Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC MÃ SỐ: 62720403 HÀ NỘI, 2020 Cơng trình hồn thành tại: Bộ mơn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Hải Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá cấp Trường họp tại: Vào hồi .giờ .ngày .tháng .năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Đại học Dược Hà Nội I MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trong năm gần đây, chất ức chế enzym HDAC trở thành tác nhân chống ung thƣ đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) chất ức chế enzym HDAC đƣợc FDA cấp phép điều trị u lympho tế bào T dƣới da Sau đó, belinostat, panobinosat đƣợc phép sử dụng điều trị số bệnh ung thƣ Bên cạnh đó, nhiều chất ức chế enzym HDAC, đặc biệt dẫn chất kiểu propenamid, đƣợc nghiên cứu đƣa vào thử nghiệm lâm sàng nhƣ NVP- LAQ824, MS-275, cyclodepsipeptid FK-228… Luận án đƣợc thực theo hƣớng nghiên cứu nhằm tìm kiếm chất ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ Đề tài “Tổng hợp thử tác dụng sinh học số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” đƣợc tiến hành với mục tiêu Mục tiêu luận án Tổng hợp đƣợc khoảng từ 30 đến 40 acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase tác dụng kháng số dòng tế bào ung thƣ dẫn chất tổng hợp đƣợc Những đóng góp luận án Về thiết kế tổng hợp acid hydroxamic Luận án thiết kế tổng hợp đƣợc 62 acid hydroxamic mới, cấu trúc chƣa đƣợc công bố tài liệu trƣớc Về thử tác dụng sinh học Thử tác dụng ức chế enzym: 21 chất dãy I-III đƣợc thử tác dụng ức chế HDAC phƣơng pháp Wesstern blot nồng độ µg/ml, có 18/21 chất thể tác dụng ức chế HDAC 41 chất dãy IV-X đƣợc định lƣợng nồng độ ức chế HDAC2 phƣơng pháp định lƣợng huỳnh quang, có chất có IC50 nhỏ SAHA, đa số chất có IC50 < 6,5 µM Cả 62 chất đƣợc thử độc tính tế bào 3-4 dòng tế bào ung thƣ Kết quả, 20 chất bao gồm Ia-g, IIa-e, Ve, Vf, VIIIe, IXc, IXg, Xa-c có độc tính mạnh SAHA dịng tế bào thử nghiệm Trong đó, chất Xc thể tác dụng mạnh đƣợc tiến hành thêm số thử nghiệm gồm đánh giá tác dụng ức chế HDAC1, 6, với IXg, Xa, Xb đƣợc đánh giá độc tính tế bào phổi thƣờng MRC-9 Kết quả, Xc có khả ức chế HDAC tƣơng đƣơng SAHA có xu hƣớng chọn lọc HDAC1 HDAC2 Các chất thử nghiệm thể khả gây độc chọn lọc tế bào ung thƣ so với tế bào thƣờng mức độ chọn lọc cao SAHA Bố cục luận án Luận án có 149 trang, 16 bảng, 66 hình, 15 sơ đồ Bố cục gồm phần: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (41 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội dung phƣơng pháp nghiên cứu (11 trang), kết nghiên cứu (57 trang), bàn luận (36 trang), kết luận kiến nghị (2 trang), danh mục báo công bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 172 tài liệu tham khảo (14 trang) 281 phụ lục (148 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN Chƣơng tổng quan trình bày về: - Enzym HDAC: Khái niệm, phân loại cấu trúc HDAC nhóm I, II, IV - Các chất ức chế HDAC đƣợc cơng bố theo nhóm chất: acid hydroxamic, benzamid, peptid vịng, ceton, acid béo mạch ngắn nhóm chất khác - Phƣơng pháp tổng hợp vòng triazol: chế, xúc tác, phối tử - Phƣơng pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester - Định hƣớng thiết kế cấu trúc chất luận án Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị - Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam - Các dụng cụ thí nghiệm thơng thƣờng dùng tổng hợp hữu - Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máyđiện di - Các dòng tế bào ung thƣ ngƣời thử nghiệm 2.2 Nội dung nghiên cứu - Tổng hợp 62 dẫn chất acid hydroxamic - Khẳng định cấu trúc chất tổng hợp dựa phân tích liệu phổ khối, phổ hồng ngoại phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H, 13C-NMR) - Thử tác dụng ức chế HDAC chất tổng hợp đƣợc - Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời in vitro chất tổng hợp đƣợc Chương KẾT QUẢ 3.1 Tổng hợp kết phân tích phổ Các chất đƣợc tổng hợp theo quy