có số lượng vật chủ khá lớn Từ xuất có: (i) 18 loài tôm he nuôi và hoang dã bị nhiễm WSSV (Fennero- penaeus chinensis, F indicus, F merguiensis, Litopenaeus setiferus, L stylirostris, Marsupenaeus japonicus, M ensis, Penaeus monodon, P penicillatus, Parapenaeopsis stylifera, Solenocera indica, Trachypenaeus cur- virostris ) (Wongteerasupaya et al., 1996; Durand et al., 1997; Lu et al., 1997; Chou et al , 1998, Lightner et al., 1998; Park et al., 1998; (ii) có loài tôm mang bị nhiễm WSSV (Alpheus sp, Callianassa sp, Exopala-emon orientalis ) (Hameed et al., 2000; Shi et al., 2000; Pramod-Kiran et al., 2002); (iii) loài tôm hùm nhiễm WSSV (Panulirus homarus, P longipes, P ornatus ) (Chang et al 1998; Rajen-dran et al 1999); (iv) loài tôm nước nhiễm WSSV (Astacus astacus, A Leptodactylus,Cherax destructor ) (Wang et al 1998; Corbel et al 2001; Jiravanichpaisal et al 2001; Edgerton 2004; Jirava nichpaisal et al 2004) (trích dẫn Bonilla et al (2008)) Số lượng các loài cua bị nhiễm loài virut này là lớn, khoảng 38 loài như: Atergatis integerrimus, Calappa philarigus, Callinectes lophos, Cancer pagurus, Carcinus maenas, Charybdis annulata (Lo et al 1996; Kanchanaphum et al 1998; Kou et al 1998; Hameed et al 2003 trích dẫn Bonilla et al (2008) ( Theo Cao Chí Thuận, 2009) Bệnh phát nhiều động vật giáp xác tự nhiên các loài tôm he, tôm nước ngọt, cua, tôm hùm, chân chèo và ấu trùng, côn trùng Động lực hầu hết với các loài tôm có giá trị kinh tế (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) 2.3.4 Phương thức lan truyền và khả bùng phát bệnh Bệnh xảy giai đoạn cuối hậu ấu trùng,tôm chưa trưởng thành và trưởng thành Những nghiên cứu đặc điểm sinh học virus đốm trắng cho thấy, virus này có thể sống tự môi trường nước thời gian ngắn, 3-4 ngày, tồn lâu sinh vật trung gian là các loài giáp xác hoang dã (tôm, cua, còng, ghẹ, chân chèo) Đây là đường lây lan chính virus này, các nghiên cứu chứng tỏ virus đốm trắng lây nhiễm theo hai trục ngang và dọc ngoài lây nhiễm từ bệnh sang khỏe, từ sinh vật mang mầm bệnh sang tôm nuôi là đặc trưng lây nhiễm virus này (Đỗ Thị Hòa và ctv , 2004) Bệnh đốm trắng không có khả lây truyền qua đường thẳng đứng vì các noãn bào (trứng) phát chúng nhiễm virus đốm trắng thì chúng không thành thục Nhưng quá trình đẻ trứng tôm mẹ có thể thải các virút đốm trắng từ buồng trứng chúng, đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virút từ giai đoạn sớm ((BùiQuang Tề, 2006) (Trích dẫn Cao Chí Thuận, 2009) Sự bùng phát bệnh đốm trắng tôm nuôi phụ thuộc nhiều yếu tố vào khí hậu thời tiết và môi trường ao nuôi Những nhân tố có thể gây sốc cho tôm nuôi như: Mật độ nuôi cao, các số môi trường như nhiệt độ, độ mặn, N-NH3 nước ao có biến động lớn vượt ngoài ngưỡng sinh thái thích hợp tôm, có thể tạo điều kiện cho bùng phát bệnh đốm trắng (Đỗ Thị Hòa và ctv , 2004) Theo OIE (2009) nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả bùng phát bệnh, với nhiệt độ trung bình khoảng 30 C 2.3.5 Phương pháp chẩn đoán Theo tài liệu FAO Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu Á thì các phương pháp chẩn đoán bệnh đốm trắng gồm có: - Dự chuẩn: Quan sát chung (mức độ 1), làm tiêu ép nhanh (mức độ II), mô bệnh học(mức độ III) - Kiểm khẳng định: Việc chuẩn đoán trọn vẹn có thể hoàn thành kỹ thuật PCR (bước đơn Nested PCR), Kỹ thuật lai chỗ, phân tích vết kiểu Western kính hiển vi điện tử 2.3.6 Phòng bệnh Theo Bùi Quang Tề, 2006 thì có thể phòng bệnh các biện pháp sau: - Chọn tôm bố mẹ có chất lượng tốt (chiều dài từ 26-30cm, độ sâu 60-120m) không nhiễm bệnh đốm trắng - Không vận chuyển tôm giống mật độ cao - Thức ăn tươi sống không hư thối và dùng nhiệt nấu chin - Hằng tháng cho tôm ăn Vitamin C từ 1-2 đợt từ 2-3g/1kg thức ăn bản, đợt cho tôm ăn hai tuần liên tục - Nguồn nước cấp cho ao phải lắng lọc và khử trùng - Vớt tôm chết khỏi ao - Ngăn chặn không cho tôm và giáp xác khác vào ao - Nước ao nuôi bị nhiễm bệnh phải xử lý Chlorua vôi với nồng độ cao (30-50g/m3) 2.4 Sơ lược bệnh phát sáng trên tôm Bệnh số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp đã công bố là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng số đối tương nuôi thủy sản (Austin & Austin 1993) Bên cạnh Vibrio anguillarum và V ordalii xem là tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc nhóm Vibrio spp., số loài thuộc nhóm này công bố là tác nhân gây bệnh số đối tượng nuôi thủy sản quan trọng (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006) Vibrio spp là dạng vi khuẩn bắt màu gram âm, hình chữ v dấu phẩy, di động, hiếu khí kỵ khí không bắt buộc Có thể tồn nhiều độ mặn khác phát triển tốt là 20 – 40‰ (Đỗ thị Hòa et al., 2004) Có loài phát triển độ muối – 8‰ V parahaemolitycus và V alginolyticus và ppt là: V fluvialis, V furinissii và V anguillarum (Cowan et al., 1987) Vibrio spp là nhóm vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, nhiệt độ phát triển thích hợp là 25 – 30C Dạng màu sắc khuẩn lạc phát triển trên môi trường đặc trưng TCBS chia làm nhóm: nhóm có khả lên men đường succrose có khuẩn lạc màu vàng và nhóm không có khả lên men đường succrose có khuẩn lạc màu xanh lá cây (trích dẫn Châu Ngọc Sơn, 2008) Một số loài vi khuẩn Vibrio có khả phát sáng Vibrio harveyi, V splendida, V orientalis, V fischeri, Vibrio vulnificus Trong đó, V harveyi đã xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng trai ngọc Pinctada maxima, Tôm sú Penaeus monodon và tôm he Nhật Penaeus japonicus (Pass et al 1987; Lavilla-Pitogo et al., 1990; Karunasagar et al., 1994; Liu et al., 1996; Leano et al 1998) Bệnh nhóm vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế nuôi tôm công nghiệp Philipines, Ấn Độ và Indonesia Các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi có liên quan đến bệnh vi khuẩn chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây Ở Việt Nam, dạng nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy trại sản xuất ương tôm giống Khi vi khuẩn phát sáng thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh phát sáng bóng tối Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể tôm trưởng thành (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006) Tôm nhiễm bệnh bị yếu và màu trắng đục Tôm chết thường trên mặt nước hay ven mé Tôm nhiễm bệnh nặng phát sáng bóng tối, bỏ ăn, lắng xuống đáy bể thành thảm sáng xanh đáy, chết hàng loạt và nhanh đến 80-100% Quan sát hay máu tôm chết cho thấy có nhiều vi khuẩn di động Gan tụy là nơi bị hoại nặng làm chức tiêu hóa và gây chết.Trong ương giống, bệnh thường xuất môi trường nước giàu dinh dưỡng, nhiều chất hữu cơ, xác bã.Trong sản xuất giống, mầm bệnh lây truyền chủ yếu từ ruột tôm bố mẹ cho ấu trùng giai đoạn sinh sản (Trần Ngọc Hải và ctv, 2000) 2.5 Các chế miễn dịch giáp xác Hệ miễn dịch giáp xác không có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá xương và các động vật có xương sống bậc cao khác và đó dựa vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên các đáp ứng bảo vệ thể Cũng giống các động vật có xương sống là đáp ứng bảo vệ thể thực các tế bào máu chuyên hóa Từ máu giáp xác phân lập ba loại tế bào: bạch cầu không hạt (hyaline) có khả thực bào, không có khả phong tỏa và hoạt hóa hệ thống phenol oxydase (ProPO); bạch cầu bán hạt (semigranular) có khả phong tỏa, độc tế bào, hoạt hóa ProPO, thực bào còn hạn chế; bạch cầu có hạt (granular) có khả độc tố tế bào, hoạt hóa ProPO, không có khả thực bào, khả phong tỏa thì hạn chế (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007) Ở giáp xác, ngoài các chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên tương tự động vật có xương sống chúng còn có số chế đáp ứng miễn dịch khá đặc thù là khả hình thành khối u, khả phong bế, khả sản sinh các protein kháng khuẩn, phản ứng đông máu, hệ thống Prophenoloxydase Cơ chế hệ thống