Cố định enzyme lactase thu nhận từ vi khuẩn lactobacillus acidophilus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA  BK TP.HCM ĐÀO THỊ MỸ LÂM CỐ ĐỊNH ENZYME LACTASE THU NHẬN TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống Mã số: 605402 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2013 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS TRẦN BÍCH LAM Cán nhận xét 1: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Cán nhận xét 2: TS PHAN NGỌC HÒA Luận văn thạc sĩ bảo vệ trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày 14/03/2013 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS LÊ VĂN VIỆT MẪN Chủ tịch Hội Đồng PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Phản biện TS PHAN NGỌC HÒA Phản biện TS LẠI QUỐC ĐẠT Thư ký TS TRẦN BÍCH LAM Ủy viên Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: ĐÀO THỊ MỸ LÂM MSSV: 10110181 Ngày, tháng, năm sinh: 15/08/1987 Nơi sinh: Quảng Ngãi Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Mã số: 605402 I TÊN ĐỀ TÀI: CỐ ĐỊNH ENZYME LACTASE THU NHẬN TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG  Tổng quan tài liệu enzyme lactase (β-galactosidase) phương pháp cố định enzyme  Khảo sát chọn phương pháp cố định enzyme lactase tinh chế từ Lactobacillus acidophilus  Tối ưu hóa điều kiện cố định lactase  Xác định tính chất động học khả tái sử dụng chế phẩm enzyme cố định  Thử nghiệm khả sử dụng chế phẩm để thủy phân lactose sữa III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/07/2012 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14/03/2013 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS TRẦN BÍCH LAM Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 03 năm 2013 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Bích Lam Cơ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên lúc em gặp trở ngại khó khăn, tạo điều kiện tốt để em hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy cô Bộ môn công nghệ thực phẩm truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt năm học trường Con xin cảm ơn má anh hai, em yêu thương chỗ dựa vững mặt sống Em xin thành cảm ơn chị Phượng, bạn Phịng thí nghiệm Vi sinh tạo điều kiện, chia sẻ động viên thời gian thực luận văn Xin cảm ơn thành viên lớp Cao học thực phẩm 2010, 2011, bạn sinh viên khóa 08 – Cơng nghệ thực phẩm, anh chị bạn bè thân quen chia sẻ, động viên giúp đỡ học tập sống TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 03 năm 2013 ĐÀO THỊ MỸ LÂM TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong nghiên cứu này, tiến hành nghiên cứu cố định enzyme lactase từ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus khảo sát khả thủy phân lactose enzyme cố định sữa dịch whey Để chọn phương pháp cố định thích hợp, chúng tơi tiến hành khảo sát phương pháp cố định: phương pháp cố định lactase silica liên kết cộng hóa trị; cố định lactase chitosan liên ngang chất liên kết glutaradehyde cố định nhốt lactase gel Ca-alginate Kết cho thấy enzyme lactase cố định phương pháp nhốt gel Ca-alginate hiệu với nồng độ dung dịch tạo gel 2.5%, hiệu suất cố định đạt 63.81% enzyme cố định cịn 62% hoạt tính so với enzyme tự Chế phẩm enzyme lactase cố định có hoạt tính 0.311 U/g hạt gel ướt với Topt khoảng 40 –45oC so với enzyme tự 400C pHopt 7.5, kết pH tối ưu enzyme tự Enzyme cố định bền nhiệt enzyme tự do, 400C sau thời gian 180 phút cịn 62.22% hoạt tính so với ban đầu Ở 400C thời gian bán hủy 346.6 phút số tốc độ 0.002 phút-1 Chế phẩm enzyme cố định có tốc độ phản ứng cực đại Vm số động học Km 1.68µmol/phút 1.09mM với chất ONPG Tốc độ phản ứng cực đại chế phẩm enzyme cố định giảm 1.37 lần số động học tăng 1.50 