trình dƣới đây: * Nhóm acid hydroxamic khơng chứa vịng triazol Gồm dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g đƣợc tổng hợp theo sơ đồ dƣới đây, đƣợc khẳng định có cấu trúc nhƣ dự kiến dựa vào kết phân tích phổ + Dãy Ia-g + Dãy IIa-g + Dãy IIIa-g + Dãy IV - VIII + Dãy IXa-g + Dãy Xa-c Bảng 3.1: Tóm tắt kết tổng hợp Chất Ia Ib Ic Id Ie If Ig H (%) 74,0 72,0 69,3 67,0 71,0 75,0 75,0 Chất IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg H (%) 76,0 67,0 70,0 65,0 68,0 71,0 75,0 Chất IIIa IIIb IIIc IIId IIIe IIIf IIIg H (%) 40,0 64,0 65,0 70,0 62,0 45,0 67,0 Chất IVa IVb IVc H (%) 64,0 63,0 63,0 Chất Va Vb Vc Vd Ve Vf Vg H (%) 68,0 72,0 64,0 68,0 71,0 60,0 70,0 Chất VIa VIb VIc VId VIe VIf VIg H (%) 68,0 69,0 69,0 74,0 75,0 64,0 73,0 Chất VIIa VIIb VIIc VIId VIIe VIIf VIIg H (%) 67,0 65,0 64,0 62,0 67,0 57,0 64,0 Chất VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf VIIIg H (%) 69,0 72,0 75,0 75,0 68,0 64,0 76,0 Chất IXa IXb IXc IXd IXe IXf IXg H (%) 50,0 54,0 51,0 55,0 52,0 53,0 52,0 Chất Xa Xb Xc H (%) 64,0 62,0 60,0 Bảng 3.2 Kết dự đoán lượng liên kết phương pháp docking Chất Ia Ib Ic Id Ie If Ig -9,40 -9,00 -9,00 -9,10 -8,30 -9,00 -8,90 Chất IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg -8,60 -8,60 -8,40 -8,30 -8,60 -8,30 -8,40 Chất IIa IIb IIc IId IIe IIf IIg -9,80 -9,90 -9,90 -9,90 -9,70 -9,90 -9,60 Chất IVa IVb IVc -7,40 -7,60 -7,70 Chất Va Vb Vc Vd Ve Vf Vg -7,50 -7,70 -7,80 -7,80 -7,10 -7,40 -7,90 Chất VIa VIb VIc VId VIe VIf VIg -6,70 -7,00 -7,10 -7,00 -7,40 -7,40 -7,20 Chất VIIa VIIb VIIc VIId VIIe VIIf VIIg -7,10 -7,20 -7,30 -7,20 -7,60 -7,00 -7,40 Chất VIIIa VIIIb VIIIc VIIId VIIIe VIIIf VIIIg -7,80 -7,10 -7,80 -7,20 -7,50 -7,90 -7,30 Chất IXa IXb IXc IXd IXe IXf IXg -9,70 -9,90 -9,80 -9,50 -9,90 -9,60 -9,10 Xa Xb Xc SAHA Chất -9,40 -9,60 -9,48 -7,40 Ghi chú: Năng lượng liên kết dự đốn tính kcal/mol Năng lƣợng tƣơng tác chất nhỏ SAHA cho thấy tiềm ức chế HDAC2 chất so sánh với SAHA Ngồi ra, hình ảnh tƣơng tác chất mơ hình trung tâm hoạt động HDAC2 (Hình 3.1) cho thấy, chất có phần cầu nối nằm trọn lịng kênh enzym, nhóm chức acid hydroxamic tiếp cận đƣợc tới ion kẽm khoảng cách đủ gần để tạo đƣợc phức chelat Ngồi ra, chất có vịng thơm phần cầu nối, đặc biệt vòng benzen, tạo đƣợc tƣơng tác van der Waals kiểu xếp chồng π-π với Phe155 Phe210 Đây đƣợc dự đoán yếu tố quan trọng tạo nên lực liên kết tốt Hình 3.1: Hình ảnh docking dãy chất IIIa-g 3.3 Tác dụng sinh học Các kết cụ thể tác dụng sinh học chất đƣợc trình bày cụ thể phần bàn luận sau Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 TỔNG HỢP HOÁ HỌC Phản ứng alkyl hoá: Cơ chế phản ứng phản ứng nucleophil, đƣợc minh hoạ Sơ đồ 4.1 Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng alkyl hoá Theo tài liệu tham khảo, phản ứng N-alkyl hoá khung indolin đƣợc tiến hành môi trƣờng base với tác nhân alkyl hoá dẫn xuất halogen Một số loại base thƣờng đƣợc sử dụng trình gắn mạch alkyl vào nguyên tử N khung indolin kể đến nhƣ: Na 2CO3, K2CO3, Cs2CO3, LiH, NaH, CaH2, TEA, LiOH, NMP, NaOEt Các loại dung mơi sử dụng phản ứng gồm: DMF, DMA, HMPT, MeCN, DMSO, NMP, EtOH, MeOH, Me2CO So sánh xúc tác base dung môi thuận lợi cho thao tác, sẵn có nhƣ giá thành nguyên liệu luận án lựa chọn sử dụng chất xúc tiến K 2CO3, dung môi DMF xúc tác KI Sự có mặt KI giúp tăng tốc độ phản ứng, xảy phản ứng trao đổi nhóm khó bị -Br nhóm dễ bị -I theo phản ứng Finkelstein Kết thu đƣợc phản ứng N-alkyl hố tiến hành thuận lợi điều kiện với hiệu suất tƣơng đối cao từ khoảng 75,0–96,0% Phản ứng azid hoá: dùng giai đoạn tổng hợp chất trung gian azid Đây phản ứng theo chế nucleophil (Sơ đồ 4.2): Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng azid hoá Trong trƣờng hợp này, muối azid natri tác nhân nucleophil mạnh nên trình phản ứng diễn trực tiếp mà khơng cần giai đoạn hoạt hoá Phản ứng azid hoá phản ứng SN2 nên thƣờng đƣợc tiến