Prophenoloxydase, vi sinh vật hay vật chất lạ vượt qua hàng rào vật lý vào thể giáp xác thì chúng gặp phải bạch cầu, tượng thực bào xảy làm kích hoạt enzym protease có huyết Khi men này hoạt hóa thì ngoài việc sản sinh quinine melamin nhiều và tập trung trên vi sinh vật hay vật là và bao lấy chúng không tạo tượng melanin hóa trên vỏ giáp xác mà còn tập hợp các thực bào lại bao quanh vật thể lạ thúc đẩy tượng thực bào diễn nhanh (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007) Các peptit kháng khuẩn (antimicrobial peptides-AMPs) Peptit kháng khuẩn là dạng đáp ứng miễn dịch tự nhiên phổ biến thực vật, động vật có và không có xương sống Chúng có khả kháng khuẩn, kháng độc tố và có vài trường hợp có khả kháng nấm Peptit kháng khuẩn là phân tử nhỏ từ 15-75 amino axit có khả tương tác trực tiếp với bề mặt tế bào vi sinh vật tạo nên lổ thủng và làm chết tế bào vi sinh vật Cấu trúc đặc biệt chúng làm cho vi sinh vật khó có thể phát triển khả kháng trường hợp kháng thuốc kháng sinh và khác cấu tạo màng tế bào vi sinh vật và màng tế bào vật chủ nên các peptit kháng khuẩn có thể tiêu diệt mầm bệnh mà không làm hại đến vật chủ (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007) Hệ miễn dịch các loài giáp xác còn mức độ tiến hóa thấp, chủ yếu dựa trên các đáp ứng miễn dịch tự nhiên Trong đó vai trò các bạch cầu và hệ thống ProPO là quan trọng 2.6 Sơ lược sản phẩm AA-NutriTMfocus Đây là sản phẩm công ty Tomboy sản xuất có chứa kháng thể IgY Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Tôm sú giai đoạn Post-Lsarvae(PL15-35) và tôm thịt (5-10g) Nguồn tôm sú mua từ các trại giống Cần Thơ và kiểm tra bệnh đốm trắng phương pháp PCR trước mua - Nguồn WSSV phân lập từ mẫu tôm sú bệnh đốm trắng và trữ tủ đông – 800C Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ - Nguồn Vibrio phân lập và nuôi tăng sinh Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị - Nguồn nước ót mua Bạc Liêu và vận chuyển Trường Đại học Cần Thơ Nước ót pha với nguồn nước máy để đạt độ mặn 10‰ Nước này xử lý Chlorine nồng độ 30 ppm, sau đó sục khí liên tục ngày để sử dụng cho thí nghiệm - Bể composite, xô nhựa loại 35l, máy thổi khí,đá bọt, vợt, máy đo pH, máy đo oxy, máy đo độ mặn,, test Chlorine, nhiệt kế, - Dụng cụ sử dụng cho phân tích PCR (Theo OIE, 2006):  Kẹp, kéo, que nghiền  Ống eppendorf 0,2 ml, 0,5ml, 1,5ml  Giá để ống eppendorf  Đầu cone 10 µl, 200 µl, 1000 µl  Ống đong 100ml, chai chịu nhiệt 250 ml, cốc 250 ml  Máy ủ nhiệt, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy luân nhiệt  Cân điện tử, lò vi sóng, điện di, máy chụp hình gel - Dụng cụ sử dụng cho phân tích mô học: Bộ tiểu phẩu, kính hiển vi, máy cắt lát mỏng, máy xử lý mẫu, máy đúc khối, lame, lamelle, khuôn đúc, khay nhuộm, bút chì… 3.1.3 Hóa chất - Chlorine, cồn 70o Hóa chất dùng phương pháp mô học: Cồn tuyệt đối, Davidson’s, paraffin, sáp ong, keo entellan, nước cất, xylen, thuốc nhuộm Heamatoxylin và Eosin - Hóa chất dùng phương pháp PCR (Theo OIE, 2006)  Lysis buffer, Ethanol 100%, TE buffer (hoặc nước cất lần tiệt trùng)  PCR buffer ( 10 mM Tris- HCl, pH 8,8, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 01% Triton X- 100), MgCl2 dNTP mix (A, T, G, C), taq ADN polymerase, mồi  Agarose, dung dịch TAE 0,5 X, Ethidium bromide, Loading Dye 6X 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Chuẩn bị vi khuẩn Vibrio Chủng vi khuẩn Vibrio phục hồi trên môi trường TSA+.Sau 24 quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc và nhuộm gram kiểm tra tính chủng vi khuẩn phân lập Sau đó nuôi tăng sinh môi trường Alkaline để chuẩn bị cho thí nghiệm Vi khuẩn nuôi tăng sinh 200 mL môi trường Alkaline và ủ qua đêm 30-32C trên máy lắc 180 r.p.m Sau đó vi khuẩn cho vào ống falcon tiệt trùng (50 mL) và ly tâm 5.000 r.p.m 10 phút 4C để thu phần viên Vi khuẩn rửa qua nước muối sinh lý (0,9% NaCl) lần và đếm mật độ vi khuẩn máy so màu quang