lần so với enzyme tự Enzyme cố định có khả tái sử dụng, sau 10 lần sử dụng hoạt tính enzyme cố định cịn 85.87% so với ban đầu Chế phẩm enzyme cố định có khả thủy phân 57.40% lactose 10ml sữa với tỷ lệ chế phẩm 3g hạt (tương ứng hoạt tính tổng 0,95U) sau thời gian 30 phút thủy phân 82.42% lactose 10ml dịch whey với tỷ lệ chế phẩm 2.5g hạt (tương ứng hoạt tính tổng 0,79U) sau thời gian ABSTRACT In this study, we studied to immobilize lactase enzyme from Lactobacillus acidophilus and experiment to apply immobilized enzyme to hydrolyze lactose in milk and whey To select appropriate immobilization method, we experimented three methods: immobilize lactase on silica gel by a covalent bonding method; immobilize lactase on glutaradehyde-crosslinked chitosan and immobilize lactase in Ca-alginate gel by the trapping method The results showed that immobilized lactase in Caalginate gel was more effective than those immobiliztion methods, with immobilization yield 63.81% and its catalytic activity retention 62% compared to the free enzyme The immobilized lactase enzyme has catalytic activity 0.311 U/g wet gel particles at pH 7.52 and temperature 46.20C The optimum temperature for free enzyme and immobilized enzyme were 400C and about 40-450C, the optimum pH for free enzyme and immobilized enzyme were 7.5, respectively The immobilized enzyme was more stable at high pH and temperature than the free enzyme At 400C after 180 minutes, the immobilized enzyme has activity retention 62.22% compared to the initial activity At 400C, the half-life of immobilized lactase was 346.6 minutes and Ki was 0002 min-1 The kinetic parameters for immobilized lactase were also determined with ONPG, Vm 1.68μmol/minute, decreased 1.37 times and Km 1.09mM, increased 1.50 times compared to the soluble enzyme The operational stability showed 85.87% retention of the immobilized enzyme activity after 10 reuses The immobilized enzyme showed lactose hydrolysis of 57.40% of lactose in 10ml milk in hours 30 minutes and 82.42% of lactose in 10ml whey in hours LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân thực hướng dẫn khoa học TS Trần Bích Lam Các số liệu, kết luận nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác chưa cơng bố hình thức nào, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nghiên cứu Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 03 năm 2013 Học viên thực hiên ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG .iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU viii Chƣơng TỔNG QUAN 10 1.1 Enzyme lactase 10 1.1.1 Phản ứng xúc tác lactase 10 1.1.2 Nguồn thu nhận enzyme lactase 11 1.2 Enzym lactase vi khuẩn L acidophilus 14 1.2.1 Vi khuẩn L acidophilus 14 1.2.2 Lactase từ L acidophilus 16 1.3 Tổng quan enzyme lactase cố định 16 1.3.1 Định nghĩa enzyme cố định 16 1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme lactase 16 1.3.3 Tính chất enzyme lactase cố định 19 1.3.4 Ứng dụng enzyme lactase cố định thủy phân lactose sữa/dịch whey tổng hợp GOS 24 1.3.5 Tính chất số chất mang dùng cố định enzyme 26 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Nguyên liệu hóa chất 33 2.1.1 Enzyme lactase tự 33 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 33 2.1.3 Thiết bị 33 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 34 2.3 Bố trí thí nghiệm 35 2.3.1 Chọn phương pháp cố định 35 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM i GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM MỤC LỤC 2.3.2 Khảo sát điều kiện cố định 39 2.3.3 Xác định tính chất chế phẩm enzyme lactase cố định 39 2.3.4 Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme cố