Nghiên cứu bệnh ký sinh trùng đường máu do ve truyền ở đàn bò nuôi tại ba vì – hà nội và thử nghiệm thuốc diệt ve TT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ HỒNG CHIÊN NGHIÊN CỨU BỆNH KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG MÁU DO VE TRUYỀN Ở ĐÀN BỊ NI TẠI BA VÌ – HÀ NỘI VÀ THỬ NGHIỆM THUỐC DIỆT VE Ngành: Bệnh lý học Chữa bệnh vật nuôi Mã số: 64 01 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2021 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Thọ GS.TS Betrand Losson Phản biện 1: PGS.TS Chu Đức Thắng Hội Thú y Phản biện 2: GS.TS Trƣơng Xuân Lam Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phản biện 3: TS Đồn Thị Thanh Hƣơng Viện Cơng nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi … ngày….tháng….năm 20… Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT Bệnh ký sinh trùng đường máu loài đơn bào Anaplasma spp., Theileria spp, Babesia spp coi bệnh ve truyền gây phổ biến làm giảm suất chăn nuôi gia súc toàn giới Anaplasmosis bệnh lây truyền từ động vật sang người ve Ixodes (Santos & Massard, 2014; Ismail & McBride, 2017) Theo Rogers & Shiels (1997) Anaplasmosis xảy bò, cừu Australia ve B microplus Rh sanguineus truyền bệnh Ở động vật nhai có năm lồi Anaplasma, bị đóng vai trò quan trọng nguồn lây nhiễm cho người ve truyền (Ismail & McBride, 2017; Hove & cs., 2018) Bên cạnh đơn bào Theileria spp ký sinh bị có lồi Theileria parva, Theileria anulata, Theileria mutans Theileria surgenti với biểu sốt cao gián đoạn, bỏ ăn, không nhai lại, niêm mạc mắt miệng nhợt nhạt, hồng đản, bị gầy yếu, suy kiệt (Phạm Sỹ Lăng, 2002) Ngồi ra, bị sau khỏi bệnh tiếp tục nguồn mang trùng, tiềm ẩn nguy phát tán mầm bệnh tự nhiên (Phạm Sỹ Lăng, 1980) Ở Việt Nam, số nghiên cứu tồn loài ký sinh trùng đường máu Babesia sp., Theileria sp, Anaplasma spp trâu, bò ve (Sivakumar, 2013; Altangenel Khukhuu & cs., 2013; Phùng Quang Trường & cs., 2008; Geurden & cs., 2008) Việt Nam phát 65 loài ve cứng ve mềm (Phan Trọng Cung & Đoàn Văn Thụ, 2001) Ve Boophilus microplus, Rhipicephalus sanguineus lồi ve tồn phổ biến bị (Trịnh Văn Thịnh, 1963; Nguyễn Văn Diên & Phan Lục, 2007) Như điều kiện khí hậu nóng ẩm, tồn nguồn bệnh ve phân bố rộng Việt Nam thuận lợi phát sinh truyền bệnh ký sinh trùng đường máu bò Tuy nhiên, nghiên cứu bò bệnh ký sinh trùng đường máu, phân loại sinh học phân tử phân tử hạn chế Xuất phát từ thực tế thực nghiên cứu bệnh ký sinh trùng đường máu ve truyền bị huyện Ba Vì – thành phố Hà Nội nhằm đánh giá tồn bệnh ký sinh trùng đường máu ve bị từ đưa khuyến cáo để khống chế bệnh, góp phần phát triển chăn ni bị bền vững 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU  Mục tiêu tổng quát Nhằm đánh giá nghiên cứu số đặc điểm ký sinh trùng đường máu ve truyền ve ký sinh đàn bò, cung cấp sở khoa học cho việc chẩn đốn, phịng trị bệnh bệnh ký sinh trùng đường máu ve ký sinh bị từ góp phần bảo vệ sức khỏe cho đàn bò  Mục tiêu cụ thể - Xác định lưu hành bệnh ký sinh trùng đường máu ve truyền: Anaplasma spp., Theileria spp., Babesia spp đàn bị - Định danh lồi ký sinh trùng đường máu kỹ thuật phân tử - Xác định lồi ve ký sinh, tình hình nhiễm ve đàn bò theo vùng, mùa vụ, lứa tuổi giống bò - Bước đầu nghiên cứu thuốc diệt ve ký sinh bò 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực bò sữa bò vàng từ tháng 11 năm 2015 đến 11 năm 2019 xã gồm xã Tản Lĩnh, Yên Bài, Vân Hòa, Tòng Bạt, Thụy An, Vật Lại, Thái Hòa, Phú Sơn, Phú Đông thuộc vùng địa lý miền núi, gị đồi, đồng huyện Ba Vì, Nội với nội dung nghiên cứu bệnh ký sinh trùng đường máu ve truyền, biện pháp phòng trị ve Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phịng thí nghiệm Ký sinh trùng, Phịng thí nghiệm Trọng điểm sinh học Phịng thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý- Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam; Phịng thí nghiệm Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Phịng thí nghiệm - Trung tâm nghiên cứu Bị đồng cỏ Ba Vì 1.4 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tử định danh hai loài ký sinh trùng đường máu Anaplasma marginale Anaplasma platys ký sinh bị Lần phát lồi Anaplasma platys ký sinh bò Việt Nam Nghiên cứu bước đầu xác định tác dụng diệt ve ký sinh bò hợp chất bán tổng hợp Pyrethroid 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN LUẬN ÁN 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu đề tài bổ sung thông tin bệnh ký sinh trùng đường máu ve truyền biện pháp diệt ve Kết nghiên cứu dùng làm tài liệu giảng dạy trường cao đẳng, đại học Nông nghiệp, tư liệu tham khảo cho nhà nghiên cứu lĩnh vực ký sinh trùng 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ, bệnh lý học bệnh ký sinh trùng đường máu bò biện pháp phòng trị ve, vận dụng vào việc chẩn đốn phòng chống ve ký sinh bệnh ký sinh trùng đường máu ve truyền cho bò thực tiễn sản xuất PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CƠ SỞ KHOA HỌC 2.1.1 Một số bệnh ký sinh trùng đƣờng máu ve truyền bò Bệnh ký sinh trùng đường máu ve truyền động vật đơn bào lê dạng trùng (Babesia sp), biên trùng (Anaplasma sp), theiler trùng (Theilera sp) kí sinh máu bò, trâu, bò sữa, ngựa Tùy vào đặc điểm, vị trí ký sinh, hình thái, cấu tạo khả gây bệnh khác (Phạm Sỹ Lăng, 2006) 2.1.2 Đặc điểm ve ký sinh bị Bộ ve bét thuộc lớp hình nhện (Arachnida), ngành chân đốt (Arthropoda) có đặc điểm: phần phụ miệng tách khỏi phần thân làm thành đầu giả Sự phân đốt thể yếu mờ hẳn Giai đoạn ấu trùng có đơi chân, thiếu trùng trưởng thành có đơi chân Cơ thể có rãnh thắt ngang chia làm phần: phần trước phần sau thân Phân ve (Ixodoidae): có đơi lỗ thở nằm sau hay gốc háng Lỗ thở liên hệ với thở ngắn Tấm miệng có hướng phía sau, thích hợp với kiểu chích hút Ve Ixodoidae chân đốt đa vật chủ Tất ve thuộc phân ký sinh, gồm có họ Ixoididae, Argasidae Nuttalliendae 2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU DO VE TRUYỀN VÀ VE CỨNG Ở BÒ TRÊN THẾ GIỚI, VIỆT NAM 2.