phổ bước sóng 610 nm (OD=1 ± 0.1 ≈ 109 CFU/mL) sau đó dung dịch vi khuẩn pha loãng 10 lần (1 mL dung dịch vi khuẩn 109 CFU/mL + mL nước muối sinh lý) để các mật độ 108, 107, 106, 105, 104, 103 CFU/mL Mật độ vi khuẩn xác định cách nhỏ 20 μL (lặp lại lần) dung dịch vi khuẩn (đã điều chỉnh mật độ máy so màu quang phổ) lên đĩa TSA+ và ủ 30-32C đếm số khuẩn lạc trung bình sau 24 3.2.2 Chuẩn bị nguồn WSSV Mẫu tôm nhiễm bệnh đốm trắng phát phương pháp PCR, tiến hành ly trích vi-rút, sau đó nuôi tăng sinh WSSV này trên tôm khỏe để có nguồn vi-rút sử dụng cho các thí nghiệm sau Thí nghiệm nuôi tăng sinh WSSV (Escobedo-Bonilla et al., 2005)  Dịch WSSV pha loãng nồng độ (1:10) PBS (pH=7,4)  Tiêm vào gốc chân bò thứ tôm với 100l dung dịch WSSV-PBS Đối chứng tiêm 100 l PBS  Thu mẫu sau 48h  Mẫu trữ lạnh -800C  Kiểm tra cảm nhiễm WSSV thông qua PCR Quy trình ly trích WSSV từ tôm nhiễm bệnh đốm trắng  Loại bỏ khối gan tụy, ruột và phần đầu ngực thái nhỏ, pha vào PBS với nồng độ 10-1  Ly tâm 3000 x g 40C 20 phút  Ly tâm phần dịch phía trên 13000 x g 40C 20 phút  Lọc qua giấy lọc 0,45 m  Trữ dịch vi-rút -800C 3.2.3 Nguồn kháng thể Sử dụng kháng thể IgY có sản phẩm AA-NUTRITM FOCUS công ty Tomboy cung cấp với nồng độ khác nhau:  Tomboy1/AANF SP[0ppm],crumb (< 1.1mm)  Tomboy1/AANF SP[1000ppm],crumb (< 1.1mm)  Tomboy1/AANF SP[2000ppm],crumb (< 1.1mm)  Tomboy1/AANF SP[3000ppm],crumb (< 1.1mm) 3.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm - Thời gian bố trí thí nghiệm vòng tuần - Thí nghiệm bố trí với nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại lần theo thứ tự: 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 5a, 5b, 5c, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 8c Bảng 3.1:Sử dụng thức ăn có bổ sung AA-NutriTMFocus trên tôm post Tôm postlarvae (P15-P35): bố trí thí nghiệm 500 post/bể ←1st ←PL15 Tuần 2nd→ 3rd→ 4th→ Tuần Tuần Tuần IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY:2000ppm IgY:2000ppm DC NT IgY (-) IgY (-) IgY:2000ppm ← cảm nhiễm ngâm (LD 50 ) Vibrio IgY:3000ppm + 6ppm bath ← cảm nhiễm ngâm (LD 50 ) IgY:1000ppm IgY:3000ppm IgY:2000ppm IgY:2000ppm IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY:2000ppm IgY:2000ppm IgY (-) IgY (-) Vibrio IgY:2000ppm ← cảm nhiễm ngâm (LD 50 ) Vibrio IgY (-) ← cảm nhiễm ngâm (LD 50 ) WSSV IgY:3000ppm + 6ppm bath ← cảm nhiễm ngâm (LD 50 ) WSSV IgY:2000ppm ← cảm nhiễm ngâm (LD 50 ) WSSV IgY (-) IgY:1000ppm IgY (-) IgY:3000ppm IgY:1000ppm IgY (-) Bảng 3.2:Sử dụng thức ăn có bổ sung AA-NutriTMFocus trên tôm thịt Tôm thịt (5g-10g): bố trí thí nghiệm 30con/bể ←1st ←PL15 Tuần 2nd→ 3rd→ 4th→ Tuần Tuần Tuần IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY:2000ppm IgY:2000ppm DC NT IgY (-) IgY (-) IgY:2000ppm IgY:2000ppm IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY (-) IgY:2000ppm IgY:2000ppm IgY:2000ppm ← cảm nhiễm tiêm (LD 50 ) Vibrio IgY:3000ppm + 6ppm bath ← cảm nhiễm tiêm (LD 50 ) Vibrio IgY:2000ppm ← cảm nhiễm tiêm (LD 50 ) Vibrio IgY (-) ← cảm nhiễm tiêm (LD 50 ) WSSV IgY:3000ppm + 6ppm bath ← cảm nhiễm tiêm (LD 50 ) WSSV IgY:2000ppm IgY:1000ppm IgY:3000ppm IgY:1000ppm IgY (-) IgY:3000ppm IgY:1000ppm ← cảm nhiễm tiêm (LD 50 ) WSSV IgY (-) IgY (-) - - IgY (-) IgY (-) Nghiệm thức đối chứng 1, 2: không gây cảm nhiễm Nghiệm thức 3,4, 5: gây cảm nhiễm với WSSV Nghiệm thức 6,7,8: gây cảm nhiễm với vibrio với mật độ 106(CFU/ml) Các nghiệm thức bố trí 24 bể, với mật độ 500con/20L Trước gây cảm nhiễm tuần bố trí mật độ 1500con/bể để đảm bảo đủ mật độ sau gây cảm nhiễm Vị trí các bể bố trí theo bảng 3.3 Bể 1a Bể 1b Bể 1c Bể 5a Bể 5b Bể 5c Bể 8a Bể 8b Bể 8c Bể 6a Bể 6b Bể 6c Bể 2a Bể 2b Bể 2c Bể 4a Bể 4b Bể 4c Bể 7a Bể 7b Bể 7c Bể 3a Bể Bể 3b 3c Chăm sóc - Cho ăn với liều lượng 0.5g/lần/bể Mỗi ngày cho ăn lần vào các giờ: 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 21h - Tuần 1-2 :  Nghiệm thức 1, 3, 5, 6, cho