Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá tác dụng chống trầm cảm của l-tetrahydropalmatin (l-THP) trên mô hình gây trầm cảm bằng chuỗi stress nhẹ, kéo dài, không báo trước. Từ kết quả của thử nghiệm thăm dò trên chuột nhắt không chịu stress, liều 0,2 mg/kg được lựa chọn cho nghiên cứu tác dụng của hoạt chất này trên mô hình động vật được gây trầm cảm thực nghiệm.
www.vanlongco.com 20,0 19,6 98,0 20,0 18,8 94,0 20,0 19,5 97,5 + Kết định lượng luteolin mẫu vỏ lạc Áp dụng phương pháp định lượng luteolin xây dựng, tiến hành định lượng luteolin 95,6 ± 1,2% mẫu vỏ lạc thu mua được, kết thể Bảng 5, cho thấy hàm lượng luteolin dao động từ 0,08 - 0,10% tính theo khối lượng khô tuyệt đối Bảng Kết định lượng luteolin mẫu vỏ lạc STT Ký hiệu mẫu Nơi thu mua luteolin (%) Hải Hậu, Nam Định 0,101 ± 0,002 VL2 (Vỏ lạc có hạt màu trắng) Ba Vì, Hà Nội 0,093 ± 0,004 VL3 (Vỏ lạc có hạt màu trắng) Lâm Thao, Phú Thọ 0,083 ± 0,003 VL1 (Vỏ lạc có hạt màu đỏ) Kết luận Đã xây dựng phương pháp định tính, định lượng luteolin vỏ lạc phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Phương pháp định lượng luteolin vỏ lạc đảm bảo độ đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, độ đúng, độ xác cao (RSD < 2,0%) Các mẫu vỏ lạc thu mua có hàm lượng luteolin 0,08% tính theo dược liệu khô tuyệt đối Lời cảm ơn: Nghiên c u nhận hỗ trợ kinh phí khoa học công nghệ 2013 – 2015 Sở Khoa học công nghệ Hà Nội Tài liệu tham khảo Sim E S., Lai S Y., Chang Y P (2012), Antioxidant capacity, nutritional and phytochemical content of peanut (Arachis hypogaea L.) shells and roots, African Journal of Biotechnology, 11(53), 11547-11551 Daigle D J., Conkerton E J., Sanders T H., and Mixon A C (1988), Peanut Hull Flavonoids: Their Relationship with Peanut Maturity, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 36(6), 1179-1181 Gao F., Ye H., Yu Y., Zhang T., Deng X (2011), Lack of toxicological effect through mutagenicity test of polyphenol extracts from peanut shells, Food Chemistry 129(3), 920–924 Diego A M., Nebojsa I., Alexander P., Ilya R (2000), Effects of Arachis hypogaea nutshell extract on lipid metabolic enzymes and obesity parameters, Life Sciences, 78(24), 2797 – 2803 Zhou P., Li L P., Luo S Q., Jiang H D., Zeng S (2008), Intestinal absorption of luteolin from peanut hull extract is more efficient than that from individual pure luteolin, Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(1), 296-300 Lin Y., Shi R., Wang X., Shen H.-M (2008), Luteolin, a flavonoid with potentials for cancer prevention and therapy, Current Cancer Drug Targets, 8(7), 634–646 Cos P., Ying L., Calomme M., Hu J P., Cimanga K., Van Poel B., Pieters L., Vlietinck A J., Vanden Berghe D (1998), Structure-activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers, Journal of Natural Products, 61(1), 71-76 Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 (Trang 86 - 93) NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG TRẦM CẢM CỦA l-TETRAHYDROPALMATIN TRÊN MƠ HÌNH STRESS NHẸ, KÉO DÀI, KHƠNG BÁO TRƯỚC Phạm Đức Vịnh, Đặng Hoài Thu, Đào Thị Vui, Nguyễn Hoàng Anh*, Đào Thị Kim Oanh Đại học Dược Hà Nội *Email: anh90tk@yahoo.com (Nhận ngày 06 tháng năm 2017) Tóm tắt Nghiên cứu thực để đánh giá tác dụng chống trầm cảm l-tetrahydropalmatin (l-THP) mô hình gây trầm cảm chuỗi stress nhẹ, kéo dài, không báo trước Từ kết thử nghiệm thăm dị chuột nhắt khơng chịu stress, liều 0,2 mg/kg lựa chọn cho nghiên cứu tác dụng hoạt chất mơ hình động vật gây trầm cảm thực 86 Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 www.vanlongco.com nghiệm Kết thử nghiệm cho thấy chuỗi stress nhẹ, kéo dài, không báo trước gây loạt thay đổi hành vi liên quan đến trầm cảm, bao gồm giảm ưa thích dung dịch saccharose, giảm hành vi chải lông, tăng trạng thái bất động test treo đuôi tăng vận động tự nhiên test môi trường mở Ngoại trừ ảnh hưởng vận động tự nhiên, sử dụng l-THP liều 0,2 mg/kg hàng ngày, liên tục tuần có tác dụng đảo ngược thay đổi hành vi chuột thí nghiệm gây stress Tác dụng tương tự thuốc chống trầm cảm ba vòng clomipramin Đây nghiên cứu cơng bố tác dụng l-THP mơ hình thực nghiệm đặc hiệu cho rối loạn trầm cảm chế liên quan đến tác dụng l-THP cần làm sáng tỏ nghiên cứu T kh a: l-Tetrahydropalmatin, Rối loạn trầm cảm, Chống trầm cảm, Stress nhẹ kéo dài Summary Antidepressant-like Effects of l-Tetrahydropalmatine in Mice Exposed to Unpredictable Chronic Mild Stress The present study aimed to investigate the antidepressant-like effects of l-tetrahydropalmatine (l-THP) in an unpredictable chronic mild stress (UCMS) mouse model Based on results from the preliminary study in which l-THP decreased depression-like behaviours of non-stressed mice in a dose-dependent manner, the dose of 0.2 mg/kg b.w was selected for further evaluating the antidepressant activity of this alkaloid in stressed mice A schedule of mild psychosocial stressors was applied in Swiss mice for weeks in order to produce a depressant-like state characterized by decreasing sucrose preference and grooming behaviour, increasing immobility in the tail suspension test and enhancing locomotor activity With exception of locomotor activity, these behavioural changes were reversed by oral administration of l-THP with daily dose of 0.2 mg/kg b.w for a 3-week period, which was similar to the tricyclic antidepressant clomipramine This may be the first study to report the effects of l-THP on an animal model which is specific to major depressive disorder and further studies should be conducted to elucidate possible mechanisms of these effects Keywords: l-Tetrahydropalmatine, Antidepressant, Major depressive disorder, Chronic mild stress Đặt vấn đề Trầm cảm rối loạn tâm thần nghiêm trọng với tỷ lệ mắc ngày gia tăng Theo dự báo Tổ chức Y tế giới (WHO), năm 2030, trầm cảm trở thành nguyên nhân hàng đầu gây gánh nặng bệnh tật khuyết tật nghiêm trọng cho cộng đồng [1] Mặc d y học đạt bước tiến lớn kể từ thuốc chống trầm cảm sử dụng lâm sàng vào năm 1950, cịn nhiều bệnh nhân khơng có đáp ứng đầy đủ với hầu hết thuốc chống trầm cảm sẵn có, bao gồm thuốc chống trầm cảm ba vịng, thuốc ức chế monoamin oxidase thuốc ức chế tái thu hồi chọn lọc noradrenalin và/hoặc serotonin [2] Mặt khác, bệnh nhân có đáp ứng với điều trị, cải thiện triệu chứng tâm thần thường bắt đầu sau 3-6 tuần d ng thuốc Hơn nữa, tác dụng không mong muốn gặp trình điều trị có xu hướng làm giảm đáng kể tuân thủ điều trị bệnh nhân Thực tế đặt nhu cầu cấp thiết việc tìm kiếm thuốc điều trị thay bổ sung cho phác đồ [3] l-Tetrahydropalmatin (l-THP) alcaloid