định thủy phân lactose sữa dịch whey 40 2.4 Các phương pháp phân tích 41 2.4.1 Xác định hoạt tính enzyme lactase với chất ONPG (o-nitrophenolbeta-D-galactopyranoside) 41 2.4.2 Định lượng protein phương pháp Lowry 42 2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng lactose 43 2.4.4 Xác định thông số động học Km, Vm 44 2.4.5 Phương pháp xác định hiệu suất cố định 44 2.4.6 Hệ số tốc độ thời gian bán hủy enzyme lactase 45 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 46 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47 3.1 Xác định tính chất enzyme lactase tự do: 47 3.2 Khảo sát phương pháp cố định: 48 3.3 Xác định điều kiện cố định 51 3.3.1 Khảo sát nồng độ Na-alginate dung dịch tạo gel 51 3.3.2 Khảo sát tỷ lệ enzyme / alginate 55 3.4 Xác định tính chất enzyme cố định: 57 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến enzyme cố định: 57 3.4.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cố định: 60 3.4.3 Khả tái sử dụng 66 3.5 Xác định tính chất động học enzyme cố định 67 3.6 Ứng dụng enzyme cố định thủy phân lactose sữa dịch whey 68 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ chế phẩm enzyme cố định/thể tích sữa dịch whey đến hiệu suất thủy phân lactose 68 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM ii GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC Chiou M S., Li H Y (2003), “Adsorption behavior of reactive dye in aqueous solution on chemical cross-linked chitosan beads”, Chemosphere 50, pp 1095– 1105 Dashevsky A (1998), “Protein loss by the microencapsulation of an enzyme (lactase) in alginate beads”, International Journal of Pharmaceutics, Volume 161, Issue 1, Pages 1–5 David F.M., Neri, Victor M., Balcão, Maria G., CarneirodaCunha, Luiz B., Carvalho Jr., José A., Teixeira (2008), “Immobilization of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis onto a polysiloxane–polyvinyl alcohol magnetic (mPOS– PVA) composite for lactose hydrolysis”, Catalysis Communications, vol.9, pp.2334–2339 Di Serio M., Maturo C., De Alteriis E., Parascandola P., Tesser R., and Santacesaria E (2003), “Lactose hydrolysis by immobilized β-galactosidase: the effect of the supports and the kinetics”, Catalysis Today, vol 79-80, pp 333–339 Dwevedi M., Kayastha A M (2009), “Optimal immobilization of β-galactosidase from Pea (PsBGAL) onto Sephadex and chitosan beads using response surface methodology and its applications”, Bioresource Technology, vol 100, no 10, pp 2667–2675 Elnashar M M M and Yassin M A (2009), “Lactose Hydrolysis by β-Galactosidase Covalently Immobilized to Thermally Stable Biopolymers”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Volume 159, Number 2, 426-437 Eriksson L., et al (2000), “Design of Experiments - Principles and applications”; MKS Umetrics AB, p.459 Fatma Işık ÜSTOK (2007), “Production of β-Galactosidase Using Lactic Acid Bacteria and Optimisation of Fermentation Parameters”, Department of Chemical Engineering, Izmir Institute of Technology Freitas F F., Marquez L D S., Ribeiro G P., Brandão G C., Cardoso V L., Ribeiro E J (2011), “A comparison of the kinetic properties of free and immobilized Aspergillus oryzae β-galactosidase” Gekas, Lopez-Leiva M (1985), “Hydrolysis of lactose: A literature review”, Process Biochemistry, vol 20, pages 2-12 Genari A.N , et al (2003), “Configuration of a bioreactor for milk lactose hydrolysis”, Journal Dairy Science, vol.86, pp.2783-2789 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM Giacomini C., Villarino A., Franco-Fraguas PHỤ LỤC L., Batista-Viera F (1998), “Immobilization of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis on silica and