ăn thức ăn bổ sung IgY(-)  Nghiệm thức: 2,4,7 cho ăn thức ăn có bổ sung IgY:2000ppm - Tuần 3: Nghiệm thức:1, 5, cho ăn thức ăn bổ sung IgY(-)  Nghiệm thức 2, 4, cho ăn thức ăn bổ sung IgY:2000ppm  Nghiệm thức 3,6 cho ăn thức ăn bổ sung IgY:3000ppm + 6ppm bath - Tuần  Nghiệm thức 1, 5, cho ăn thức ăn không bổ sung IgY(-)  Nghiệm thức 2,4,6,8 cho ăn thức ăn có bổ sung IgY:1000ppm  Nghiệm thức 3,8 cho ăn thức ăn có bổ sung IgY:3000ppm - Bể sục khí nhẹ và thay nước 2ngày/lần quá trình thí nghiệm Trong quá trình thay nước có bổ sung Apack với liều lượng 0.06g/10L Các tiêu môi trường nước pH, nhiệt độ đo lần/ngày (8h và 14h) Thu mẫu: Tôm post Sau gây cảm nhiễm phải theo dõi ngày để thu mẫu tôm chết có dấu hiệu lờ đờ và ghi nhận số liệu điền vào bảng phụ luc 1.Số tôm thu chia làm hai phần: phần dùng để trữ xét nghiệm mẫu mô, phần còn lại trữ tủ -80 xét nghiệm PCR Ngày đầu tiên tuần thứ 5, tiến hành đếm số tôm còn sống và kết thúc thí nghiệm Tôm thịt Thu mẫu lần/tuần để rút máu và đếm số lượng tế bào máu Khi có dấu hiệu bệnh lý, thu mẫu để kiểm tra bệnh phương pháp PCR và phương pháp mô học Thu thập số liệu : Tỉ lệ cảm nhiễm WSSV (%) và Vibrio sp (%) Tỉ lệ sống (%) : xét nghiệm mẫu tôm chết mô học và PCR Nhiệt độ, pH, độ mặn 3.3 Phương pháp chạy PCR (Theo OIE, 2006) Qui trình ly trích (Lysis Buffer) - Cho phần nhỏ mang, chân bơi vào ống eppendorf 1,5ml Nghiền kĩ với 500 µl Lysis buffer - Ủ mẫu đã chuẩn bị 100 C 10 phút, sau đó ly tâm (13.000 vòng/phút) 10 phút - Để tuýp trên bàn cho nguội vài phút trước ly tâm 13.000 vòng/phút phút - Chuyển 100 µl phần phía trên sang ống eppendorf 1,5 ml có chứa 100 µl 100% ethanol - Cẩn thận đóng nắp tuýp và đảo tuýp nhẹ nhàng để trộn điều dung dịch - Loại bỏ dịch và làm khô ADN - Hòa tan phần viên với 200 µl TE Lưu ý: - Nếu mẫu tôm trữ cồn thì cần phải làm khô cồn trước ly trích mẫu - Nếu mẫu tôm trữ đông thì phải rã đông - Tôm post thì lấy nguyên - Cơ quan lấy mẫu: mang, chân bơi mang là tốt vì vius công mang Đo hàm lượng ADN máy so màu quang phổ: - Dùng pipet hút 495 µl TE buffer và µl dung dịch ADN vừa hòa tan cho vào ống eppendorf Đo hàm lượng AND máy so màu quang phổ bước sóng 260nm Vì bước sóng này AND hấp thụ tốt hơn.Đầu tiên đo mẫu TE buffer trước sau lần đo mẫu ADN ly trích Đọc kết trên máy và tính hàm lượng ADN theo công thức: [ADN]( µg/ml) = Giá trị đo 260 x 50 x độ pha loãng Bảng kết đo hàm lượng AND bước sóng 260 nm sau: Mẫu Giá trị đo 260nm [ADN](ng) 0.241 1205 0.398 1990 0.260 1300 0.236 1180 0.209 1045 Do hàm lượng ADN khuôn cần sử dụng là 200ng nên ta pha loãng với công thức sau để hàm lượng ADN khuôn là 200ng: C1V1= C2V2 Trong đó C1: Nồng độ ADN gốc V1: Thể tích dung dịch gốc C2: Nồng độ AND cần cho phản ứng PCR 200ng V2: Thể tích cần cho phản ứng PCR 50µl Sau có hàm lượng ADN khuôn ta tiến hành qui trình khếch đại Qui trình khếch đại: Thành phần hóa chất tham gia phản ứng: 50 µl/phản ứng Bước Hóa chất pha với trình tự sau: Hóa chất Nồng độ Thể tích(µl) Nước 33.6 PCR buffer 5X 1X 10 Bước Trình tự hóa chất pha với trình tự sau: Hóa chất Nồng độ Nước Thể tích (µl) 29.6 PCR buffer 5X 1X 10 MgCl2 (25 mM) 1.5 mM dNTP mix (10 mM) 200 µM Mồi 146 F2 (100 mM) µM 0.5 Mồi 146 R2 (100 mM) µM 0.5 Taq AND polymerase ( UI/l) UI 0.4 Sản phẩm PCR bước Điều kiện phản ứng: 94oC phút 55oC phút 72oC phút Sau đó: 94oC phút 55oC phút 72oC phút Lặp lại chu kỳ trên 39 lần 72oC phút cho kết thúc vòng cuối cùng Cách chuẩn bị phản ứng Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng PCR bước và bước thực dựa theo số liệu mẫu cần phân tích Mỗi lần chuẩn bị mẫu cần tính thêm đối chứng dương và đối chứng âm (thường sử dụng nước cất ) Bước Trộn hóa chất theo các thành phần bảng trên ( chú ý là phải cho các hóa chất vào đúng trình tự bảng thành phần hóa chất bước 1) Cho 49 µl hỗn hợp vào ống eppendorf 0,5 µl đã ghi tên Thêm µl AND li trích mẫu đối chứng vào phản ứng Thực phản ứng