hành dung môi phân cực không proton nhƣ acetonitril, dimethylsulfoxid, dimethylformamid Tuy nhiên, số nghiên cứu gần cho thấy phản ứng azid hóa có khả phản ứng tốt mơi trƣờng nƣớc có sử dụng sóng siêu âm hỗ trợ hay hỗn hợp dung môi nƣớcTHF Trong giai đoạn khảo sát lựa chọn dung môi, luận án thử tiến hành phản ứng tổng hợp chất 3.9 nƣớc hỗn hợp nƣớc-THF Nhƣng nguyên liệu ban đầu methyl 3-bromopropanoat (chất 3.8) chất lỏng không màu, có tính phân cực kém, khơng đồng tan nƣớc có tỷ trọng nặng nƣớc nên thƣờng tách lớp nằm phía dƣới đáy bình cầu Dù sử dụng khuấy từ nhƣ đun hồi lƣu để hỗ trợ trình khuấy trộn bình cầu nhƣng phản ứng diễn khó khăn Do đó, phản ứng đƣợc khảo sát với dung môi methanol, dung mơi phân cực nƣớc, có khả hoà tan đƣợc ester 3.8 NaN3 Kết khảo sát cho thấy sau khoảng h điều kiện nhiệt độ phịng phản ứng diễn hồn tồn Q trình tổng hợp dẫn xuất alkyl azid khác gồm 3.12, 3.15, 3.18, 3.21, 3.24 đƣợc tiến hành tƣơng tự với dung môi methanol điều kiện nhiệt độ phịng Nhìn chung, phản ứng tổng hợp dẫn chất azid diễn tƣơng đối thuận lợi, nhƣng trình xử lý phản ứng phải trải qua giai đoạn tách chiết nên hiệu suất thu không cao khoảng từ 48,5% đến 68,4% Phản ứng đóng vịng Click: phản ứng dùng để tạo thành cấu trúc 1,2,3triazol cấu tạo dãy chất từ IV đến X Để phản ứng diễn theo hƣớng tạo sản phẩm mang khung 1,2,3-triazol xúc tác đƣợc lựa chọn muối đồng (I): CuI Muối CuI có ƣu điểm độ phân cực khác biệt nhiều so với sản phẩm tạo nên giai đoạn xử lý phản ứng loại xúc tác tồn dƣ diễn thuận lợi so với muối đồng khác thƣờng đƣợc dùng làm xúc tác nhƣ CuOTf.C6H6 hay CuSO4.5H2O/Natri ascorbat Dựa kết nghiên cứu Yan Z.Y cộng số nghiên cứu khác số dung môi đƣợc lựa chọn để khảo sát phản ứng đóng vịng Click gồm: nƣớc, aceton, t-BuOH, acetonitril, DMF Các alkyn nitril khơng tan tan nƣớc, aceton t-BuOH nên phản ứng hầu nhƣ không diễn dung môi Ngƣợc lại, phản ứng diễn tốt dung môi DMF acetonitril Khi sử dụng dung mơi DMF, phản ứng đóng vịng tiến hành điều kiện nhiệt độ phòng thời gian phản ứng nhanh từ 3-5 h Do nhiêt độ sôi DMF cao (153oC) nên loại dung môi phƣơng pháp cất quay chân không Hƣớng xử lý phản ứng trƣờng hợp tạo kết tủa sản phẩm môi trƣờng nƣớc, kết tủa thu đƣợc bao gồm sản phẩm lƣợng CuI dùng làm xúc tác Quá trình xử lý buộc phải tiến hành tinh chế thêm bƣớc Vì vậy, thời gian xử lý phản ứng dài lƣợng sản phẩm tinh khiết thu đƣợc với hiệu suất thấp (dƣới 40%) Trong đó, sử dụng dung mơi acetonitril sau kết thúc phản ứng dễ dàng loại bỏ dung môi phƣơng pháp cất quay tinh chế sản phẩm cần qua cộng hƣởng có dạng singlet - Vịng triazol có proton ln xuất dạng tín hiệu cộng hƣởng singlet có độ dịch chuyển hóa học nằm khoảng 8,11 – 8,15 ppm Trên phổ HMBC chất IXa, carbon vị trí 5” vịng triazol (C-5”) thể tƣơng tác rõ ràng với hai cặp proton hai cầu nối bên cạnh H-6” H-7’ Dữ liệu kết hợp với tín hiệu cộng hƣởng H-5” sở để khẳng định phản ứng đóng vòng Click tạo sản phẩm theo hƣớng mạch nhánh gắn vào vị trí 1,4 vịng triazol - Bên cạnh đó, proton nhóm -CH 3, -OCH3 -NOCH3 xuất đầy đủ phổ đồ dẫn chất khoảng tƣơng ứng 2,26 - 2,27 ppm 3,84 ppm 4,20 - 4,23 ppm Các proton nhóm chức acid hydroxamic có vị trí hấp thụ lần lƣợt khoảng δH(NH) = 10,7510,77 ppm, δH(OH) = 9,04 - 9,05 ppm Phổ cộng hưởng từ carbon 13C-NMR: - Cấu trúc chất có hai nguyên tử carbon nhóm carbonyl, có vị trí cộng hƣởng vùng trƣờng thấp phổ đồ, độ dịch chuyển hóa học nằm khoảng 158,72 - 172,82 ppm - Các carbon khung indolin, vịng benzen, cầu nối -CH=CH- có vị trí cộng hƣởng nằm khoảng từ 109,92 - 156,82 ppm - Carbon cầu nối methylen mạch nhánh alkyl có độ dịch chuyển hóa học nằm khoảng 22,01 - 49,33 ppm Dãy II, III, X có thêm nhóm =NOCH3 vịng dioxolan với độ dịch chuyển hóa học carbon khoảng 64,48 - 66,83 ppm - Phổ đồ chất cho tín hiệu cộng hƣởng carbon có nhóm -CH3 (δ = 20,46 – 20,97 ppm), -OCH3 (δ = 55,63 – 55,68 ppm) Riêng chất có nhóm F xuất thêm tƣơng tác từ F với carbon lân cận khung indolin làm tách đơi số pic 4.