agarose: comparison of different methods”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Volume 4, Issues 5–6, Pages 313–327 Gopal P K (2011), “Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus”, Encyclopedia of Dairy Sciences, Fonterra Research Centre, Palmerston North, New Zealand, page 251 Grosova Z., Rosenberg M., Rebros M., Sipocz M., Sedlackova B (2008), “Entrapment of β-galactosidase in polyvinylalcohol hydrogel”, Biotechnol Lett, vol.30, pp.763– 767 Gonzalez S M., Pizarro C (2001), “Polyacrylamide gels as support for enzyme immobilization by entrapment Effect of polyelectrolyte carrier, pH and temperature on enzyme action and kinetics parameters”, European Polymer Journal, vol.37, pp.435-444 Haider T., Husain Q (2008), “Concanavalin A layered calcium alginate-starch beads immobilized β-galactosidase as a therapeutic agent for lactose intolerant patients”, International Journal of Pharmaceutics, vol.359, pp.1–6 Husaina Q et al (2011), “Immobilization of Aspergillus oryzae β-galactosidase on zinc oxide nanoparticles via simple adsorption mechanism”, International Journal of Biological Macromolecules, vol.49, pp.37–43 Illanes A., Ruiz A., Zúñiga M E., Aguirre C., O'Reilly S and Curotto E (1990), “Immobilization of lactase for the continuous hydrolysis of whey permaete”; Bioprocess and Biosystems Engineering, Volume 5, Number 6, Pages 257-262 Illanes A., Altamirano C., Aillapán A., Tomasello G., Zuñiga M E (1998),“Packedbed reactor performance with immobilized lactase under thermal inactivation”, Enzyme and Microbial Technology, Volume 23, Issues 1–2, Pages 3–9 Illanes A., Wilson L., Tomasello G (2000), “Temperature optimization for reactor operation with chitin-immobilized lactase under modulated inactivation”, Enzyme and Microbial Technology, Volume 27, Issues 3–5, Pages 270–278 Jafarei P., Ebrahimi M T (2011), “Lactobacillus acidophilus cell structure and application”, African Journal of Microbiology Research, Vol 5, issue 24, pages 4033-4042 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC Kakita, H & Kamishima, H (2008), “Some properties of alginate gels derived from algal sodium alginate”, J Appl Phycol, vol.20, pp.543–549 Krajewska B (2004), “Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review”, Enzyme and Microbial Technology, Volume 35, Issues 2–3, Pages 126–139 Kozhukharova A., Kirova N., Batsolva K., Gargova S., and Dimova A (1991), “Immobilization of βgalactosidase on silica gel following a metal chelation method”, Khranit Promst., vol 40, pp 43–46 Mateo C., Monti R., Pessela B C C., Fuentes M., Torres R., Guisán J M., Fernández-Lafuente R (2004),” Immobilization of Lactase from Kluyveromyces lactis Greatly Reduces the Inhibition Promoted by Glucose Full Hydrolysis of Lactose in Milk”; Biotechnology Progress, Volume 20, Issue 4, pages 1259–1262 Mahoney R R (1985), “Modification of lactose and lactose-containing dairy products with β-galactosidase”, Developments in Dairy Chemistry, vol 3, pages 69-110 Makkarh P S., Shamar O P and Negi S S (1981), “Immobilization and properties of β-D-galactosidase from Lactobacillus bulgaricus”, J Bio Sci., vol.3, pp.7-16 Mozumder N H M R., Akhtaruzzaman M (2012), Bakr M A and Fatema-TujZohra, “Study on Isolation and Partial Purification of Lactase (β-Galactosidase): Enzyme from Lactobacillus Bacteria Isolated from Yogurt”, Journal of Scientific Research, vol 4, 239-249 Muzzarelli R A A (1980), “Immobilization of enzymes on chitin and chitosan”, Enzyme and Microbial Technology, Volume 2, Issue 3, Pages 177–184 Nagy et al (2001), “β-Galactosidase of Penicillium chrysogenum: production, purification, and