PCR với chu kỳ nhiệt nêu trên Bước Đối với sản phẩm PCR bước 2, tiến hành trộn các hóa chất bảng trên ( chú ý là phải cho các hóa chất vào đúng trình tự bảng thành phần hóa chất bước ) Cho 45 µl hỗn hợp vào ống eppendorf 0,5 µl đã ghi tên Thêm µl sản phẩm PCR bước vào cho phản ứng, Thực phản ứng PCR với chu kỳ nhiệt nêu trên Điện di và đọc kết quả: Quá trình điện di thực với dung dịch TAE 0,5X và thạch chứa 1.5% agarose Chuẩn bị thạch: - Đun nóng dung dịch agarose lò vi sóng tan hoàn toàn Trong quá trình đung phải canh chừng khoảng 30 giây kiểm tra lần Sau đó làm nguội dung dịch agarose vòi nước chảy nhẹ để dung dịch nguội khoảng 50 – 60ºC cho Ethium Bromide vào và đổ agarose vào khay đã chuẩn bị trước.Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ khay đựng gel.Thường bề dày gel không dày quá 0.8cm - Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ lược gel và các keo dán hai bên khỏi khay đựng gel - Ethium Bromide chuẩn bị từ nguyên liệu tinh 10mg/ml Pha loãng 10mg/ml nguyên liệu gốc 20000 lần Lưu ý: Sử dụng keo giấy để bịt khuôn gel lại và dán nên để dư ít băng keo để bọc khuôn và cần vuốt keo để đảm bảo thẳng và dính vào thành khuôn Điện di: - Cho gel vào bồn điện di Thêm dung dịch điện di cho vừa phủ gel - Dùng pipet hút 10 µl cho mẫu cần phân tích trộn với giọt 6X Loading Dye vào giếng một.Dung dịch nạp mẫu chứa hai loại phẩm màu Bromphenol blue có màu xanh đậm và Xylene Cyanol có màu xanh nhạt - Dùng thang AND cho gel, gel dùng từ 5–10µl tùy kích cỡ giếng Sử dụng thang ADN để xác định khối lượng phân tử sản phẩm - Khi đã cho mẫu cần phân tích vào các giếng còn lại, nối bồn điện di với nguồn điện để chạy Sử dụng dòng điện từ 80 – 150 V (không vượt quá 150 V) để chạy gel - Ngừng điện di màu xanh đậm di chuyển khoảng 2/3 gel Đặc gel lên bàn UV để đọc kết Lưu ý: - Khi để khuôn gel vào bồn điện di thì phải đảm bảo cho dung dịch - điện di ngập khuôn gel và cần phải mở lớp băng keo đầu để giúp cho AND tiếp xúc với cực đầu - Dung dịch nạp mẫu giúp AND chìm xuống đáy và không trộn lẫn với dung dịch điện di Dung dịch có màu xanh vàng để có thể xác định AND chạy tới đâu và dễ dàng đọc kết Đọc kết quả: Kết ghi nhận máy đọc gel Villber Lourmat (Pháp) Căn vào thang ADN 1kb plus ladder để xác định trọng lượng phân tử Sản phẩm khuếch đại dặc hiệu WSSV bước là 1441bp và bước hai là 941bp 3.4 Phương pháp phân tích mô bệnh học Cố định mẫu (theo phương pháp Lightner, 1996) Chuẩn bị dung dịch cố định Davidson AFA Thành phần Ethyl alcohol Formaline Acid acetic Nước cất Thể tích 330 ml 200 ml 115 ml 335 ml - Nếu trường hợp vận chuyển không đảm bảo mẫu tôm còn sống đến phòng thí nghiệm, cần cố định mẫu vật trường dung dịch Davidson với tỷ lệ 10:1 (10 thể tích dung dịch, thể tích mô tôm) - Đối với mẫu tôm ấu trùng chiều dài nhỏ 20mm, ngâm trực tiếp mẫu vào dung dịch cố định - Đối với mẫu tôm ấu trùng chiều dài lớn 20mm, dùng kim nhọn tạo đường rạch nông nhỏ đủ để nâng nhẹ lớp vỏ kitin đường lưng, khớp nối kitin giáp đầu ngực và đốt bụng đầu tiên để dung dịch thấm nhanh vào khối gan tụy - Đối với mẫu tôm lớn hơn, tiêm dung dịch cố định trực tiếp (thể tích 10% trọng lượng thể tôm) vào các quan: khối gan tụy, vùng trước khối gan tụy, vùng bụng trước và vùng bụng sau Cắt lớp kitin kéo giải phẩu dọc theo chiều dài thân từ đốt bụng thứ đến lớp kitin giáp đầu ngực Sau đó ngâm mẫu tôm vào dung dịch cố định với tỷ lệ 10:1 - Ghi mã số kí hiệu cho mẫu Rữa mẫu Sau 24h thay bỏ dung dịch Davidson, rữa nước cất, trữ mẫu dung dịch cồn 70% Cắt tỉa và định hướng mẫu - Đối với tôm nhỏ 3cm cần phải cắt bỏ phần phụ và chia tôm làm đôi Sau đó lấy phân tôm cho vào cassette xử lý mẫu Đối với tôm lớn 3cm cần phải cắt tôm thành phần nhỏ các vị trí khác Sau đó lấy phần nhỏ tôm cho vào khuôn nhựa xử lý mẫu Xử lý mẫu Khử nước: Mục đích khử nước là loại nước hoàn toàn mô mà không làm mô và các tế bào bị teo vị trí các thành phần cấu tạo mô