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh ký sinh trùng đƣờng máu ve truyền giới Việt Nam 2.2.1.1 Nghiên cứu giới Bệnh lê dạng trùng ghi nhận sớm bị ni tự nhiên Mỹ vào năm 1868, dịch bệnh xảy bang Illinois Indiana gây tổn thất 15.000 bò sau nhập bò từ bang Texas Hai loài đơn bào phát Mỹ Babesia bigemina Babesia bovis Năm 1893, Kilborne lần đầu ghi nhận B bigemina ký sinh gây bệnh truyền lây loài ve Boophilus annulatus Bệnh lê dạng trùng coi bệnh dịch ngoại lai bò Mỹ Do thất bại toán ve nơi khác, ve lẫn lê dạng trùng lưu hành rộng rãi tiếp tục mối đe dọa cho gia súc Mỹ (Graham & cs., 1977) Năm 1930, Rees mô tả loài Babesia nhỏ Louisiana mà xác định B bovis Mahoney (1977) quan sát thấy B bigemina gây bệnh cho động vật Australia B bigemina Châu Phi có khả gây bệnh cao Theileria spp đơn bào ký sinh máu gây triệu chứng sốt, thiếu máu, niêm mạc mắt, mũi miệng nhợt nhạt, hoàng đản, sưng hạch lâm ba (Liu & cs., 2009) Bệnh phân bố khắp nơi giới gây thiệt hại lớn tới suất chăn nuôi (Zhang & Xu, 1997) Theo nghiên cứu Onuma & Kakuda (1998) bệnh Theileriosis đơn bào họ Theileria spp gây gồm loài Theileria parva, Theileria annulata, Theileria mutans Theileria velifera Trong đó, Theileria parva Theileria annulata gây bệnh với tỉ lệ chết cao bò có độc lực cao lồi cịn lại họ Theileria annulata phân bố rộng khắp Châu Âu, Trung Đông, Nga, Trung Quốc Châu Phi Fujisaki & cs (1994) cho biết Theileria sinensis loài độc lực thấp phân bố chủ yếu khu vực Châu Á Các loài Anaplasma thuộc họ Anaplasmataceae ký sinh trùng ve truyền động vật nhai lại, chó, động vật hoang dã người toàn giới (Dumler & cs., 2001; Battilani & cs., 2017) Theiler phát A margrinale năm 1910 A centrale năm 1911 Anaplasmosis bệnh Anaplasma spp gây động vật truyền sang người loài ve Ixodes (Kocan & cs., 2015; Ismail & McBride, 2017) Bảy loài Anaplasma biết đến tác nhân gây bệnh phổ biến nhất, Anaplasma bovis, A capra, A centrale, A marginale, A ovis, A phagocytophilum A platys (Li & cs., 2015; Battilani & cs., 2017) Bò nhà động vật tàng trữ đáng kể nhiều bệnh lây nhiễm động vật lây sang người ve truyền (Ismail & McBride, 2017; Hove & cs., 2018) Theo Magona & cs (2008), biểu lâm sàng Anaplasma marginale, Babesia bigemia Theileria parva bao gồm giảm cân, sốt (đo nhiệt độ trực tràng), thiếu máu, niêm mạc nhợt nhạt, hạch sưng to, tiêu chảy chảy nước mắt Mức độ biểu phụ thuộc vào giới tính, tuổi, mật độ ve thể 2.2.1.2 Nghiên cứu Việt Nam Ở Việt Nam bệnh ký sinh trùng đường máu Schein phát bị Trung từ năm 1908 Sau Houdemer tìm thấy bị bắc Năm 1982, tác giả Trịnh Văn Thịnh & Đỗ Dương Thái (1982) cho biết ký sinh trùng đường máu phân bố Bắc Bộ Trung Bộ Việt Nam với phân bố ve Boophilus microplus Từ năm 1958-1960 bệnh lê dạng trùng Babesia bệnh huyết bào từ trùng khác phát nửa số tỉnh miền Bắc Việt Nam phân bố bệnh trùng với phân bố ve Boophillus microplus Phạm Sỹ Lăng (1973, 1976) phát A marginale A buffele ký sinh hồng cầu bò, trâu Nghiên cứu xác định A margrinale, T annulata, T mutans, B bigeminum, B bovis ký sinh đàn bò với tỷ lệ nhiễm cao Bò nội Việt Nam vật mang trùng lây bệnh ký sinh trùng đường máu cho bị nhập nội Tại tỉnh phía Nam – Việt Nam, Hồ Thị Thuận & cs (1981) nghiên cứu ký sinh trùng bị cho biết có lồi A margrinale, A centrale, B bigeminum, B divergen, khơng phát thấy Theileria tỷ lệ nhiễm 30-60% Hạ Thúy Hạnh (1999) cho biết bệnh ký sinh trùng đường máu bò Việt Nam cho biết tỷ lệ lần lượt: Babesia spp 3,29%, Anaplasma sp 4,55%, tỷ lệ nhiễm Theileria spp 2,13% Tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đường máu khác theo mùa vụ, lứa tuổi, vùng sinh thái Vùng Đơng Nam Bộ có tỷ lệ nhiễm cao nhất, bị có tỷ lệ nhiễm huyết trùng bào tử cao lứa tuổi từ đến năm, tháng tháng bị có tỷ lệ nhiễm bệnh cao Bò bị bệnh lê dạng trùng có triệu chứng lâm sàng đặc trưng: thể cấp tính bệnh thể triệu chứng sốt cao liên miên, nước tiểu chuyển từ vàng thẫm, đỏ sau đen cà phê Niêm mạc vàng có chấm xuất huyết Phù hầu, má Con vật táo bón ỉa chảy Ở Việt Nam, bị lai F1, F2 nhiễm lê dạng trùng với tỷ lệ thấp thể mạn tính Trịnh Văn Thịnh (1963) cho rằng: bệnh biên trùng bò Việt Nam thường ghép với bênh lê dạng trùng Bệnh thường xảy sau tiêm phòng vacxin dịch tả cho bò bò mắc bệnh khác, có trường hợp bò mang bệnh biên trùng phát sức đề kháng bò giảm Nguyễn Hữu Ninh (1980) quan sát bò bị bệnh biên trùng thấy: bò gầy rạc, niêm mạc có hồng đản, máu lỗng, nhợt nhạt Trong xoang ngực bụng có tương dịch vàng Hạch lâm ba trước vai đùi sưng, mổ có tụ huyết thủy thũng Một số trường họp bò thể trạng thái mang trùng (Có ký sinh trùng máu, dấu hiệu lâm sàng) Những bị đóng vai trị tàng trữ truyền bá mầm bệnh tự nhiên Đặc điểm phân tử ký sinh trùng đường máu động vật Việt Nam nghiên cứu phương pháp hình thái học, huyết học, sinh học phân tử (Parola & cs., 2003; Geurden & cs., 2008; Liyanagunawardena & cs., 2016) Đối với Anaplasma spp sử dụng phương pháp ELISA cho thấy có 28 mẫu máu dương tính bị miền Bắc Việt Nam (Geurden & cs., 2008); nghiên cứu khác, Anaplasma spp nghi ngờ mẫu động vật thu thập miền Nam miền Trung Việt Nam (Parola & cs., 2003; Liyanagunawardena & cs., 2016) 2.2.2 Tình hình nghiên cứu ve cứng giới Việt Nam 2.2.2.1 Nghiên cứu giới Vai trò truyền bệnh ve số nhà khoa học phát từ 100 năm trước cơng ngun Cristoff nói qua mối quan hệ ve vật chủ Vào kỷ 18, Smith phát bệnh sốt “Texas fever” ve bò Boophilus annulatus australis truyền qua đốt hút máu (Dolman, 1969) Đến kỷ thứ XX Silmon, Stiles (1901), Neummann (1907, 1908) có hệ thống phân loại chia họ ve: Liên họ (Superfamilia); ve Ixodoidae gồm hai họ: Ve mềm Argasidae có giống Argas Ornithodoros Ve cứng Ixodidae gồm hai phân họ: Rhipicephalinae có giống Rhipicephalus, Haemaphysalis, Boophilus Dermacentor Ixodinae có giống Ixodes, Eschatocephalus, Aponomma, Amblyomma Hyalomma Từ năm 1911 – 1939 Năm 1952-1953, Feldman Muhsam phát hai lồi ve Rhipicephalus sanguineus ký sinh chó Rhipicephalus turaicus ký sinh vật chủ khác (Phan Trọng Cung & cs., 2001) Ve B microplus ký sinh chủ yếu gia súc, ve có nguồn