characterization of the enzyme”, Protein Expres Pur., 21, 24-29 O’Connell , Walsh G (2007), “Purification and Properties of a β-galactosidase with potential application as a digestive supplement”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 141, 1-13 Oliveira C (2011), “Recombinant microbial systems for improved β-galactosidase production and biotechnological applications”, Biotechnology Advances, vol.29, pp.600–609 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC Pawar,S.N and Edgar, K.J (2012), “Alginate derivatization: A review of chemistry, properties and applications”, Biomaterials, vol.33, pp.3279-3305 Prenosil J E., Stuker E., Bourne J R (1987), “Formation of oligosaccharides during enzymatic lactose hydrolysis”, State of art Biotechnol Bioeng, vol 30, 1019-1025 Park Ah-Reum and Oh Deok-Kun (2010), “Effects of galactose and glucose on the hydrolysis reaction of a thermostable β-galactosidase from Caldicellulosiruptor saccharolyticus”, Applied Microbiology and Biotechnology, pages 1427-1435 Panesar P S., et al (2006), “Microbial production, immobilization and applications of β-D-galactosidase”, Chem Technol Biotechnology, vol 81, pages 530-543 Panesar P S., Kumari S., and Panesar R (2010), “Review Article: Potential Applications of Immobilized β-Galactosidase in Food Processing Industries”; Biotechnology Research Laboratory, Department of Food Engineering & Technology, Sant Longowal Institute of Engineering and Technology, Longowal, Punjab, 148 106, India Portaccio M., Stellato S., Rossi S., et al (1998), “Galactose competitive inhibition of β-galactosidase (Aspergillus oryzae) immobilized on chitosan and nylon supports”, Enzyme and Microbial Technology, vol 23, no 1-2, pp 101–106, 1998 Puri M., Gupta S., Pahuja P., Kaur A., Kanwar J R and Kennedy J F (2009), “Cell Disruption Optimization and Covalent Immobilization of β-D-Galactosidase from Kluyveromyces marxianus YW-1 for Lactose Hydrolysis in Milk”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Volume 160, Number 1, pages 98-108 Rehm B.H.A (2009), “Alginates: Biology and Applications”, Publisher: Springer Roy I and Gupta M N (2003), “Lactose hydrolysis by LactozymTM immobilized on cellulose beads in batch and fluidized bed modes”, Indian Institute of Technology, vol.39, pp.325-332 Sanders M E., Klaenhammer T R (2001), “Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic”, American Dairy Science Association, Vol 84, pages 319-331 Serge Lartillot (1993), “Immobilization of Lactase on Silica Gel: Study of Lactose Hydrolysis Using The Immobilized Material”, Department of Applied Biology Institut Universitaire de Technologie BP 510, 21014 Dijon France HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC Sheu Dey-Chyi, Li Shin-Yi, Duan Kow-Jen and Chen C Will (1998), “Production of galactooligosaccharides by β-galactosidase immobilized on glutaraldehyde-treated chitosan beads”, Biotechnology Techniques, Volume 12, Number 4, 273-276 Szczodrak J (2000), “Hydrolysis of lactose in whey permeate by immobilized βgalactosidase from Kluyveromyces fragilis”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Volume 10, Issue 6, pages 631–637 Tanriseven A., Şenay Doğan (2002), “A novel method for the immobilization of βgalactosidase”; Department of Biochemistry, Gebze Institute of Technology, Gebze, Kocaeli, Turkey, Vol 38, 27-30 pages Thu-Ha Nguyen, Barbara Splechtna, Stanimira Krasteva, Wolfgang Kneifel, Klaus D Kulbe, Christina Divne & Dietmar Haltrich (2006), “Characterizationandmolecular cloning ofa heterodimeric β-galactosidase from the probiotic strain Lactobacillus acidophilus R22” Vasiljevic T., Jelen