không bị thay đổi Vì mẫu chuyển sang các lọ cồn có nồng độ tăng dần từ 80%, 95%, 100% để quá trình xử lý nước không xảy quá nhanh Làm mẫu: Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khử nước thì cồn loại khỏi mẫu Nếu không loại bỏ hết cồn, phần mô đó bị co rút lại, khối mẫu đúc paraffin không đồng nhất, tạo nên lỗ trên lát cắt Do đó, mẫu mô ngấm dung môi trung gian (xylen) có thể hòa tan cồn và paraffin Ngấm paraffin: Paraffin là chất để bảo đảm cho tế bào giữ nguyên hình dạng cắt Vì sau làm trong, mẫu mô ngấm paraffin nóng chảy (57-60oC) cách chuyển mẫu qua nhiều lọ paraffin Quy trình xử lý mẫu mô cài đặt máy xử lý mô tự động theo các bước: STT Hóa chất sử dụng Kích cỡ khối mô/ Thời gian >5mm <5mm <3mm <1mm Cồn 80% 30 phút 20 phút 10 phút phút Cồn 95% 60 phút 20 phút 10 phút phút Cồn 95% 30 phút 30 phút 10 phút phút Cồn 100% 60 phút 40 phút 20 phút phút Cồn 100% 180 phút 40 phút 20 phút phút Cồn 100% 180 phút 40 phút 20 phút phút Cồn 100% 180 phút 60 phút 30 phút phút Xylen 30 phút 20 phút 20 phút phút Xylen 30 phút 30 phút 20 phút phút 10 Paraffin + xylen (7:3) 60 phút 60 phút 20 phút phút 11 Paraffin + sáp ong (1:1) 60 phút 60 phút 30 phút phút 12 Paraffin + sáp ong (7:3) 60 phút 60 phút 30 phút phút Sau hoàn thành các bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số và tiến hành quy trình xử lý Đúc khối Chuyển cassette chứa mẫu đã xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy trên máy đúc khối, để cassette paraffin khoảng 30 phút Mẫu mô đặt khung cố định inox và tiến hành đúc khối paraffin nóng chảy 65oC Đổ ít paraffin vào khuôn inox, gắp bỏ mẫu vào khuôn sau đó đặt mẫu ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn, đặt cassette có kí hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đổ paraffin vào khuôn inox, đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách khối paraffin khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu Cắt mẫu Chuẩn bị máy cắt: Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt Độ lệch lưỡi dao so với mặt cắt khối mẫu tạo thành góc 15-30 o Khối mẫu cắt thành lát cắt tay quay máy quay tròn, sau vòng quay có lát cắt hình thành Tiến hành cắt mẫu: Gắn mẫu vào máy cắt theo chiều ngang cassette cho khối mẫu ngang và thẳng đứng, sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt Bắt đầu lát cắt 12-16µm, sau đã cắt mặt khối mẫu và đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày lát cắt vạch 2µm và tiến hành cắt mẫu Dán mẫu lên lame - Chuẩn bị dung dịch dán mẫu Mayer albumin: lòng trắng trứng và glycerol với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, trộn sau đó lọc qua giấy lọc thô bông gòn - Cho giọt dung dịch Mayer albumin lên lame dùng tay xoa để tạo thành màng mỏng trên lame - Mẫu cắt thành băng dài, dùng dao kim mũi giáo trãi mẫu lên khay lớn đựng nước ấm (40-50oC) mẫu căng - Sau đã chọn đoạn mẫu đạt yêu cầu, dùng làm có dán dung dịch Mayer albumin vớt mẫu lên Cầm đầu lame, đầu cho vào cốc nước thủy tinh phía mẫu, sau đó từ từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu ngắn trên lame - Để cho mẫu khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên bàn sấy ủ nhiệt độ 37oC khoảng 12 sấy tủ sấy nhiệt độ 60 oC để loại bỏ paraffin sau đó tiến hành nhuộm mẫu Nhuộm mẫu Nhuộm mẫu dung dịch Haematoxylin và Eosin (H&E) máy tay theo quy trình sau: STT Hóa chất sử dụng Thời gian Xylen phút Xylen phút Xylen phút Cồn 100% phút Cồn 100% phút Cồn 70% phút Nước cất phút Haematoxylin phút Nước máy phút 10 1% acid alcohol 10 giây 11 Nước máy phút 12 Eosin phút 13 Cồn 95% phút 14 Cồn 100% phút 15 Cồn 100% phút 16 Xylen phút 17 Xylen phút Dán lamelle vào lame: Để bảo quản mẫu lâu cần dùng keo dán Enterlan để dán tiêu vĩnh viễn Nhỏ giọt keo dán lên vùng có miếng mô, đặt lamelle nghiên 45o và tiếp xúc với giọt keo, dùng kim mũi giáo hạ lamelle xuống từ từ để tránh bọt khí Để khô lame sau đó đọc kết Quan