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.3.1 Bàn luận hoạt tính sinh học dãy dẫn chất Ia-g IIa-g Hình 4.1: Kết thử tác dụng ức chế HDAC dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g Trong thứ nghiệm Western blot (Hình 4.1), nồng độ acetyl-histon H3 H4 xuất rõ ràng có mặt chất Ia, Ib, Id-f, IIa-c, IIe-f gợi ý chất có khả ức chế HDAC mạnh Khi có mặt chất Ic, IId, acetyl-histon H3 H4 xuất nhƣng mức độ thấp nhiều Gợi ý chất Ic, IId có khả ức chế HDAC nhƣng yếu chất kể Riêng với vị trí Hình 4.1 tƣơng ứng với thí nghiệm có mặt Ig IIg, hầu nhƣ khơng thấy xuất acetyl-histon H3 H4 Chứng tỏ HDAC khơng bị ức chế q trình deacetyl hoá diễn nồng độ thử nghiệm Kết thí nghiệm Western blot nhìn chung cho thấy ảnh hƣởng khác nhóm vịng indolin hoạt tính ức chế enzym, chất có nhóm thể Cl vị trí số khơng có hoạt tính ức chế enzym tốt dẫn xuất khác Bảng 4.1: Kết thử độc tính tế bào dãy chất Ia-g IIa-g Độc tính tế bào ung thư Kết (IC50, µM) docking Chất R LogP SW620 PC3 AsPC-1 (kcal/mol) Ia H 2,11 2,26 1,33 0,95 -9,40 Ib 5-F 2,27 0,91 1,29 1,46 -9,00 Ic 5-Cl 2,67 0,90 0,47 0,81 -9,00 Id 5-Br 2,94 1,41 0,91 0,63 -9,10 Ie 5-CH3 2,60 1,93 1,20 0,83 -8,30 If 5-OCH3 1,98 2,46 1,13 0,68 -9,00 7-Cl Ig -8,90 2,67 2,24 1,94 1,68 H IIa 2,37 1,96 1,14 1,23 -8,60 5-F IIb 2,53 0,71 0,93 0,56 -8,60 5-Cl IIc 2,93 1,10 0,88 0,82 -8,40 5-Br IId 3,20 0,80 0,81 1,11 -8,30 5-CH3 IIe 2,86 1,23 1,37 1,79 -8,60 5-OCH3 2,25 IIf 5,25 4,31 4,55 -8,30 7-Cl IIg 2,93 3,15 4,54 3,58 -8,40 SAHA 1,44 3,26 1,75 3,19 -7,40 Dữ liệu Bảng 4.1 trừ chất IIf, IIg, chất cịn lại có độc tính tế bào tƣơng đƣơng mạnh SAHA dòng tế bào thử nghiệm Chất Ia IIa có độc tính tế bào tƣơng đƣơng nhau, cho thấy việc methyl hố nhóm oxim indolin trì đƣợc hoạt tính sinh học tốt Các nhóm hút electron (-F, -Cl, -Br) đƣợc vào vị trí vòng indolin (chất Ib-d, IIb-d) dƣờng nhƣ làm tăng độc tính tế bào, nhóm hút electron (-Cl) vào vị trí (chất Ig, IIg) làm giảm rõ rệt hoạt tính kháng tế bào ung thƣ Ngƣợc lại, với hai nhóm đẩy electron methyl methoxy, nhóm methyl có tác dụng làm tăng nhẹ hoạt tính sinh học (so sánh Ie, IIe với chất Ia, IIa), nhƣng nhóm methoxy khơng thể tác dụng này, chí nhóm methoxy gắn khung 3-methoxim-2oxoindolin cịn làm giảm độc tính đáng kể so với chất khơng nhóm Nhìn chung, với kết thu đƣợc khẳng định acid hydroxamic mang khung 3-oxim/methoxim-2-oxoindilin chất có tiềm ức chế HDAC tốt tác dụng độc tính tế bào khả quan Độc tính chất đa số tƣơng đƣơng mạnh so với SAHA, hứa hẹn khả phát triển khung cầu trúc nhằm tìm kiếm chất ức chế HDAC 4.3.2 Bàn luận hoạt tính sinh học dãy chất IIIa-g Trong thử nghiệm Western blot có chất thể tác dụng ức chế HDAC dẫn đến xuất vết acetyl-H3 H-4 Chất IIIg với nhóm -Cl vị trí số khung indolin khơng thể tác dụng ức chế HDAC nồng độ thử nghiệm Trong đó, chất IIIc mang nhóm -Cl nhƣng vị trí số có tác dụng ức chế enzym rõ rệt Nhƣ vậy, vị trí nhóm yếu tố ảnh hƣởng lớn đến tác dụng sinh học chất vị trí số khung indolin khơng phù hợp để gắn nhóm Kết phù hợp với kết thử độc tính tế bào Trong đó, dịng tế bào chất IIIg có tác dụng yếu dãy chất nồng độ cần để gây độc tính đƣợc 50% tế bào ung thƣ cao Với dãy dẫn chất này, kết thử tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào tƣơng đồng chất lại Kết thử Weston blot cho thấy vết acetyl-H3 acetyl-H4 SAHA xuất rõ nét chất IIIa-g Giá trị IC50 thử nghiệm dòng tế bào SW620, AsPC-1 PC3 SAHA tƣơng ứng thấp tất chất IIIa-g, thể độc tính SAHA mạnh chất dãy IIIa-g Khi so sánh chất với không nhận thấy có xu hƣớng khác biệt rõ ràng nhóm hút đẩy electron, hay kích thƣớc nhóm Khi so sánh kết thử độc tính tế bào dãy IIIa-g với hai dãy Ia-g, IIa-g thấy rõ suy giảm độc tính Tất chất dãy IIIa-g yếu chất dãy Ia-g, IIa-g Vị trí số khung indolin khơng phù hợp với khung vịng lớn nhƣ spiro[1,3]-dioxolan Bảng 4.2: Kết thử độc tính tế bào dãy chất IIIa-g Độc tính tế bào ung Kết docking thư, (IC50, µM) Chất R LogP SW620 PC3 AsPC-1 (kcal/mol) IIIa H 2,36 3,60 18,89 18,45 -9,80 IIIb 5-F 2,51 3,30 11,50 7,28 -9,90 IIIc 5-Cl 2,91 3,42 17,44 22,35 -9,90 IIId 5-Br 3,18 3,05 7,30 6,83 -9,90 IIIe 5-CH3 2,84 3,44 12,25 7,47 -9,70 IIIf 5-OCH3 2,23 4,62 22,70 27,25 -9,90 IIIg 7-Cl 2,91 38,35 >100 69,51 -9,60 SAHA 1,44 1,44 5,30 7,04 -7,40 4.3.3 Bàn luận hoạt tính sinh học dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g Các dãy dẫn chất đƣợc tạo từ hai phần cấu trúc khung 3(hydroxyimino)-2-oxoindolin đóng vai trị nhóm nhận diện bề mặt cầu nối mang vòng triazol mạch carbon no với độ dài thay đổi từ 2C-4C Dựa vào chiều dài cầu nối 6C SAHA, luận án thiết kế khoảng cách vịng triazol nhóm chức acid hydroxamic 2C Nhƣng liên kết C=N C-N có độ dài ngắn liên kết C-C nên cầu nối cần dài 2C Do đó, luận án thiết kế thêm dãy dẫn chất Va-g với khoảng cách tăng lên 3C, dãy chất mục tiêu nghiên cứu Cùng với đó, dãy chất VIa-g với khoảng cách 4C đƣợc thiết kể để so sánh kết với dãy Va-g Nhìn chung dãy chất Va-g có hoạt tính ức chế enzym cao dãy VIa-g Một xu hƣớng tƣơng tự đƣợc nhận thấy với khả gây độc tế bào so sánh hai dãy chất Va-g VIa-g Độc tính tế bào dãy IVa-c đặc biệt yếu hẳn so với hai dãy Va-g VIa-g Nhƣ vậy, từ kết thực nghiệm cho thấy, khung 4-methyl-1H-1,2,3-triazol đóng vai trị phần cấu trúc cầu nối mạch alkyl dài 3C phù hợp cho hoạt tính sinh học Bảng 4.3: Kết thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 độc tính tế bào dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g Độc tính tế bào ung Tác dụng Kết thư, IC50 (µM) ức chế docking Chất R LogP HDAC2 (kcal/mol) (IC5i0, µM) SW620 PC3 AsPC-1 IVa H 0,41 29,0 >30 >30 1,70 -7,40 IVb 5-F 0,61 >30 >30 >30 6,24 -7,60 IVc 5-Cl 1,05 >30 >30 >30 2,80 -7,70 Va H 0,90 26,26 >30 26,87 6,16 -7,50 Vb 5-F 1,10 23,64 >30 >30 8,27 -7,70 Vc 5-Cl 1,54 13,46 16,28 11,60 1,72 -7,80 Vd 5-Br 1,79 2,93 6,08 3,01 3,53 -7,80 Ve 5-CH3 1,44 0,73 0,76 0,49 1,28 -8,10 Vf 5-OCH3 0,98 1,61 1,74 1,49 0,91 -7,40 Vg 7-Cl 1,54 10,58 9,27 12,90 5,08 -7,90 VIa H 1,39 >30 >30 >30 4,87 -6,70 VIb 5-F 1,59 >30 >30 >30 26,64 -7,00 VIc 5-Cl 2,03 9,16 4,69 4,51 2,65 -7,10 VId 5-Br 2,28 5,64 3,42 4,43 2,16 -7,00 VIe 5-CH3 1,94 >30 >30 >30 3,52 -7,40 VIf 5-OCH3 1,47 >30 >30 >30 4,15 -7,40 VIg 7-Cl 2,03 >30 >30 >30 4,77 -7,20 SAHA 1,44 3,20 3,70 3,75 1,06 -7,40 4.3.4 Bàn luận hoạt tính sinh học dãy dẫn chất VIIa-g VIIIa-g Khả ức chế HDAC2 đa số chất dãy VIIa-g VIIIa-g tƣơng đƣơng với SAHA Dãy chất VIIIa-g có tác dụng ức chế enzym mạnh so với dãy dẫn chất VIIa-g Về khía cạnh độc tính tế bào, chất mang cầu nối acid hydroxamic hợp phần 1-((1H-1,2,3-triazol4-yl)methyl)-3-hydroxyimino-2-oxoindolin có độ dài 6C (VIIIa-g) có độc tính tế bào cao hẳn so với chất có cầu nối 5C (VIIa-g) Khi so sánh tác dụng sinh học hai dãy VIIa-g, VIIIa-g với ba dãy IVa-c, Va-g, VIag thấy rõ cải thiện khả ức chế HDAC2 nhƣ độc tính tế bào Tuy nhiên, so với kết tác dụng sinh học dãy dẫn chất khác luận án, hai dãy dẫn chất khơng phải chất có tiềm ức chế tế bào ung thƣ mạnh Trong 14 chất hai dãy VIIa-g VIIIa-g, có chất bao gồm VIIIc, VIIId VIIIe thể tác dụng độc tính dịng tế bào thử nghiệm mức dƣới micro mol, nhƣng giá trị tƣơng đƣơng với chất đối chứng dƣơng tính SAHA Bảng 4.4: Kết thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 độc tính tế bào dãy dẫn chất VIIa-g, VIIIa-g Ký hiệu chất R LogP Độc tính tế bào ung thư Ức chế Kết IC50 (µM) HDAC2 docking SW620 PC3 AsPC-1 NCI-H23 (IC50, µM)(kcal/mol) H 1,88 9,80 VIIa 7,49 5,72 10,47 1,77 -7,10 5-F 2,08 11,40 9,04 VIIb 7,12 8,40 1,87 -7,20 5-Cl 2,52 VIIc 7,03 3,74 7,99 12,49 1,06 -7,30 5-Br 2,77 19,74 10,50 14,87 13,74 VIId 0,93 -7,30 5-CH 2,43 VIIe 14,13 7,94 9,13 8,67 1,06 -7,60 5-OCH3 2,77 13,87 8,47 VIIf 6,01 13,69 1,96 -7,00 7-Cl 2,52 VIIg 43,31 15,68 16,59 32,20 6,15 -7,40 H 2,37 9,19 VIIIa 6,23 5,43 11,07 0,93 -7,80 5-F 2,57 VIIIb 7,47 10,21 7,42 13,60 1,41 -7,10 5-Cl 3,02 3,64 VIIIc 4,15 3,25 5,06 1,09 -7,80 5-Br 3,26 VIIId 3,00 2,47 2,62 3,61 1,23 -7,20 VIIIe 5-CH3 2,92 2,52 1,95 3,15 2,10 0,75 -7,50 5-OCH 2,45 VIIIf 7,71 4,54 3,67 5,67 1,42 -7,90 7-Cl 3,02 9,15 VIIIg 7,87 5,54 5,61 1,14 -7,30 SAHA 1,44 3,20 3,70 3,75 3,18 1,06 -7,40 4.3.5 Bàn luận hoạt tính sinh học dãy dẫn chất IXa-g Xa-c So sánh với kết hoạt tính sinh học hai dãy VIIa-g VIIIa-g, hai dãy dẫn chất IXa-g, Xa-c có độc tính tế bào mạnh dòng tế bào ung thƣ SW620, PC-3 AsPC-1 Trong hai dãy chất này, có chất (IXc, g, Xa-c) thể độc tính mạnh SAHA, chất (IXd, f) thể độc tính tƣơng đƣơng SAHA, chất cịn lại thể độc tính yếu SAHA không nhiều Đáng ý, với dãy dẫn chất chất nhóm hút hay đẩy electron vị trí nhóm ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính kháng ung thƣ chất (khi so sánh IXb-g với IXa, so sánh Xb-c với Xa) Có khác biệt ảnh hƣởng vị trí nhóm dãy chất IXa-g so với dãy VIIa-g, VIIIa-g Trong dãy dẫn chất nhóm Cl (chất IXg) gắn vị trí số giúp gia tăng hoạt tính sinh học nhiều gắn vị trí số Chất IXg chất có độc tính tế bào mạnh dãy, mạnh 5-6 lần so với SAHA bốn dòng tế bào thử nghiệm (IC50 = 0,62 đến 0,83 µM so với IC50 SAHA từ 3,18 đến 3,75 µM) Bảng 4.5: Kết thử tác dụng ức chế HDAC2 độc tính tế bào dãy dẫn chất IXa-g Xa-c Độc tính tế bào ung thư Tác dụng IC50 (µM) ức chế Kết Chất R LogP HDAC2 docking IC50, µM kcal/mol NCISW620 PC3 AsPC-1 H23 H 2,45 7,59 8,01 IXa 4,39 6,21 1,33 -9,70 5-F 2,65 IXb 7,28 5,68 5,39 5,30 1,30 -9,90 5-Cl 3,09 2,31 2,40 IXc 2,44 2,14 5,53 -9,80 5-Br 3,34 IXd 3,46 5,64 4,54 3,65 2,42 -9,50 IXe 5-CH3 2,99 5,19 3,37 4,09 4,23 1,79 -9,70 5-OCH 2,53 IXf 3,04 3,74 4,48 3,78 2,26 -9,60 7-Cl 3,09 0,65 0,83 IXg 0,59 0,62 1,29 -9,10 H 2,42 1,02 1,39 Xa 1,30 1,85 0,81 -9,40 5-F 2,62 1,58 1,22 Xb 1,51 1,20 0,60 -9,60 5-Cl 3,07 Xc 0,34 0,41 0,62 1,11 1,86 -9,48 SAHA 1,44 3,20 3,70 3,75 3,18 1,06 -7,40 Trong dãy Xa-c, chất Xc mang nhóm Cl vị trí 5, thể hoạt tính kháng tế bào ung thƣ tƣơng đƣơng với IXg Đặc biệt chất Xc thể độc tính mạnh gấp khoảng 10 lần so với SAHA chất mạnh tất dãy chất tổng hợp đƣợc Tổng hợp kết thu đƣợc dãy tổng hợp chƣa đủ để phác thảo mối liên hệ độc tính tế bào chất khả ức chế enzym HDAC2 chúng, vài yếu tố đƣợc tìm hiểu Tuy nhiên, đa số kết ủng hộ cho giả thiết ức chế HDAC2 chế bật khả gây độc tế bào chất gợi ý ức chế số HDAC khác có đóng góp quan trọng độc tính tế bào tổng chất Để kiểm tra giả thiết này, luận án chọn chất đại diện Xc để tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả ức chế loại HDAC khác gồm HDAC1, Kết cho thấy, khả ức chế HDAC1 Xc cao gấp khoảng 10 lần so với khả ức chế HDAC2 (IC50 với HDAC1 0,19 µM so với HDAC2 có IC50 1,86 µM) SAHA ức chế HDAC1 yếu Xc khoảng lần (IC50 0,35 µM) Trong đó, khả ức chế HDAC6 HDAC8 Xc SAHA tƣơng đƣơng (IC50 Xc lần lƣợt 0,25 1,21 µM, IC50 SAHA 0,41 1,65 µM) Chất IXg có cấu trúc tƣơng tự chất Xc độc tính tế bào tế bào ung thƣ tƣơng đƣơng, sở để giả thiết khả ức chế HDAC khác IXg tƣơng tự Xc Bảng 4.6: Kết thử tác dụng ức chế loại enzym HDAC khác Xc Tác dụng ức chế enzym (IC50, µM) Chất HDAC1 HDAC2 HDAC6 HDAC8 Xc 0,19 1,86 0,25 1,21 SAHA 0,35 1,06 0,41 1,65 Nhằm thăm dò khả phát triển chất, luận án tiến hành đánh giá độc tính tế bào thƣờng chất đại diện IXg, Xa-c Thử nghiệm độc tính tế bào thƣờng đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp SRB tế bào phổi MRC-9 Kết đƣợc trình bày Bảng 4.7 giá trị IC50 chất thử nghiệm dòng tế bào thƣờng MRC-9 tỷ lệ đánh giá độ chọn lọc tế bào ung thƣ (SW620, PC3, AsPC-1, NCI-H23) so với tế bào thƣờng MRC-9 Kết cho thấy ba dòng tế bào ung thƣ (SW620, PC3, AsPC-1), bốn chất thể độc tính tế bào ung thƣ nhiều tế bào thƣờng với độ chọn lọc từ 1,32 đến 3,79 lần Trên dòng tế bào ung thƣ phổi MRC-9, IXg Xb độc tế bào thƣờng tế bào ung thƣ từ đến lần Chỉ có