P (2001), “Production of β-galactosidase for lactose hydrolysis in milk and dairy products using thermophilic lactic acid bacteria”; Innovative Food Sci & Emerg Technol., vol 2, pages 75-85 Valero J I S (2009), “Production of Galacto-oligosaccharides from Lactose by immobilized β-galactosidase and Posterior Chromatographic”, Univ of Ohio State , page 270 Won K., Kim S., Kim K.J., Park H.W., Moon S.J (2005), “Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads”, Process Biochemistry, vol.40, pp.2149– 2154 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HÓA CHẤT 1.1 Danh bạ hóa chất sử dụng Bảng 1.1 Bảng danh bạ hóa chất sử dụng nghiên cứu STT Mục đích Tên hóa chất Thơng số Nhà cung cấp NaH2PO4.2H2O Trung Quốc Na2HPO4.12H2O Trung Quốc CH3COONa Trung Quốc Tris-HCl Trung Quốc ONPG (C12H15NO8) Hóa chất pha dung dịch đệm ONP Merck (Đức) Trung Quốc Na2CO3 Ethanol Albumin huyết bò 11 Dạng bột, màu vàng Độ tinh khiết > 98% 10 Merck (Đức) Độ tinh khiết > 98% Hóa chất sử dụng xác định hoạt tính enzyme lactase Hóa chất sử dụng xác định hàm lượng protein Dạng bột, màu trắng Dạng bột, màu vàng Độ tính khiết > 96% Trung Quốc Potassium sodium tartrate (NaKC4H4O6) Folin – Ciocalteau Merck (Đức) Dung dịch màu vàng Merck (Đức) 12 CuSO4.5H2O Trung Quốc 13 Lactose Trung Quốc 14 Zinc-acetate Trung Quốc 15 Acid phosphotungstic Trung Quốc Glycine Trung Quốc NaCl Trung Quốc 16 17 18 Hóa chất sử dụng xác định hàm lượng lactose Methylamine-HCl Dạng bột, màu trắng Merck (Đức) Độ tinh khiết > 98% 19 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM Sodium sulfite (Na2SO3) Trung Quốc GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC 20 Acid benzoic Trung Quốc 21 Diethyl ether Trung Quốc Acid nitric Trung Quốc Aceton Trung Quốc 3aminopropyltriethoxy silane Trung Quốc Toluene Trung Quốc 22 Hóa chất sử dụng phương pháp cố định enzyme với chất mang silica gel 23 24 25 26 Glutaraldehyde 27 28 29 30 1.2 40% Trung Quốc Hóa chất sử dụng phương pháp cố định enzyme với chất mang Chitosan Acid glacial acetic (CH3COOH) Trung Quốc NaOH Trung Quốc Hóa chất sử dụng phương pháp cố định enzyme với chất mang Caalginate CaCl2 Tripolyphosphate (TPP) ≥ 98% Trung Quốc Trung Quốc Chuẩn bị hóa chất  Pha dung dịch đệm:  Dung dịch đệm sodium phosphate 0.05 M: 17.9 g Na2HPO4.12H2O định mức đến 1000 ml nước cất dung dịch Na2HPO4 0.05 M; 7.8 g NaH2PO4.2H2O định mức đến 1000 ml nước cất dung dịch NaH2PO4 0.05 M Trộn hai dung dịch với tỷ lệ phù hợp ta dung dịch có pH mong muốn  Dung dịch đệm acetate 0.1M: 5.75ml dung dịch CH3COOH đặc định mức đến 1000ml nước cất dung dịch CH3COOH 0.1M; 8.2 g CH3COONa hòa tan định mức đến 1000ml nước cất dung dịch CH3COONa 0.1M Trộn hai dung dịch với tỷ lệ phù hợp ta dung dịch có pH mong muốn (từ 4.0 đến 6.0)  Dung dịch đệm Tris-HCl (pH 6.5 – 7.0): Cân 12.1g Tris, bổ sung nước cất, sau dùng dung dịch HCl 0.1M chỉnh pH đến giá trị cần dùng, định mức lại nước cất đến 1000ml HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC  Pha hóa chất xác định hoạt tính β-galactose  Dung dịch ONP 0.3 mol/ml: hòa tan 208.7 mg ONP vào 50ml ethanol, định mức đến 500 ml nước cất dung dịch ONP nồng độ mM Hút 10ml ONP nồng độ mM định mức lên 100ml dung dịch ONP nồng độ 0.3mol/ml  Dung dịch ONPG mM: hòa tan 0.09045 g ONPG định mức đến 100 ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.05 M ( pH 7.0) Dung dịch bảo quản chai thủy tinh tối màu, oC  Dung dịch Na2CO3 10%: 10g Na2CO3 định mức 100ml nước cất  Hóa chất xác định hàm lượng protein  Dung dịch A: Cân 4g NaOH 20g Na2CO3 pha 1000ml nước cất  Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.H2O pha dung dịch Natri-Kali Tartrat 1%  