phân lập từ nhiều loài thuộc chi Corydalis Stephania Trong năm gần đây, tác dụng hướng tâm thần l-THP tập trung Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 nghiên cứu, bao gồm tác dụng an thần, giải lo âu cải thiện trí nhớ [4], [5] Dựa mối quan hệ gần bệnh lý rối loạn tâm thần, đặc biệt rối loạn lo âu trầm cảm, kết từ vài nghiên cứu thăm dò bước đầu cơng bố [6], l-THP thuốc chống trầm cảm tiềm Tuy nhiên, để khẳng định tác dụng chống trầm l-THP, cần thực thêm nghiên cứu đặc hiệu mô hình thực nghiệm tin cậy, có giá trị dự đốn cao ph hợp với trình sinh bệnh học người Do đó, nghiên cứu thực với mục đích đánh giá tác dụng chống trầm cảm l-THP, sử dụng mơ hình động vật gây trầm cảm chuỗi stress nhẹ, kéo dài, không báo trước Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Ngun liệu Hóa chất: l-Tetrahydropalmatin (l-THP) đạt chuẩn phân tích cung cấp công ty CP Tâm Hiếu Đức (98,4%), clomipramin (Clomidep 25 mg, Sun Pharmaceutical Industries, Ấn Độ), saccharose tween 80 (tiêu chuẩn dược dụng) Chuẩn bị thuốc thử: clomipramin l-THP phân tán Tween 80 1% để thu hỗn dịch đồng có hàm lượng thích hợp Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng giống đực, chủng Swiss khỏe mạnh, cân nặng 1820 g Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung 87 www.vanlongco.com cấp Chuột nuôi ổn định điều kiện thí nghiệm tuần trước tiến hành nghiên cứu, cho ăn thức ăn chuẩn, uống nước tự 2.2 Phương pháp nghiên c u Thăm dò liều có tác dụng chống trầm cảm l-THP chuột không chịu stress Tác dụng chống trầm cảm l-THP đánh giá sơ chuột nhắt bình thường, sử dụng test treo (TST) Động vật thí nghiệm chia ngẫu nhiên thành lô (9 con/lô), bao gồm lô chứng, lô clomipramin (chứng dương) lô thử Lô chứng dương uống hỗn dịch clomipramin liều 20 mg/kg, lô thử uống hỗn dịch l-THP với mức liều 0,2, 0,4 0,8 mg/kg lô chứng sinh lý uống dung môi pha thuốc (Tween 80 1%) với thể tích tương đương Thuốc đối chứng/l-THP/dung môi cho uống vào sáng hàng ngày, liên tục 21 ngày Vào ngày thứ 21, sau cho động vật sử dụng thuốc, tiến hành đánh giá hành vi chuột test TST theo quy trình mơ tả phần Đ nh gi t c d ng ch ng tr m c m c a l-THP chu t chịu stress nh , kéo dài, không b o trươc Động vật chia ngẫu nhiên thành lô (812 con/lô), bao gồm lô chứng sinh lý, lô chứng bệnh, lô chứng dương lô thử Lô chứng bệnh, chứng dương lô thử gây trầm cảm chuỗi stress nhẹ, không báo trước thời gian tuần; lô chứng sinh lý nuôi điều kiện bình thường khơng chịu stress Bắt đầu từ tuần thứ 6, song song với quy trình gây stress, lô chứng dương cho uống clomipramin liều 20 mg/kg lô thử cho uống l-THP với liều thích hợp (lựa chọn từ thử nghiệm thăm dị) Với lô chứng sinh lý lô chứng bệnh, động vật uống dung mơi (Tween 80 1%) với thể tích tương đương Thử nghiệm tiêu thụ saccharose thực hàng tuần, trước cho động vật sử dụng thuốc/dung môi Các test hành vi gồm test phun saccharose, test treo đuôi môi trường mở thực lần thời điểm cuối nghiên cứu, sau động vật dùng thuốc tuần Gây trầm chuỗi stress nhẹ, k o dài, không báo trước: Chuỗi stress nhẹ, kéo dài với trình tự ngẫu nhiên (khơng báo trước) xây dựng theo nguyên tắc chung nghiên cứu trước [5], đồng thời có thay đổi cho ph hợp với điều kiện thực tế Tổng cộng tác nhân gây stress khác áp dụng với tần suất 1-2 tác nhân/ngày, trì