chất Xa Xc thể độc tính tế bào ung thƣ MCR-9 tƣơng đƣơng với độc tính tế bào thƣờng Trong đó, SAHA thể mức độ độc tính chọn lọc với dịng tế bào ung thƣ so với tế bào phổ thƣờng tƣơng đối hạn chế, giá trị độ chọn lọc dao động từ 1,19 đến 1,40 lần Bảng 4.7: Kết thử tác dụng độc tính tế bào thường số chất Chỉ số so sánh độc tính tế Ký Độc tính hiệu MRC-9 R bào ung thư với tế bào thường * SW620 PC3 AsPC-1 NCI-H23 chất (IC50, µM) 7-Cl 1,79 2,76 2,17 3,03 2,89 IXg H 1,83 1,79 1,32 1,40 1,00 Xa 5-F 2,44 1,54 2,00 1,62 2,03 Xb 5-Cl 0,92 2,71 2,24 1,48 0,83 Xc 4,46 1,39 1,21 1,19 1,40 SAHA Ghi chú: * Chỉ số so sánh tính tỷ lệ IC 50 tế bào MRC-9 IC50 tế bào ung thư (SW620, PC3, AsPC-1, NCI-H23) chất Từ kết sinh học thu đƣợc, chất IXg Xc cho thấy có nhiều tiềm với khả ức chế HDAC mạnh, độc tính tế bào cao độ chọn lọc tế bào ung thƣ so với tế bào thƣờng cao Đặc biệt, Xc có độc tính tế bào dịng tế bào SW620 gấp khoảng 10 lần so với SAHA Nhận định thay đổi cấu trúc yếu tố lớn định đến việc mở rộng hoạt tính sinh học chất Luận án định nghiên cứu mơ hình liên kết hai chất đại diện IXg Xc với HDAC khác đƣợc đánh giá khả ức chế trƣớc HDAC1, 2, Luận án tổng hợp đƣợc 10 dẫn chất acid hydroxamic dãy IXa-g Xa-c có tác dụng ức chế HDAC2 mạnh độc tính tốt dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm Kết thu đƣợc, lần khẳng định khung 3-hydroxyimino/methoxyimino-2-oxoindolin nhóm nhận diện bề mặt tốt cho acid hydroxamic hƣớng ức chế HDAC Cùng với đó, nhóm khác vòng benzen khung 3-hydroxyimino/ methoxyimino2-oxoindolin vị trí nhóm có ảnh hƣởng để hoạt tính ức chế enzym nhƣ độc tính tế bào chất tổng hợp đƣợc Bằng phƣơng pháp áp dụng hƣớng tiếp cận nghiên cứu phát triển thuốc đại nhƣ thử nghiệm tính ức chế chọn lọc, chất Xc đƣợc xác định có khả ức chế HDAC1, HDAC2, HDAC8 (nhóm I) HDAC6 (nhóm IIb) tƣơng đƣơng tốt SAHA Cuối nghiên cứu ADME in silico dự đoán hai chất đại diện IXg Xc có độ hấp thụ phân bố phù hợp Tuy nhiên, số dự đốn chuyển hố độc tính nhiều vấn đề cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu tối ƣu hoá KẾT LUẬN: a Về tổng hợp khẳng định cấu trúc Đã tổng hợp đƣợc 62 chất acid hydroxamic mới, 62 chất chƣa đƣợc công bố tài liệu trƣớc Các chất tổng hợp đƣợc có cấu trúc đƣợc chia làm nhóm chính: + Nhóm thứ gồm 21 chất dãy Ia-g, IIa-g, IIIa-g: chất có cấu trúc 2-oxoindolin hợp phần nhóm nhận diện bề mặt phần cầu nối giống khung cinnamamid + Nhóm thứ hai gồm 31 chất dãy IVa-c, Va-g, VIa-g, VIIa-g, VIIIa-g: chất có nhóm nhận diện bề mặt khung 3-hydroxyimino-2oxoindolin phần cầu nối mang khung 1,2,3-triazol kết hợp với mạch alkyl có độ dài thay đổi từ 2C đến 6C + Nhóm thứ ba gồm 10 chất dãy IXa-g, Xa-c: chất có nhóm nhận diện khung 2-oxoindolin kết hợp với vịng 1,2,3-triazol qua nhóm methylen phần cầu nối khung cinnamamid Tất chất tổng hợp đƣợc có cấu trúc nhƣ thiết kế, đƣợc chứng minh phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC HSQC b Về tác dụng sinh học Các chất đƣợc đánh giá tác dụng ức chế enzym HDAC phƣơng pháp Western blot (dãy I-III) xác định nồng độ ức chế 50% hoạt tính HDAC2 phƣơng pháp định lƣợng huỳnh quang Ngoại trừ chất IIg, IIIg (không thể tác dụng ức chế nồng độ µg/ml), chất Ic, Ig, IId, IIe, IIIf (thể tác dụng yếu) chất IVb, Va, Vb, Vd, Vg, VIa-b, VIe-g, IXc có giá trị IC50/HDAC2 > µM, 43 chất cịn lại có tác dụng ức chế enzym tƣơng đƣơng với SAHA Tất chất đƣợc thử độc tính tế bào theo phƣơng pháp SRB - dòng tế bào ung thƣ Kết cho thấy ngoại trừ dãy IVa-g VIa-g có độc tính tế bào yếu, dãy chất cịn lại có độc tính tế bào tốt Dãy chất Ia-g Xa-c có độc tính tế bào tất chất dãy mạnh SAHA Chất Xc thể khả kháng tế bào ung thƣ mạnh nhất, có IC50 thấp SAHA từ đến lần dịng tế bào khác Chất Xc có tác dụng bật nên đƣợc lựa chọn để nghiên cứu sâu cách định nồng độ ức chế 50% hoạt tính loại HDAC khác HDAC1, Sau đó, chất Xc với chất IXg, Xa, Xb đƣợc thử nghiệm độc tính tế bào thƣờng