Dung dịch C: Hỗn hợp hai dung dịch A B theo tỉ lệ 50 :  Thuốc thử Folin: pha loãng nước cất tỉ lệ: 1:3  Pha hóa chất xác định hàm lượng lactose  Acid zinc acetate-phosphotungtic (ZAPT): Hòa tan 25g zinc acetate 12.5g acid phosphotungstic nước, thêm 20ml acid glacial acetic định mức lên 1000ml  Đệm Glycine-NaOH: Hỗn hợp 150ml dung dịch glycine gồm 2.4768g glycine 1.9359g NaCl hòa với 850ml NaOH (0.385M) điều chỉnh pH 12.7  Dung dịch Sodium sulfite 1% (w/v): 1g Na2SO3 hòa thành 100ml nước cất  Dung dịch Methylamine-HCl 5%(w/v): 5g Methylamine-HCl hòa tan thành 100ml nước cất, lưu trữ 4oC  Dung dịch CaCl2 0.075M: 8.325g hòa tan thành 1000ml nước cất  Dung dịch NaCl 0.85%: 8.5g hòa tan thành 1000ml nước cất HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC PHỤ LỤC 2: ĐƢỜNG CHUẨN 2.1 Đƣờng chuẩn ONP Bảng 2.1 Pha loãng ONP Óng nghiệm 10 Nước cất (ml) 10 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 ONP 0.3 mol/ml (ml) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Nồng độ ONP(µmol/ml) 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 0.18 0.21 0.24 0.27 Bảng 2.2 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn ONP Ống nghiệm 10 ONP 0.3 mol/ml (ml) 2 2 2 2 2 Na2CO3 10% 1 1 1 1 1 Nồng độ ONP (µmol/ml) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 Bảng 2.3 Đường chuẩn nồng độ ONP OD Nồng độ ONP (µmol/ml ) OD 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.085 0.159 0.237 0.324 0.4 0.471 0.553 0.629 0.706 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC OD 0.8 y = 3.9129x + 0.0043 R² = 0.9998 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Nồng độ ONP (µmol/ml) 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 Hình 2.1: Đường chuẩn nồng độ ONP OD 2.2 Đƣờng chuẩn protein Cách tiến hành:  Pha dung dịch albumin chuẩn có nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5mg/ml  Cho vào ống nghiệm 1ml mẫu 5ml dung dịch C, để yên 10 phút  Cho vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút  Đo độ hấp thu A bước sóng λ = 750nm  Từ lập đường chuẩn C = f(A) Bảng 2.4 Đường chuẩn nồng độ Protein OD Nồng độ protein (mg/ml) 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 OD 0,052 0,187 0,294 0,394 0,462 0,562 0,640 0,723 HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC 0.8 y = 1.8661x + 0.0874 R² = 0.9924 0.7 0.6 OD 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Nồng độ protein (mg/ml) 0.30 0.35 0.40 Hình Hình Hình 2.2 Đường chuẩn albumin 2.3 Đƣờng chuẩn nồng độ lactose OD Bảng 2.5 Đường chuẩn nồng độ lactose OD Nồng độ lactose (mg/ml) 0.75 1.25 1.5 1.75 OD 0.174 0.240 0.298 0.367 0.421 OD 0.45 y = 0.2427x - 0.0028 R² = 0.9993 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 Hàm lƣợng lactose (mg/ml) 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ lactose OD HVTH: ĐÀO THỊ MỸ LÂM 1.75 GVHD: TS TRẦN BÍCH LAM PHỤ LỤC PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Bảng 3.1 Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme lactase cố định gel Ca-alginate (tại pH 7) Nhiệt độ Hoạt tính chế phẩm enzyme cố định (U/g hạt) Hoạt tính so với enzyme tự (%) Hoạt tính so với hoạt tính cực đại nhiệt độ tối thích (%) 30 0.1321a±0.0004 33.07a±0.10 45.00 35 0.1742b±0.0192 43.61b±4.82 59.34 40 0.2818c±0.0040 70.56c±0.10 96.02 45 0.2935c±0.0063 73.49c±1.58 100 50 0.2762d±0.0058 69.18d±1.46 94.13 55 0.2151e±0.0116 53.87e±2.90 73.31 60 0.1863e±0.0174 46.66e±4.36 63.49 65 0.1241f±0.00398 31.07f±0.10 42.27 70 0.0913g±0.01267 22.85g±3.17 31.10 80 0.0732g±0.0056 18.34g±1.39 24.96 Các giá trị bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn mẫu độc lập Các giá trị cột kí hiệu khác biểu thị khác có nghĩa (p