liên tục hàng ngày tồn thời gian thí nghiệm (Bảng 1) Chuột chịu stress nuôi cô lập lồng Trái lại, động vật thuộc lô chứng sinh lý nuôi con/lồng không chịu stress suốt nghiên cứu Quy trình gây stress tuần trình bày chi tiết Bảng Quy trình tương tự áp dụng cho tuần trình tự, thời điểm ngày khoảng thời gian dành cho tác nhân gây stress thiết lập ngẫu nhiên nhằm tránh tượng thích nghi động vật với stress Bảng Danh sách tác nhân gây stress sử dụng nghiên cứu Tên tác nhân Nghiêng lồng Rút nước uống Giam giữ Trấu ẩm Lồng ngập nước Tiếng ồn trắng Bỏ trấu Chiếu sáng liên tục Mô tả Bỏ trấu đặt lồng nghiêng 45o so với mặt đất thời gian 1-3 Bỏ bình uống nước khỏi lồng thời gian 10 -12 Giữ chuột bất động dụng cụ hình trụ (8×3,5 cm) 30-60 phút Làm ẩm trấu lồng trì điều kiện thời gian 10-12 Bỏ trấu thêm nước vào lồng đến độ cao cm, trì 20 - 40 phút Phát tiếng ồn trắng (white noise) liên tục thời gian - Chuột ni lồng khơng có trấu thời gian 12 - 24 Chiếu sáng liên tục, cường độ lớn thời gian 12 - 24 Bảng Quy trình gây stress nhẹ, kéo dài, khơng báo trước tuần Thời gian Thứ Thứ Thứ 88 Các tác nhân gây stress áp dụng Nghiêng lồng (9 - 11 giờ); phát tiếng ồn trắng (18 - 21 giờ) Lồng ngập nước (9 - 30); bỏ trấu (17 - sáng hôm sau) Giam giữ (15 - 15 30) Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 www.vanlongco.com Thứ Thứ Thứ Chủ nhật Chiếu sáng liên tục (14 - sáng hôm sau) Rút nước uống (8 - 18 giờ); trấu ẩm (18 - sáng hôm sau) Nghiêng lồng (16 - 17 giờ), bỏ trấu (17 30 – sáng hôm sau) Tiếng ồn trắng (15 - 18 giờ) Thử nghiệm tiêu thụ saccharose: thực để đánh giá hành vi giảm hứng thú [7] Hai bình uống nước giống (Deluxe 80 ml), bình chứa nước bình thường bình chứa dung dịch saccharose 1% có khối lượng xác định đặt cân đối vào hai bên lồng để chuột tự lựa chọn nước dung dịch đường Sau 14 (từ 17 hôm trước đến hơm sau), lấy tồn bình chứa nước chứa saccharose đem cân, từ xác định tỷ lệ phần trăm khối lượng dung dịch saccharose chuột tiêu thụ theo công thức: tỷ lệ tiêu thụ saccharose = khối lượng dung dịch saccharose tiêu thụ × 100/tổng khối lượng lượng dịch tiêu thụ Test treo đuôi: thực để đánh giá hành vi tuyệt vọng [8] Treo chuột lên giá cách sử dụng băng dính cố định đuôi chuột (điểm treo cách điểm tận c ng đuôi cm, cách mặt sàn 40 cm) móc treo Ghi nhận hành vi chuột thời gian phút Tính thời gian bất động chuột phút cuối thơng qua phân tích video sau thí nghiệm Test phun saccharose (splash test): thực để đánh giá hành vi tự chăm sóc [9] Đặt chuột vào lồng (tương tự lồng nuôi hàng ngày), phun thể tích xác định dung dịch saccharose 10% lên lưng chuột thơng qua bình xịt định liều Ghi nhận hành vi chuột phút để xác định thời gian tiềm tàng (thời gian từ lúc phun saccharose đến chuột có hành vi liếm lơng lần đầu) tổng thời gian chải lông (grooming) Test môi trường mở (OFT): thực để đánh giá khả vận động tự nhiên hành vi khám phá [10] Chuột nhắt đặt vào mơ hình, thực thử nghiệm phút Ghi nhận số đường kẻ qua, số lần đứng chân, số lần vào trung tâm thời gian lưu lại vùng trung tâm chuột Tất thông số test hành vi (trừ thử nghiệm tiêu thụ saccharose) đánh giá độc lập hai nghiên cứu viên theo nguyên tắc làm mù, dựa phân tích video sau thí nghiệm Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 2.3 Xử lý số liệu Kết xử lý phần