gốc từ Châu Á phân bố khắp châu lục Ve xuất miền Nam Trung nước Mỹ, Mexico, Brazil (Evans, 1992), phía Nam phía Đơng tỉnh Western Eastern Cape KwaZulu-Natal, Nam Phi (Spickett & Fivaz, 1992), Australia (Angus, 1996) Thiệt hại ve gây ra, Sping Well (1991) có cơng trình nghiên cứu cho biết trung bình ve trưởng làm cho bò giảm tốc độ sinh trưởng tương đương với 450g/năm Nghiên cứu vùng nhiệt đới cho thấy tỷ lệ bò mắc Rhipicephalus (Boophilus)microplus vec tơ truyền bệnh virus, vi khuẩn bệnh đơn bào (Machado & cs., 2010) Babesia spp trải qua chu kỳ đầy đủ từ nhiễm vào ve đến tái nhiễm vào bị Babesia hút vào phải trải qua tất giai đoạn trứng, ấu trùng, thiếu trùng ve (Louis – Denis, 1975) Các loài ve chủ yếu truyền bệnh bò Boophilus sp.; Rhipicephalus sp., ngồi cịn có Dermacnetor andersoni truyền Anaplasma theo giới (Maas, 1986) Nghiên cứu biện pháp diệt ve, tác giả cho nấm endophytic sử dụng để kiểm soát phát triển ve bò Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Campos & cs., 2010) 2.2.2.2 Nghiên cứu Việt Nam Việt Nam nước có điều kiện khí hậu nhiệt độ nóng ẩm phù hợp cho loại côn trùng phát triển Trịnh Văn Thịnh (1963) cho biết Việt Nam có 10 lồi ve cứng ký sinh gia súc có loài phổ biến Boophilus microplus, Rhipicephalus sanguineus Theo Phan Trọng Cung (1977) ve loài động vật biến nhiệt, chịu ảnh hưởng lớn điều kiện môi trường cho biết ve bò tỉnh đồng sông Hồng phát triển mạnh từ tháng 2, đạt cao vào tháng Ve Boophilus microplus loài ve ký sinh chủ yếu bò vùng núi trung du đồng miền Bắc Việt Nam Ở bò miền Bắc Việt Nam gặp loài Rhipicephalus Koch 1844, đại diện loài Rhipicephalus sanguineus Latreille, 1806 loài Boophilus Crtice, 1894 đại diện loài B annulatus (Say, 1821; Phan Trọng Cung & cs., 1977) Phân bố ve cứng Việt Nam có giống có mặt tất miền là: Amblyomma, Aponoma, Boophilus, Haemaphisalis, Ixodidae, Rhipicephalus, với số lượng khác Có ba lồi ve đặc hữu Việt Nam Haemaphysalis, Hyalomma yeni Hyalomma dromdari, phổ biến hai lồi Boophilus Rh sanguineus (Phan Trọng Cung & cs., 2001) Nghiên cứu Đắc Lắk, tác giả Nguyễn Văn Diên & Phan Lục (2007) cho biết mùa khô, cường độ nhiễm ve trung bình/bị thấp tháng 12 bắt đầu tăng dần từ tháng cuối mùa khô Nguyễn Hữu Hưng & cs (2014) nghiên cứu An Giang xác định loài ve cứng B microplus, Rh sanguineus ký sinh bò xung quanh chuồng ni Ve có khả hút máu lớn vật chủ Ve Amblyomma hút 600-1200mg máu ve nhỏ Boophilus hút 160-600mg máu (Trịnh Văn Thịnh, 1980) Boophilus microplus ve vật chủ nên đồng cỏ gặp ve đẻ ấu trùng Trên chuồng xi măng đất thấy ve ấu trùng (Phan Trọng Cung, 1977) Bệnh ký sinh trùng đường máu có liên quan mật thiết với loài ve Miền Bắc nước ta, ve Boophilus spp phổ biến chiếm 95% tổng số loài ve (Nguyễn Hữu Ninh, 1980) Để diệt ve hóa dược sử dụng DDT, Dipterex (Trịnh Văn Thịnh, 1982), sử dụng Sumicidin (Phạm Sỹ Lăng, 1988) Phương pháp phát quang đồng cỏ để diệt ve chết đói có tác dụng diệt ve tốt Biện pháp cho ve chết đói cần luân phiên đồng cỏ không cho gia súc ăn đồng cỏ thời gian, ve Boophilus microplus khoảng tháng (Phan Trọng Cung, 1977) Diệt ve hiệu cần thực biện pháp phòng trừ tổng hợn diệt ve thể gia súc, chuồng ni ngồi thiên nhiên (Phạm Văn Kh & Phan Lục, 1996) 2.3 NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT BÁN TỔNG HỢP PYRETHROID DÙNG ĐỂ DIỆT VE Ve với vai trò ngoại ký sinh trùng hút máu truyền bệnh ký sinh trùng đường máu động vật Vì vậy, việc diệt trừ ve quan trọng nhằm hạn chế tác hại ve phòng chống bệnh ve truyền Hoạt chất Pyrethrin họ cúc thiên nhiên dùng làm thuốc diệt côn trùng nhiều năm, an toàn cho gia súc có tác dụng Pyrethroid tổng hợp bền trước ánh sáng, độc với lồi có vú, khơng tồn lâu mơi trường Có tác dụng kéo dài để diệt loài chân đốt da Pyrethroid dẫn xuất este cacboxylat (còn gọi Este Pyrethrum este Pyrethrin, có nguồn gốc tự nhiên từ hoa cúc Chrysanthemum cinerariaefolium C.troseum) chứa nhiều hoạt chất pyrethrin độc côn trùng Các hoạt chất Pyrethrin chiết xuất từ hoa, khơ rễ dung mơi, chúng có tác dụng gây chết tức thời côn trùng Trong dịch chiết Pyrethrin có sáu este hai axit cacboxylic với ba xyclopentenolon với tỷ lệ khác Hoa cúc có chứa hoạt chất hỗn hợp este có tính chất diệt trùng Pyrethrin I Pyrethrin II, có hàm lượng từ 0,2-1,2%; tỷ lệ pyrethrin I II 2/3 Ngồi cịn có Chrysanthin Chrysanthen Tuy nhiên việc sử dụng thực vật tươi để diệt ve gặp khó khăn liều lượng khó xác định Ngồi ra, Pyrethroid dễ phân giải tác động yếu tố môi trường men, ánh sáng mặt trời, hợp chất chuyển hóa độc không độc Trong thực tế điều trị, lượng Pyrethroid sử dụng khơng cao khơng trì thời gian dài, sử dụng thể động vật cách thuốc có tác dụng diệt ngoại ký sinh trùng bề mặt da mà không gây tồn dư ô nhiễm môi trường (Trần Quang Hùng, 1995) Pyrethrin có phổ trừ sâu rộng, hiệu lực diệt cao, độc tính thấp với động vật máu nóng, dễ bị phân hủy quang hóa nên dùng để diệt loại trùng nhà Chính nhờ tính chất Pyrethrin, thúc đẩy q trình nghiên cứu tổng hợp đồng đẳng với hiệu lực diệt cao độ bền quang hóa tốt nhằm đưa vào sử dụng rộng rãi thay cho hợp chất diệt trùng nhóm clo hữu cơ, phốt hữu cacbamat PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1 Nghiên cứu tình hình nhiễm bệnh ký sinh đƣờng máu ve truyền bò huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội - Xác định tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng đường máu đàn bò theo lứa tuổi, giống bò, vùng địa lý, mùa năm; - Xác định loài ký sinh trùng đường máu ký sinh đàn bị ni huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội 3.1.2 Định danh ký sinh trùng đƣờng máu bò kỹ thuật phân tử - Thực PCR lồng (nested PCR) giải trình tự 16S rDNA ký sinh trùng đường máu; - Phân tích trình tự tính tốn khoảng cách di truyền 3.1.3 Đặc điểm bệnh lý bò mắc bệnh ký sinh trùng đƣờng máu - Nghiên cứu thể bệnh bò bị nhiễm ký sinh trùng đường máu; - Theo dõi triệu chứng lâm sàng bò bị mắc ký sinh trùng đường máu; - Nghiên cứu bệnh tích đại thể bò bị mắc bệnh ký sinh trùng đường máu; - Xác