Kết cho thấy, chất có xu hƣớng gây độc chọn lọc tế bào ung thƣ tế bào thƣờng Tóm lại, luận án hoàn thành mục tiêu đề đóng góp kết lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thƣ theo hƣớng ức chế enzym HDAC Các kết thu đƣợc chứng minh khung 2-oxoindolin phù hợp để làm nhóm nhận diện bề mặt có tiềm phát triển để tạo chất ức chế HDAC có hoạt tính mạnh KIẾN NGHỊ Khung 2-oxoindolin khơng dùng độc lập mà kết hợp với vòng 1,2,3-triazol mang lại hiệu sinh học tốt Vì vậy, việc mở rộng nhóm nhận diện bề mặt cách kết hợp khung 2-oxoindolin với số vòng thơm hay dị vịng khác tạo đƣợc chất có tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào mạnh Đây hƣớng phát triển triển khai có tiềm mang lại kết tốt Bên cạnh đó, 62 acid hydroxamic tổng hợp đƣợc, chất Xc thể tác dụng sinh học khả quan nhất, chất đƣợc dự đoán có thơng số dƣợc động học phù hợp cho việc phát triển thành thuốc Vì vậy, hƣớng nghiên cứu tiến hành thử nghiệm mức độ sinh học phân tử nhằm tìm chế gây độc chất Xc từ định hƣớng phát triển để tìm ứng viên tốt DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Đỗ Thị Mai Dung, Phan Thị Phương Dung, Nguyễn Thị Thuận, Đào Thị Kim Oanh, Nguyễn Hải Nam (2015) Tổng hợp thử độc tính tế bào số N-hydroxypropenamid mang khung 3-hydroxyimino-2oxoindolin Tạp chí Nghiên cứu Dược Thông tin thuốc, Tập 6, số 6/2015, tr 21-26 Đỗ Thị Mai Dung, Phan Thị Phương Dung, Đào Thị Kim Oanh, Nguyễn Hải Nam (2016) Tổng hợp thử độc tính tế bào số dẫn xuất acrylamid mang khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin, Tạp chí Nghiên cứu Dược Thơng tin thuốc, Tập 7, số 4+5/2016, tr 103-108 Do Thi Mai Dung, Phan Thi Phuong Dung, Dao Thi Kim Oanh, Tran Khac Vu, Hyunggu Hahn, Byung Woo Han, Minji Pyo, Young Guk Kim, Sang-Han Bae, Nguyen-Hai Nam (2017) Exploration of novel 5′(7′)-substituted-2′-oxospiro [1,3]dioxolane-2,3′-indoline-based Nhydroxypropenamides as histone deacetylase inhibitors and antitumor agents, Arabian Journal of Chemistry, Volume 10 issue 4, pp 465-472 Do Thi Mai Dung, Pham-The Hai, Duong Tien Anh, Le-Thi-Thu Huong, Nguyen Thi Kim Yen, Byung Woo Han, Eun Jae Park, Yeo Jin Choi, Jong Soon Kang, Van-Thi-My Hue, Sang-Bae Han, Nguyen-Hai Nam (2018) Novel hydroxamic acids incorporating 1-((1H-1,2,3Triazol-4-yl)methyl)-3-hydroxyimino-indolin-2-ones: synthesis, biological evaluation, and SAR analysis, Journal of Chemical Sciences, Volume 130, issue Do Thi Mai Dung, Nguyen Van Huan, Do Manh Cam, Dao Cam Hieu, Pham The Hai, Le Thi Thu Huong, Jisung Kim, Jeong E Choi, Jong S Kang, Sang-Bae Han,, Nguyen Hai Nam (2018) Novel Hydroxamic Acids Incorporating 1-((1H-1,2,3-Triazol-4-yl)methyl)-3substituted-2- oxoindolines: Synthesis, Biological Evaluation and SAR Analysis, Medicinal Chemistry, Volume 14, issue 8, pp 831-850 * Các chất luận án đăng ký quyền Hàn Quốc gồm: - “Novel 3-Substituted-2-Oxoindoline-Based N-hydroxy propenamides Having Activity of Inhibiting Histone Deacetylase and Antitumor Composition Comprising the Same”, Korea patent No 1020140158323, 61 trang - “Novel Hydroxamic Acids and Uses Thereof”, Korea patent 1020160175023, 63 trang - “Novel 3-Substituted-2-Oxoindoline-Based Hydroxamic Acids Compound”, Korea patent No 1020170075124, 64 trang ... Đề tài ? ?Tổng hợp thử tác dụng sinh học số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” đƣợc tiến hành với mục tiêu Mục tiêu luận án Tổng hợp đƣợc khoảng từ 30 đến 40 acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin... 2-oxoindolin Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase tác dụng kháng số dòng tế bào ung thƣ dẫn chất tổng hợp đƣợc Những đóng góp luận án Về thiết kế tổng hợp acid hydroxamic Luận án thiết kế tổng hợp. .. thiết kế tổng hợp đƣợc 62 acid hydroxamic mới, cấu trúc chƣa đƣợc cơng bố tài liệu trƣớc Về thử tác dụng sinh học Thử tác dụng ức chế enzym: 21 chất dãy I-III đƣợc thử tác dụng ức chế HDAC phƣơng