sát tiêu và đọc kết quả: Đầu tiên mẫu quan sát kính hiển vi độ phóng đại 4X để nhìn tổng quát tiêu bản, sau đó chuyển qua độ phóng đại lớn 10X, 40X và 100X 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học Thủy Sản Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản Cao Chí Thuận, 2009 Phát white spot syndrome virus (wssv) mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ (penaeus monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học Châu Ngọc Sơn, 2008 Nghiên cứu biến động quần thể vi sinh vật và chất lượng nước ao nuôi tôm sú (penaus monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007 Giáo trình Miễn dịch học động vật thủy sản Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006 Xác định vị trí phân loại và khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (penaeus monodon) Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Đại học Cần Thơ: 4252 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004.Giáo trình Bệnh học thủy sản Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, trường Đại học thủy sản Nha Trang FAO, 2005 Hướng dẫn chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội-2005 Http://agribank.com.vn/31/834/tin-tuc/thi-truong-nongnghiep/2011/01/3119/lan-dau tien-viet-nam-xuat-khau-tom-vuot-2-tyusd.aspx Http://thuysanvietnam.com.vn/index.php/news/details/index/1708.let, Tạp chí thủy sản Việt Nam 10 Http://www.oie.int 11 Lê Xuân Sinh, 2003 A Bio-economic Model ò a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Viet Nam Luận án tiến sỹ Kinh tế nông nghiệp- Đại Học Sydney, Australia 12 Lê Xuân Sinh,2010.Giáo trình kinh tế thủy sản.Nhà xuất Đại Học Cần Thơ 13 Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004 Kỹ thuật nuôi và sản xuất giống thủy sản nước lợ 28 14 Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2003 Ứng dụng kỹ thuật phân tử để phát bệnh nhiễm nuôi trồng thủy sản Trí thức Phú Yên 15 Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2008 Biến động mật độ vi khuẩn ao nuôi tôm sú ( penaus monodon) Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 16 Tài liệu thực tập Giáo trình Bệnh Học Thủy Sản, 2011.Bộ môn sinh học và bệnh Thủy Sản.Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 17 Trần Ngọc Hải, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa và Nguyễn Thanh Phương, 2000 Bài giảng bệnh giáp xác 18 Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008 phát triển qui trình mPCR (multiplex polymerase chain reaction) phát wssv(white spot syndrome virus), hpv (hepatopancreatic Parvovirus)và nội chuẩn β-actin trên tôm sú (penaeus monodon) 19 Trần Thị Phương Trang, 2009 Ứng dụng kỹ thuật PCR phát WSSV mẫu tôm sú (Penaeus monodon).Luận văn tốt nghiệp đại học 20 Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng bệnh virus trên động vật thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 21 Trần Việt Tiên, 2007 Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR chẩn đoán wssv (white spot syndrome virus) và gav (gill-associated virus) trên tôm sú (Penaeus monodon) Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học 22 Vlak, J.M., J.R Bonami, T.W Flegel, G.H Kou, D.V Lightner, C.F Lo, P.C Loh, and P.J Walker 2002 NIMAVIRIDAE A new virus family infecting aquatic invertebrates ICTV, Paris, 2002 29 KẾ HOẠCH THỰC HIỆN TT Nội dung công việc Viết và bảo vệ đề cương Bố trí thí nghiệm và thu mẫu Phân tích mẫu Xử lý số liệu và viết báo cáo Thời gian thực Tháng 02/2012 Tháng 03/2012 Tháng 04/2012 Tháng 05/2012 DỰ TOÁN KINH PHÍ Đơn vị: 1.000 đồng TT Nội dung Đơn vị 1.1 Nguyên vật liệu Tôm Thức ăn Hóa chất xử lý nước Hóa chất dùng phòng TN 1.2 Dụng cụ và máy móc Dụng cụ phân tích mẫu 1.3 Chi phí khác In ấn tài liệu/luận văn Tổng kinh phí Số lượng Đơn giá Thành tiền 2.000 500 100 1000 500 100 4200 Cần Thơ, ngày … tháng … năm 20… Chữ ký CBHD Chữ ký sinh viên PGS.TS Đặng Thị Hoàng Oanh Ngô Thiện Nhân 30