định bệnh tích vi thể bò mắc bệnh ký sinh trùng đường máu; - Xác định tiêu huyết học bò mắc bệnh ký sinh trùng đường máu 3.1.4 Nghiên cứu tình hình nhiễm ve ký sinh bị huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội - Xác định tỷ lệ mật độ nhiễm ve bò; - Xác định tỷ lệ nhiễm ve bò theo lứa tuổi, giống bò, vùng địa hình mùa năm 3.1.5 Đánh giá mối liên quan nhiễm ve nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu bị huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội - Phân tích số liệu hồi quy Logistic đánh giá mối liên hệ yếu tố, kết dự báo mối liên quan nhiễm ve nhiễm ký sinh trùng đường máu 3.1.6 Bƣớc đầu thử nghiệm thuốc diệt ve ký sinh bò - Thử nghiệm nồng độ thuốc diệt ve phịng thí nghiệm; - Thử nghiệm thuốc diệt ve thể bò 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Xác định địa điểm lấy mẫu Phương pháp nghiên cứu điều tra dịch tễ học mô tả cắt ngang Chọn điểm điều tra theo phương pháp lấy mẫu chùm Thu thập mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên (Nguyễn Như Thanh, 2011) Xác định dung lượng mẫu: số lượng bò nghiên cứu xác định qua phần mềm Win Episcope 2.0 với độ tin cậy 95 Phân chia độ tuổi bò dựa theo sinh trưởng bò Bò vùng nghiên cứu chọn lứa tuổi tuổi, từ đến tuổi tuổi Phân chia vùng địa lý dựa theo nguồn tài liệu tác giả Lê Thông & cs (1997) 3.2.2 Thu thập mẫu để nghiên cứu 3.2.2.1 Thu thập mẫu ve Mẫu ve ký sinh bò thu thập theo phương pháp thường quy (Trịnh Văn Thịnh, 1963) 3.2.2.2 Thu thập mẫu máu bò Thu thập mẫu máu bò theo phương pháp thường quy (Trịnh Văn Thịnh, 1963) 3.2.3 Định danh lồi ve ký sinh phƣơng pháp hình thái Xác định giống ve, dựa vào đặc điểm hình thái theo tiêu chí theo khóa phân loại I Brumpt, 1919 (dẫn Trịnh Văn Thịnh, 1963) Định loại loài ve ký sinh bò dựa vào đặc điểm hình thái ve dựa theo khóa phân loại Walker & cs (2014) 3.2.4 Xác định tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu bò Xác định bò ký sinh trùng đường máu phương pháp nhuộm giemsa, nhận diện xác định ký sinh trùng đường máu qua đặc điểm tiêu nhuộm giemsa Phân biệt loài loài ký sinh trùng đường máu mẫu tiêu nhuộm - Hồng cầu bò màu hồng nhạt, hồng cầu có đơn bào hình lê liên kết với tạo góc nhọn góc tù nhân đơn bào màu xanh lơ, nguyên sinh chất đơn bào màu hồng thẫm Lê dạng trùng - Babesia spp - Hồng cầu có hạt hình cầu nhỏ màu xanh có nhân Theileria spp - Nếu rìa trung tâm hồng cầu có hạt màu xanh thẫm bao bọc vịng sáng biên trùng – Anaplasma spp 3.2.5 Đánh giá mối liên hệ nhiễm ve nhiễm ký sinh trùng đường máu Xác định mối liên hệ nhiễm ve nhiễm ký sinh trùng đường máu qua phương pháp tương quan logictis R (Nguyễn Văn Tuấn, 2020) 3.2.6 Định danh loài ký sinh trùng đƣờng máu phƣơng pháp phân tử Định danh loài ký sinh trùng đường máu phương pháp phân tử Để tiến hành so sánh loài Anaplasma spp nghiên cứu vùng khác miền Bắc, Việt Nam Trình tự tiến hành phương pháp phân tử sau: 3.2.6.1 Tách chiế DNA tổng số tách chiết từ 400 L máu thu thập từ cá thể bị có ký sinh trùng đường máu sau phát phương pháp nhuộm giemsa sinh phẩm GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA) theo hướng dẫn nhà sản xuất 3.2 ệ ồng (nested PCR) giải trình t 16S rDNA ký sinh trùng đƣờng máu Cặp mồi EHR1 (5 GAACGAACGCTGGCGGCAAGC ) EHR2 (5 AGTAYCGRACCAGATAGCCGC ) sử dụng cho phản ứng PCR lần khuếch đại đoạn gen 16S rDNA, sau lấy L sản phẩm PCR lần làm khuôn cho PCR thứ hai, sử dụng mồi cặp EHR3 (5 TGCATAGGAATCTACCTAGTAG ) EHR4 (5 CTAGGAATTCCGCTATCCTCT 3´) (Hosseini-Vasoukolaei & cs., 2014) 3.2.6.3 ả Trình tự nucleotide Anaplasma spp từ mẫu vùng nghiên cứu thu từ giải trình tự, sử dụng để tìm kiếm trình tự tương đồng cơng cụ Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Trình tự rDNA 16S đại diện Anaplasma spp., Ehrlichia spp., Neorickettsia spp Wolbachia spp họ Anaplasmataceae thu thập từ sở liệu GenBank, bao gồm 34 trình tự 16S rDNA 18 lồi sử dụng để phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại phân loại Tất trình tự 16S rDNA chỉnh GENEDOC 2.7 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/ibmpc/genedoc-readme.html) 3.2.6.4 ả ệ Tổng cộng có 44 trình tự nucleotide 16S rDNA, bao gồm 34 trình tự từ Ngân hàng gen 10 trình tự Anaplasma spp Việt Nam nhập vào chương trình GENEDOC 2.7 xếp chỉnh để phân tích phát sinh lồi Các trình tự cắt hai đầu chuỗi để có độ dài cuối 501–502 nucleotide Các trình tự sau trích xuất từ GENEDOC 2.7 đưa vào MEGA7 để phân tích xây dựng phát sinh loài phương pháp (ML, maximum likelihood) với giá trị tin cậy (bootstrap) mẫu 1000 lần mẫu lặp Tham số mơ hình thay với điểm số tốt theo tiêu chí thơng tin Bayes chọn sử dụng mơ hình Jones, Taylor Thornton ( F G I), với tần số ước tính từ liệu ( F), tỷ lệ biến thiên dọc theo chiều dài chỉnh ( G) cho phép tỷ lệ vị trí bất biến ( I) (Kumar & cs., 2016) 3.2.7 Xác định triệu chứng lâm sàng bò mắc bệnh ký sinh trùng đƣờng máu Đo thân nhiệt bò nhiệt kế bách phân (Trịnh Văn Thịnh, 1963) Xác định triệu chứng lâm sàng bò mắc bệnh ký sinh trùng đường máu tự nhiên qua khám trực tiếp thu thập thông tin chủ yếu: thân nhiệt, sốt, màu nước tiểu, màu sắc niêm mạc mắt, hậu môn thể bệnh (Trịnh Văn Thịnh, 1963) Nghiên cứu 30 bị dương tính với ký sinh trùng đường máu có biểu triệu chứng lâm sàng Quan sát triệu chứng, màu sắc niêm mạc mắt, màu sắc nước tiểu, chảy nước dãi, thần kinh, thể trạng thể 3.2.8 Xác định bệnh tích đại thể bò mắc bệnh ký sinh trùng đƣờng máu Xác định thể bệnh dựa xuất dấu hiệu lâm sàng bệnh tích đại thể Đánh giá biến đổi quan tổ chức bò bị bệnh Chụp ảnh mô tả 3.2.9 Xác định bệnh tích vi thể Xác định bệnh tích vi thể phương pháp làm tiêu vi thể Jones (1969) 3.2.10 Phƣơng pháp thử nghiệm thuốc diệt ve ký sinh bò Thử nghiệm hiệu lực thuốc diệt ve phương pháp thực nghiệm 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm Anaplasma spp bị theo địa hình Kết phân tích tỷ lệ nhiễm theo địa hình thể bảng 4.4 Bảng 4.4 cho thấy, tỉ lệ nhiễm Anaplasma spp bị địa hình khác khác nhau, tỷ lệ nhiễm Anaplasma spp bị ni