mềm SPSS 22.0 với mẫu liên tục, phân bố chuẩn, liệu biểu diễn dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn sử dụng kiểm định ANOVA kèm hậu kiểm LSD Dunnett’s T3 để so sánh khác biệt lô Với mẫu rời rạc không tuân theo phân bố chuẩn, liệu biểu diễn dạng trung vị (khoảng tứ phân vị) sử dụng kiểm định Kruskal Wallis hậu kiểm tương ứng để so sánh khác biệt lô Kết 3.1 Kết thăm dị liều có tác dụng chống trầm cảm l-THP chuột không chịu stress Trên chuột không chịu stress, test treo đuôi sử dụng để đánh giá tác dụng chống trầm cảm l-THP mức liều khác Kết trình bày Hình Hình Ảnh hưởng l-THP đến thời gian bất động chuột không chịu stress test TST * p < 0,05 so với lô chứng (Tween 1%); CLM: clomipramin; n=9 Thuốc đối chứng clomipramin liều 20 mg/kg, cho uống 21 ngày làm giảm 42,0% thời gian bất động chuột nhắt trắng test TST (p = 0,005 so với lô chứng) Tương tự, l-THP với mức liều 0,2 0,4 mg/kg làm giảm rõ rệt thông số so với lô chứng, với mức giảm tương ứng 35,0% (p = 0,018) 29,1% (p = 0,047) Tuy nhiên, tác dụng làm giảm trạng thái bất động test TST l-THP mức liều 0,8 mg/kg (p = 0,237 so với chứng) 89 www.vanlongco.com 3.2 Kết đánh giá tác dụng chống trầm cảm l-THP chuột chịu stress nhẹ, kéo dài, không báo trước Dựa kết thử nghiệm thăm dị, liều 0,2 mg/kg (mức liều thấp có tác dụng khoảng liều nghiên cứu chuột không chịu stress) lựa chọn để đánh giá tác dụng chống trầm cảm l-THP chuột chịu stress nhẹ, kéo dài, không báo trước Kết thể test hành vi bao gồm thử nghiệm tiêu thụ saccharose, test phun saccharose, test treo đuôi test môi trường mở trình bày Hình 25 Bảng Thử nghiệm tiêu thụ saccharose Hình Ảnh hưởng l-THP đến tỷ lệ tiêu thụ saccharose chuột chịu stress nhẹ, kéo dài, không báo trước; *p < 0,05 so với lô chứng sinh lý; # p < 0,05 so với lô chứng bệnh; CLM: clomipramin Tỷ lệ tiêu thụ dung dịch saccharose lơ chứng bệnh lý có xu hướng giảm dần từ tuần thứ đến tuần thứ nghiên cứu Tại tuần thứ 8, tỷ lệ tiêu thụ dung dịch saccharose lô chứng bệnh thấp có ý nghĩa so với lơ chứng sinh lý Sử dụng clomipramin liều 20 mg/kg l-THP liều 0,2 mg/kg giúp đảo ngược xu hướng giảm tiêu thụ dung dịch saccharose gây chuỗi stress nhẹ, kéo dài, không báo trước Sau tuần dùng thuốc, tỷ lệ tiêu thụ saccharose lô clomipramin lô l-THP tăng rõ rệt so với lô chứng bệnh, với mức tăng tuyệt đối tương ứng 17,6% (p = 0,035) 21,2% (p = 0,009) Test phun saccharose Hình Ảnh hưởng l-THP đến hành vi chuột chịu stress nhẹ, kéo dài, không báo trước test phun saccharose; *p < 0,05 so với lô chứng sinh lý; # p < 0,05 so với lô chứng bệnh; CLM: clomipramin Chuột lơ chứng bệnh có xu hướng giảm hành vi tự chăm sóc, thể thơng qua tăng rõ rệt thời gian tiềm tàng (p = 0,018) giảm tổng thời gian chuột dành để chải lông (p < 0,001) so với lô chứng sinh lý Sử dụng clomipramin liều 20 mg/kg làm giảm 57,9% thời gian tiềm tàng (p = 0,012) tăng 90 50,8% tổng thời gian chải lông (p < 0,001) Tương tự, l-THP liều 0,2 mg/kg có tác dụng rút ngắn thời gian tiềm tàng (67,7%, p < 0,001) kéo dài tổng thời gian chải lông (53,9%, p < 0,001) so với chuột chịu stress không điều trị Test treo (TST) Tạp chí Dược liệu, tập 22, số 2/2017 www.vanlongco.com Hình Ảnh hưởng l-THP đến thời gian bất động test TST chuột chịu stress nhẹ, kéo dài, không báo trước; CLM: clomipramin; *p