vùng gị đồi cao nhất: 36,93%, tiếp đến vùng núi cao: 23,16%, vùng đồng tỷ lệ nhiễm thấp nhất: 21,19% Kết so sánh cặp vùng cho thấy chênh lệch tỷ lệ nhiễm vùng gò đồi so với vùng đồng 1,34 lần sai khác có ý nghĩa thống kê với P năm tuổi 31,53% thứ đến bò - năm tuổi 30,23% thấp bò < năm tuổi 17,35% Chỉ số tỷ suất chênh OR cho thấy bò từ 1-2 tuổi, bò tuổi nhiễm cao bò tuổi 1,91 1,9 lần So sánh sai khác tỷ lệ nhiễm theo cặp bị 1-2 tuổi, bò >2 tuổi nhiễm Anaplasma spp với bò tuổi, sai khác có ý nghĩa thống kê với P 40°C - Chảy nước dãi - Có dấu hiệu thần kinh - Niêm mạc mắt hậu môn vàng nhợt nhạt - Chết Số bị có biểu Thời gian bị chết (ngày) 28 Khơng chết 1-3 Các dấu hiệu lâm sàng đàn bò vàng địa phương bị sữa huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội mắc bệnh Anaplasma spp thể mạn tính cấp tính Biểu bị mắc bệnh mạn tính thường sốt nhẹ, niêm mạc mắt hậu mơn nhợt nhạt, gầy rạc bị khơng chết Đối với bị thể cấp tính có biểu sốt cao 40-4l°C, chảy nước dãi vật có biểu toàn thân run rẩy, bắp, vai, mơng run giật, bị bị bệnh cấp tính chết Bị bị bệnh mạn tính khơng chết, vật suy nhược, mệt mỏi, ăn, gầy còm, với bị sữa ngừng tiết sữa Điều ảnh hưởng lớn đến suất chăn nuôi nguồn bệnh để lây lan cho bò khác, khơng điều trị chăm sóc tốt, vật bệnh chết kiệt sức 12 Bò bị bệnh thể cấp tính biểu triệu chứng thần kinh, sốt cao vật chết sau 1-3 ngày 4.2.3 Chỉ tiêu huyết học bò nhiễm Anaplasma spp 4.2.3.1 Các tiêu hồng cầu Chúng tơi phân tích tiêu sinh lý 30 mẫu máu bị dương tính với Anaplasma spp Bảng 4.8 Chỉ tiêu hồng cầu bò nhiễm Anaplamsa spp Chỉ số Số lượng hồng cầu (RBC) Số lượng huyết sắc tố (Hb) Thể tích khối hồng cầu (HCT) Thể tích trung bình HC (MCV) Lượng Hb trung bình HC (MCH) Nồng độ Hb trung bình HC Độ phân bố HC (RDW-CV) Kết Bò nhiễm Bò khỏe (30) Mxx Mxx 5,53±0,44 7,02±0,277 3,5±0,65 10,7±0,42 14,9±1,22 30,6±3,65 57±3,45 48,02±5,56 17,2±2,52 15,7±3,54 33,5±2,55 34,8±1,88 16,8±0,76 16,1±1,12 Đơn vị Ghi P- value Tera/L g/dL % fL pg g/dL % Giảm Giảm Giảm Tăng Bình thường Bình thường Bình thường 0,006 0,000 0,000 0,015 0,731 0,683 0,607 Bảng 4.8 cho thấy bị dương tính với Anaplasma spp có số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, thể tích khối hồng cầu giảm so với bị khỏe mạnh bình thường Cụ thể có số lượng hồng cầu (RBC) bị khỏe mạnh bình thường 7,02±0,277 Tera/l, bị mắc bệnh số lượng hồng cầu giảm rõ 5,53±0,44 Tera/L Hàm lượng huyết sắc tố máu bò khỏe mạnh bình thường 10,7±0,42 g/dL Hàm lượng (Hb) bò nhiễm Anaplasma spp giảm rõ rệt 3,5±0,65 g/dL Thể tích khối hồng cầu (HCT) bị khơng mắc bệnh 30,6±3,65%, bị bị nhiễm Anaplasma spp giảm 14,9±1,22%, tương đương giảm nửa so với số bình thường Khi bị bị nhiễm Anaplasma spp thể tích trung bình hồng cầu (MCV) lại tăng lên tới 57±3,45 fL Trong bò khỏe mạnh số có 48,02±5,56 fL Khi bị bị bệnh số Hb trung bình, nồng độ Hb trung bình độ phân bố HC khơng thay đổi so với bò khỏe 4.2.3.2 Các s v bạch cầu Kết phân tích số hệ bạch cầu bị nhiễm Anaplasma spp nhóm bị bình thường tổng hợp bảng 4.9 Bảng 4.9 Chỉ số bạch cầu bò nhiễm Anaplasma spp Chỉ số Số lượng bạch cầu (WBC) Kết Bò bệnh Bò khỏe (30) Mxx Mxx 10.6±0,56 8,4±0,41 Đơn vị Ghi Giga/L Tăng Bình thường Tăng Tăng Số lượng bạch cầu trung tính 2,9±06 2,8±0,65 Giga/L Số lượng bạch cầu Lympho Số lượng bạch cầu Mono 6,3±0,82 1,4±0,26 3,6±1.02 0,7±0,06 Giga/L Giga/L P- value 0,003 0,91 0,044 0,013 Bò nhiễm Anaplasma spp tiêu số lượng bạch cầu thay đổi rõ rệt So sánh số lượng bạch cầu (WBC), số lượng bạch cầu Lympho, bạch cầu thấy số bò mắc bệnh cao hẳn so với số bình thường khơng có chênh lệch đáng kể số lượng bạch cầu trung tính hai nhóm, Cụ thể, số lượng bạch cầu (WBC) bò khỏe mạnh 8,4±0,41 Giga/L, bò nhiễm bệnh số lượng bạch cầu tăng lên 10.6±0,56 Giga/L Số lượng bạch cầu Lympho bò khỏe mạnh 3,6±1,02 Giga/l, bò nhiễm bệnh số lượng bạch cầu Lympho tăng lên cao 6,3±0,83 Giga/l Số lượng bạch cầu Mono bị bình thường 0,7±0,06 Giga/l, bị nhiễm bệnh tăng lên 1,4±0,26 Giga/l 13 4.2.3.3 Chỉ s v hệ tiểu cầu Kết so sánh tiêu tiểu cầu bò nhiễm biên trùng bò khoẻ thống kê bảng 4.10 Bảng 4.10 Chỉ số tiểu cầu bò nhiễm Anaplasma spp Chỉ số Số lượng tiểu cầu (PLT) Thể tích trung bình TC (MPV) Thể tích khối tiểu cầu (PCT) Độ phân bố TC (PDW) Kết Bị bệnh Chỉ số bị bình (30) Mxx thƣờng Mxx 408±88,2 485±89,03 7,16±1,02 6,8±1,31 0,287±0,051 0,516±0,062 5,7±0,376 1,8±0,31 Đơn vị Ghi P-value Giga/L fL % % Bình thường Bình thường Giảm Tăng 0,541 0,829 0,006 0,000 Bị nhiễm Anaplasma spp có số lượng tiểu cầu, thể tích tiểu cầu giảm Bò khỏe mạnh số tiểu cầu 485 ± 89,03 Giga/l, bò bị bệnh số tiểu cầu giảm cịn 408±88,2 g/L Thể tích khối tiểu cầu bị bình thường 0,516±0,062%, bị bệnh số thể tích khối tiểu cầu (PCT) giảm cịn 0,287±0,051% Trong thể tích trung bình tiểu cầu (MPV) lại khơng có chênh lệch Mặt khác, độ phân bố tiểu cẩu (PDW%) bò nhiễm Anaplasma spp 5,7±0,376 tăng lên so với bò khỏe 1,8±0,31% 4.2.4 Bệnh tích đại thể bị mắc bệnh biên trùng spp Chúng tơi tiến hành mổ khám bị Ba Vì, Hà Nội có thèm theo kết so sánh thêm bò Phù Đổng bò Kim Thành – Hải Dương bị mắc bệnh biên trùng để đánh giá biểu bệnh tích đại thể Kết trình bày bảng 4.11 Bảng 4.11 Bệnh tích đại thể bị bị mắc bệnh biên trùng STT Biểu bệnh tích đại thể Máu khó đơng Vàng niêm mạc mắt hậu môn Lách sưng Gan vàng nhạt túi mật sưng Thận nhạt màu Tủy xương màu tro nhạt Số bò theo dõi (con) 5 5 5 Số bị có biểu (con) 5 5 5 Kết mổ khám cho thấy bò mắc bệnh biên trùng xuất tổn thương bệnh lý đại thể sau: niêm mạc vàng, tổ chức liên kết da vàng, máu đỏ tươi, khó đơng, gan vàng nhạt, lách sưng, tủy xương màu tro, vàng nhạt 4.2.5 Bệnh tích vi thể bị mắc bệnh biên trùng Mẫu phổi, gan, lách, túi mật từ bò chết bệnh biên trùng thu thập sau mổ khám Tiến hành nhuộm phương pháp HE Kết trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Các tổn thƣơng vi thể bò mắc bệnh biên trùng Cơ quan Tổn thƣơng -Vách phế nang dày lên Phổi - Khí phế thũng -Phế nang đứt vỡ - Các tế bào xung quanh ống mật bị thối hóa mỡ Gan -Tăng sinh tế bào đơn nhân lớn - Hoại tử tế bào gan - Thâm nhiễm tế bào lympho vùng tủy đỏ Lách - tăng sinh tế bào tương bào -Xung huyết Túi mật -Thành túi mật dày lên tượng tăng sinh 14 Số bị có tổn thƣơng (n=5) Số lƣợng tiêu đọc 50 50 50 50 50 4.3 ĐỊNH DANH LỒI ANAPLASMA SPP Ở BỊ BẰNG PHƢƠNG PHÁP PH N TỬ Các mẫu máu kiểm tra kính hiển vi quang học sau nhuộm giemsa, để tìm diện Anaplasma spp Trong số 226 mẫu máu, 12 mẫu dương tính cho thấy có Anaplasma spp hình ảnh soi kính hiển vi sử dụng để tách chiết DNA tổng số để thực PCR Sản phẩm PCR thu từ tất 12 mẫu giải trình tự, số đó, mẫu khơng cung cấp trình tự nucleotide r ràng để phân tích quan sát thấy có đỉnh kép cho thấy có khả bị bội nhiễm (dữ liệu không hiển thị) Trong số 10 sản phẩm cho chuỗi nucleotide r ràng để phân tích bao gồm mẫu từ bị sữa lai (Ba Vì – Hà Nội), mẫu từ bị vàng địa (5 mẫu từ Ba Vì – Hà Nội mẫu từ Kim Thanh – Hải Dương) 01 mẫu từ chó huyện Ba Vì – Hà Nội Kết kiểm tra loài sinh học phân tử cho thấy, A marginale xác định bò vàng địa (3 Hà Nội; tỉnh Hải Dương) bò sữa (Hà Nội) A platys bò vàng địa (Ba Vì– Hà Nội Kim Thanh – Hải Dương) chó (Ba Vì – Hà Nội) Kết trình bày bảng 4.13 Hình 4.2 Hình ảnh điện di kết phản ứng PCR Bảng 4.13 Giám định loài Anaplasma spp liệu phân tử dựa trình tự 16s từ bị vàng địa bò sữa ch nhà Ba Vì, Hà Nội có so sánh với bị Hải Dƣơng T T Vật chủ Thời gian phân lập Bị vàng địa phương 12/12/2016 Ba Vì – Hà Nội ANA25BV Bị vàng địa phương 12/12/2016 Ba Vì – Hà Nội ANA88 Bò sữa lai 05/9/2017 Ba Vì – Hà Nội BS27 Bị sữa lai 05/9/2017 Ba Vì – Hà Nội BS255 Bị vàng địa phương 05/8/2017 Ba Vì – Hà Nội BV1 Bị vàng địa phương 08/8/2017 Kim Thanh - Hải Dương BVHD1 Bò vàng địa phương 08/8/2017 Kim Thanh - Hải Dương BVHD2 10 Bò vàng địa phương Bò vàng địa phương Chó nhà 12/12/2016 08/8/2017 10/01/2017 Ba Vì – Hà Nội ANA111 Kim Thanh - Hải Dương BVHD4 Ba Vì – Hà Nội C9BV Nơi thu mẫu 15 Ký hiệu mẫu Loài đƣợc ác định Anaplasma marginale Anaplasma marginale Anaplasma marginale Anaplasma marginale Anaplasma marginale Anaplasma marginale Anaplasma marginale Anaplasma platys Anaplasma platys Anaplasma platys Số đăng ký Ngân hàng gen MH686041 MH686042 MH686043 MH686044 MH686045 MH686046 MH686047 MH686048 MH686049 MH686050 Khoảng cách di truyền Anaplasma spp Khoảng cách di truyền tính tốn cách so sánh cặp trình tự 16S rDNA chủng lồi A marginale A platys Tinh tốn khoảng cách di truyền thực lồi A marginale (7 từ Việt Nam hai trình tự làm tham chiếu) A platys (3 từ Việt Nam hai tham chiếu) từ A bovis A phagocytophilum (Bảng 4.14) Trong nhóm A marginale, trình tự mẫu Việt Nam khác khoảng 0,2 – 0,4 so với trình tự đối chứng (chủng A marginale Trung Quốc Nam Phi) (Guo & cs., 2016; Lew cs., 2003) Kết cho thấy sai khác (0,2 – 0,4 ) với chủng Trung Quốc Nam Phi (Bảng 4.14) Bảng 4.14 Tính tốn khoảng cách di truyền ( ) dựa phân tích chu i gen 16S rDNA Anaplasma spp mẫu Việt Nam chủng loài tham chiếu công bố c Ngân hàng gen 10 11 12 13 14 15 16 Loài Chủng A marginale(ANA25BV)-Vietnam A marginale-(ANA88)Vietnam A marginale-(BS27)Vietnam A marginale-(BS255)Vietnam A marginale-(BV1)Vietnam A marginale-(BVHD1)Vietnam A marginale-(BVHD2)Vietnam A marginale(WHANSA19)-China A marginale-(Eland)South Africa A bovis-(Y257)Australia A platys-(ANA111)Vietnam A platys-(BVHD4)Vietnam A platys-(C9BV)Vietnam A platys-(Apl87)Germany A platys-(Dog1)Philippines A phagocytophilum(KZA1)-South Korea Anaplasma spp 10 11 12 13 14 15 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.6 4.8 5.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 0.0 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.4 3.6 3.0 0.2 0.2 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 0.0 0.0 0.2 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.2 3.4 2.8 0.0 0.0 0.2 0.0 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.6 2.8 3.6 1.0 1.0 1.2 1.0 1.0 Ghi chú: Khoảng cách di truyền( ) trình tự nội loài A marginale A platys bơi màu đóng khung Vietnam: Việt Nam; China: Trung Quốc; South Africa: Nam Phi; Australia: c; Germany: Đức; Phillipines: Phillipin; South Korea: Hàn Quốc Trình tự A platys Việt Nam có khoảng cách di truyền < 0,2 so với chủng đối chứng Đức (Dyachenko & cs., 2012) Philippines (GenBank: KP006397) Khoảng cách di truyền loài A marginale Anaplasma spp khác là: 4,6% – 5,0 (với A bovis); 2,8% – 3,6% (với A platys); 2,4% - 2,8 (với A phagocytophilum) (Bảng 4.15) 16 98 46 Anaplasma sp-(AEP1007-ZA2013)-South Africa-KY287600 Anaplasma marginale-(4C)-Philippines-JQ839008 Anaplasma marginale-(23-ZW)-Zimbabwe-AF414878 Anaplasma marginale-(C6A)-Philippines-JQ839012 Anaplasma marginale-(WHANSA19)-China-KU585981 99 Anaplasma marginale-(Eland)-South Africa-AF414872 Anaplasma marginale-(ANA25BV)-Vietnam-MH686041 (indigenous) Anaplasma marginale-(ANA88)-Vietnam-MH686042 (indigenous) Anaplasma marginale-(BS255)-Vietnam-MH686044 (hybrid dairy) Anaplasma marginale-(BS27)-Vietnam-MH686043 (hybrid dairy) 98 Anaplasma marginale-(BV1)-Vietnam-MH686045 (indigenous) Anaplasma marginale-(BVHD2)-Vietnam-MH686047 (indigenous) Anaplasma marginale-(BVHD1)-Vietnam-MH686046 (indigenous) Anaplasma phagocytophilum-(Webster)-United States-U02521 Anaplasma phagocytophilum-(KZA1)-South Korea-KT986058 Anaplasma bovis-(Y257)-Australia-KY425445 66 Anaplasma platys-(WHANSA63)-China-KU585997 Anaplasma platys-(C9BV)-Vietnam-MH686050 (domestic dog) 61 Anaplasma platys-(1)-Malaysia-JF683610 Anaplasma platys-(4618)-Thailand-JN853776 Anaplasma platys-(Apl87)-Germany-JQ396431-Germany 86 Anaplasma platys-(Dog1)-Philippines-KP006397 Anaplasma platys-(Sommieres)-France-AF303467 Anaplasma platys-(ANA111)-Vietnam-MH686048 (indigenous) Anaplasma platys-(BVHD4)-Vietnam-MH686049 (indigenous) 92 Ehrlichia sp-(AmHc79)-Russia-JX092090 47 Ehrlichia sp-(EH1087)-Japan-AY309971 Ehrlichia ewingii-(Stillwater)-United States-M73227 Ehrlichia muris-(AS145)-United States-U15527 99 Ehrlichia chaffeensis-(Arkansas)-United States-M73222 34 Ehrlichia minasensis-(UFMG-EV)-Brazil-NR148800 63 Ehrlichia canis-(E60)-Japan-AB723709 Ehrlichia canis-(002)-Malaysia-KR920044 72 Ehrlichia canis-(171)-South Africa-KC479023 94 Ehrlichia canis-(ECANBkk07)-Thailand-EU263991 Ehrlichia canis-(ZKK21)-Turkey-KP745631 Wolbachia pipientis-(E-Ghent)-Belgium-AF179630 100 Rickettsia marmionii-(KB)-Australia-AY737685 Rickettsia rickettsii-(Sawtooth)-United States-U11021 98 Neorickettsia helminthoeca-United States-U12457 Neorickettsia helminthoeca-(Roxy1)-United States-KX462531 Neorickettsia risticii-(812)-Argentina-KX001784 100 Neorickettsia sennetsu-(11908)-Malaysia-M73225 93 95 Neorickettsia sennetsu-(Miyayama)-Japan-NR044746 Anaplasma Ehrlichia Wolbachia Rickettsia Neorickettsia 0.02 Hình 4.3 Cây phả hệ thể mối quan hệ phân loại Anaplasma marginale A platys Anaplasma marginale A platys xác định phân tử bò sữa lai, bị địa Việt Nam A platys lồi thích ứng gây bệnh người, nên phát lồi bị địa chó cho thấy cần thiết phải tiếp tục nghiên cứu sâu rộng động vật, vector người khắp Việt Nam 4.4 TÌNH HÌNH NHIỄM VE KÝ SINH CỦA BỊ NI TẠI HUYỆN BA VÌ – THÀNH PHỐ HÀ NỘI 4.4.1 Tỷ lệ nhiễm ve đàn bị ni huyện Ba Vì, Hà Nội Kết khảo sát tình hình nhiễm ve đàn bị ni huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội trình bày bảng 4.15 Bảng 4.15 Tỷ lệ nhiễm ve đàn bị ni huyện Ba Vì Loại bị Bị vàng Bò sữa Tổng Tổng số bò theo dõi (con) 687 583 1270 Số bò nhiễm Tỷ lệ nhiễm (con) (%) 303 44,10ª 125 21,44b 428 33,70 P-value 0,000 Các giá trị tỷ lệ nhiễm mang chữ khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê (P< 0,001) Bảng 4.15 cho thấy tỷ lệ nhiễm ve bò vàng địa phương 44,10 , tỷ lệ nhiễm ve bò sữa 21,44 Bò vàng địa phương nhiễm ve cao bị sữa, sai khác có ý nghĩa thống kê P 0,005) Từ kết nghiên cứu chúng tơi nhận thấy, bị tất lứa tuổi ni huyện Ba Vì – thành phố Hà Nội nhiễm ve 4.4.6 Thành phần loài ve ký sinh bò vùng nghiên cứu Để xác định thành phần lồi ve ký sinh bị, chúng tơi tiến hành thu thập mẫu ve từ đàn bò sữa bò vàng địa phương Mẫu ve bảo quản định loại phịng thí nghiệm mơn Ký sinh trùng – Khoa Thú y – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam theo khóa định loại tác giả Brumpt (1919) Walker (2014) Dựa vào đặc điểm hình thái phân loại ve theo khóa phân loại Brumpt (1919) Walker (2014) Nghiên cứu chúng tơi thành phần lồi ve ký sinh bị ni huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội xác định loài ve cứng Rhipicephalus (Boophilus) microplus Rhipicephalus (Boophilus) annulatus Hình 4.4 Ve Rhipicephalus (Boophilus) annulatus _ (mặt bụng) Hình 4.5 Ve Rhipicephalus (Boophilus) annulatus _ (mặt lƣng) 1- Đốt chân, 2- Gốc chân, 3- Tấm cạnh hậu môn 1- Đốt chân, 2- Xúc biện dài cong, 3- Mai lưng, 4- Mắt, 5- Mai hậu mơn - khơng có mấu 19 Hình 4.6 Ve đực Rhipicephalus (Boophilus) annulatus đực (mặt bụng) Hình 4.7 Ve Rhipicephalus (Boophilus) annulatus đực (mặt lƣng) 1- Gốc háng chân ngắn, 2- Bàn thở, 3- Tấm cạnh hậu môn 1- Đốt chân, 2- Xúc biện, 3- Khớp chân, 4- Mai hậu mơn Hình 4.8 Ve Rhipicephalus (Boophilus) microplus_ (mặt bụng) Hình 4.9 Rhipicephalus (Boophilus) microplus _cái (mặt lƣng) 1- Đốt chân, 2- Xúc biện, 3- Đáy đầu giả, 4- Hình thái mặt bụng ve Microplus cái: 1- Gốc chân, 2- Tấm cạnh hậu môn Khớp chân 5- Mắt, 6- Mai lưng, 7- Mai hậu mơn Hình 4.10 Ve Rhipicephalus (Boophilus) microplus _ đực (mặt lƣng) 1- Đốt chân, 2- Xúc biện, 3- Khớp chân, 4- Mấu đuôi Hình 4.11 Ve Rhipicephalus (Boophilus) microplus_ đực (mặt bụng) 1- Tấm cạnh hậu môn, 2- Mấu đuôi, 3- Rãnh hậu môn 20 4.5 MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA NHIỄM VE VÀ NHIỄM KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU Ở BỊ NI TẠI HUYỆN BA VÌ, THÀNH PHỐ HÀ NỘI Để đánh giá mối tương quan biến định tính nhiễm ve có nguy bị nhiễm ký sinh trùng hay khơng, tiến hành sử dụng bảng so sánh, đánh giá số số tần suất OR, khoảng tin cậy với độ tin cậy 95 ý nghĩa P Kết trình bày bảng 4.20 Bảng 4.20 Mối liên quan nhiễm ve nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu Yếu tố Anaplasma spp Tổng Khơng Có Có 165 263 428 Ve Khơng 769 73 842 Tổng OR CI 95% 934 336 1270 16.79 12,33-22,87 Từ kết phân tích số liệu hồi quy Logistic đánh giá mối liên hệ yếu tố, kết dự báo mối liên quan nhiễm ve nhiễm ký sinh trùng đường máu theo phương trình dự báo là: Y= 2.28x X-1.54 Trong đó: Y tỷ lệ nhiễm Ve X tỷ lệ nhiễm Anaplasma 4.6 THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC DIỆT VE CỦA HỢP CHẤT PYRETHROID Với xu phát triển kinh tế nay, việc sử dụng hợp chất có nguồn gốc hữu thân thiện với môi trường, độc với ký sinh trùng độc với vật chủ Để phát triển loại thuốc diệt ve ký sinh bò tương lai đáp ứng yêu cầu trên, khảo sát hiệu lực diệt giai đoạn ve ký sinh bò từ hợp chất hữu bán tổng hợp Pyrethroid Trong phạm vi nghiên cứu đề tài chúng tơi nghiên cứu dẫn xuất Prethroid Permethrin 4.6.1 Hiệu lực diệt giai đoạn ve bò Rhipicepahus (Boophilus) microplus hợp chất Permethrin phịng thí nghiệm Kết thử nghiệm hợp chất hợp chất Permethrin diệt ve phịng thí nghiệm thể qua bảng 4.21 Bảng 4.21 Hiệu lực diệt ve bò Boophilus (Rhipicepahus) microplus hợp chất Permethrin phòng thí nghiệm Số lƣợng (ấu trùng, thiếu trùng ve trƣởng thành) 30 30 30 30 30 30 30 30 Tỉ lệ ve trƣởng thành chết Nồng Phƣơng (%) độ pháp (%) Sau Sau 24 48 giờ 10 10 23.33 16,66 30 20 43.33 Nhúng 23.33 46,66 33.33 50 53,33 56.67 10 63.33 70 21 Tỉ lệ thiếu trùng chết ( ) Sau 24 100 100 100 100 100 100 100 100 Sau 48 100 100 100 100 100 100 100 100 Tỉ lệ ấu trùng chết ( ) Sau 24 100 100 100 100 100 100 100 100 Sau 48 100 100 100 100 100 100 100 100 Tỷ lệ ve chết lô đối chứng (%) Kết bảng 4.21 cho thấy: Từ thực nghiệm cho thấy, tất nồng độ thuốc từ đến 10%, sau nhúng vào thuôc 24 48 tất ấu trùng thiếu trùng chết 100% Tuy nhiên tỷ lệ ve trưởng thành chết tăng dần theo nồng độ thuốc đạt tỷ lệ cao nồng độ thuốc 10% Trong lô đối chứng ve trưởng thành, thiếu trùng ấu trùng ve sống 100% Thực nghiệm cho thấy, hợp chất bán tổng hợp Permethrin có tác dụng diệt giai đoạn ve: giai đoạn trưởng thành, thiếu trùng ấu trùng ve Hiệu lực cao diệt ve trưởng thành 70%, hiệu lực diệt thiếu trùng ấu trùng ve 100% Tác dụng diệt ve trưởng thành, thiếu trùng ấu trùng ve ký sinh bị hóa chất tác động vào hệ thống thần kinh với kích thích mạnh vào kênh ion Natri màng thần kinh, gây tượng co giật giai đoạn ve nguyên nhân làm ve trưởng thành, thiếu trùng ấu trùng ve chết (Viện Sốt rét - Ký Sinh trùng Côn trùng Quy Nhơn) 4.6.2 Thử nghiệm khả diệt ve bò hợp chất thuốc Permethrin nồng độ 5% Sau thời gian thử nghiệm hiệu lực diệt ve nồng độ thuốc Pyrethroid phịng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn nồng độ thuốc để thực nghiệm bò nhiễm ve Rhipicepahus (Boophilus) spp nhằm đánh giá hiệu lực thuốc giai đoạn ve ký sinh đàn bò ảnh hưởng thuốc thể bò Bò lựa chọn thử nghiệm thuốc diệt giai đoạn ve đạt tiêu chí bị nhiễm giai đoạn ve mức cao, tiêu lâm sàng bình thường đáp ứng nhu cầu để thử nghiệm thuốc Bảng 4.22 Hiệu lực diệt giai đoạn ve thể bò hợp chất Permethrin lần phun thứ Số hiệu bò Phƣơng pháp diệt Nồng độ Dung tích hóa chất/ bị Các giai đoạn ve Trưởng thành Phun bình áp suất 5% lít/bị Số Số ve chết lƣợng (con) ve Sau Sau 24 48 giai giờ đoạn 25 21 23 Tỉ lệ chết (%) Sau 24 Sau 48 84 92 Thiếu trùng 75 75 75 100 100 Ấu trùng 15 15 15 100 100 Trưởng thành 35 30 32 85.7 91,4 Thiếu trùng 105 105 105 100 100 Ấu trùng 23 23 23 100 100 Trưởng thành 25 18 20 72 80 Thiếu trung 57 57 57 100 100 Ấu trùng 33 33 33 100 100 22 Để xác định hiệu lực thuốc diệt giai đoạn ve thể bị, chúng tơi bước đầu phun thuốc nồng độ 5% vùng có ve ký sinh trừ vùng đầu, mắt mũi bị hai lần thí nghiệm Thực thử nghiệm phun lần lặp lại thí nghiệm phun lần với cá thể bò Kết trình bày bảng 4.22 Ở nồng độ hóa chất 5% phun dung tích 1lit/bị, thực nghiệm bị bị nhiễm giai đoạn ve cho kết đạt diệt 100% thiếu trùng ấu trùng Hiệu lực diệt ve trưởng thành bò dao động từ 80- 92% Sau 48 phun thuốc, kết hiệu lực diệt ve bò dao dộng từ 80-92% Để đánh giá khả chết ve ký sinh bị có phụ thuộc vào số lần tiếp xúc với hóa chất hay khơng? chúng tơi tiếp tục phun thuốc diệt ve cịn lại bị thí nghiệm lần hai sau tuần Kết trình bày bảng 4.23 Sau ngày phun thuốc lần 1, kiểm tra bị khơng cịn ấu trùng thiếu trùng ve nhiên số lượng ve trưởng thành bám da bò Đánh giá độ an tồn thuốc, chúng tơi khảo sát số tiêu sinh lý bị thí nghiệm sau phun hóa dược Kết cho thấy không làm thay đổi số lâm sàng Cụ thể lần phun hóa dược thân nhiệt bò dao động 38,0-38,6°C Nhịp tim dao động từ 61- 68 lần/ phút Nhịp thở dao động khoảng 20 -22 lần/phút Khơng bị đồng tử mắt, khơng chảy nước dãi, run rẩy Từ thực nghiệm kết luận hóa dược Permethrin nồng độ 5% với lượng phun lít/bị khơng làm ảnh hưởng tới tiêu sinh lý bị Hóa dược an tồn với bị Bảng 4.23 Hiệu lực diệt giai đoạn ve bò lặp lại lần hai hóa chất Permethrin Số hiệu bị Phƣơng pháp diệt Nồng độ hóa chất Dung tích hóa chất /bị Phun bình áp suất 5% lít Giai đoạn ve Trưởng thành Thiếu trùng Ấu trùng Trưởng thành Thiếu trùng Ấu trùng Trưởng thành Thiếu trùng Ấu trùng Số lƣợng giai đoạn 0 0 0 Số Tỷ lệ chết lƣợng sau 48 giai đoạn 0 0 0 2/2 0 3/3 0 5/5 0 Kết nghiên cứu hóa dược Pyrethorid phạm vi đề tài bước đầu Để sử dụng hóa dược chống ve rộng rãi sản xuất chúng tơi đề nghị cần tiếp tục nghiên cứu có đánh giá toàn diện 23 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Bò huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội bị nhiễm Anaplasma spp với tỷ lệ 26,46 Tỷ lệ nhiễm bò vàng 29,4 cao tỷ lệ nhiễm bò sữa 23 Tỷ lệ nhiễm Anaplasma spp cao vùng gò đồi 36,93 , vùng núi cao: 23,16 , vùng đồng bằng: 21,19 Tỉ lệ nhiễm Anaplasma spp có chênh lệch r rệt mùa, cao vào mùa hè: 43,53 ; thấp vào mùa đơng: 11,42 Bị bị nhiễm Anaplasma spp độ tuổi >2 năm tuổi 31,23 ; độ tuổi 1-2 năm 30,21 ; năm tuổi 31,29 , từ 1-2 năm tuổi: 34,65 7) Định loại hình thái ve ký sinh bị huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội lồi: Rhipicephalus (Boophilus) microplus Rhipicephalus (Boophilus) annulatus 8) Bò nhiễm ve làm tăng nguy nhiễm ký sinh trùng đường máu 16,79 lần 9) Hiệu lực diệt ve bò phòng thí nghiệm Permethrin nồng độ 30 ve trưởng thành, 100 ấu trùng thiếu trùng Hiệu lực diệt ve bò thể bò Permethrin nồng độ 5% 84-92% với ve trưởng thành, 100 ấu trùng thiếu trùng Thuốc an tồn với bị 5.2 KIẾN NGHỊ - Cần nghiên cứu rộng loài A.platys động vật khả lây truyền sang người; - Đề nghị nghiên cứu hoàn thiện thuốc diệt ve bị từ chất Pyrethroid 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Hồng Chiên, Nguyễn Thị Lan & Nguyễn Văn Thọ (2018) Bước đầu nghiên cứu tác dụng hợp chất bán tổng hợp Pyrethroid giai đoạn phát triển ve bị (Boophilus microplus) ve chó (Rhipicephalus sanguineu) Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 18-25 Nguyễn Thị Hồng Chiên, Bùi Thị Tố Nga, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Văn Thọ, Lê Việt Hải, Nguyễn Thị Hoàng Yến, Trần Thị Loan & Tăng Xuân Lưu (2018) Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý bệnh biên trùng bị Anaplamsa marginal gây Tạp chí Phịng chống sốt rét Các bệnh ký sinh trùng 02(104): 87-91 Nguyen Thi Hong Chien, Bui Khanh Linh, Nguyen Van Tho, Duong Duc Hieu & Nguyen Thi Lan (2018) Study of epidemiology of ticks in cattle in Bavi district HaNoi Vietnam Journal of Infectious Diseases 126 - 129 25 ... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TÌNH HÌNH NHIỄM KÝ SINH TRÙNG ĐƢỜNG MÁU DO VE TRUYỀN Ở ĐÀN BÕ NUÔI TẠI HUYỆN BA VÌ, THÀNH PHỐ HÀ NỘI 4.1.1 Thành phần, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng đƣờng máu ve truyền đàn bò. .. Nhằm đánh giá nghiên cứu số đặc điểm ký sinh trùng đường máu ve truyền ve ký sinh đàn bò, cung cấp sở khoa học cho việc chẩn đoán, phòng trị bệnh bệnh ký sinh trùng đường máu ve ký sinh bị từ góp... ký sinh trùng đường máu ve truyền cho bò thực tiễn sản xuất PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CƠ SỞ KHOA HỌC 2.1.1 Một số bệnh ký sinh trùng đƣờng máu ve truyền bò Bệnh ký sinh trùng đường máu ve truyền