Đây là một phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, chúng tôi nghiên cứu cố định vi khuẩn trên natri aginate để nghiên cứu thơi gian bảo quản chủng vi sinh vật. Sau đó dùng chủng vi sinh vật đã bảo quản để sản xuất nước cà chua lên men.
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM TRÊN NATRI ALGINATE IMMOBILIZING LACTOBACILLUS PLANTARUMBACTERIA ON SODIUM ALGINATE SVTH:Đinh Thị Tú Uyển – Phan Phước Duy Lớp 10HTP, Khoa Công nghệ Hóa học, Trường Cao đẳng Cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng GVHD: ThS Ngô Thị Minh Phương Khoa Công nghệ Hóa học, Trường Cao đẳng Cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng TÓM TẮT Cố định vi khuẩn chất mang natri alginate có nhiều ưu điểm vượt trội so với phương pháp bảo quản khác: Khả sống sót tế bào cố định, tăng cường ổn định bào tử chống lại số điều kiện hóa lí, phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có nhiều lợi ích cịn đuộc xem probiotic giúp cân hệ sinh thái 1đường ruột ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe người Nghiên cứu nhằm mục đích khảo sát khả sống sót vi khuẩn Lactobacillus plantarum natri alginate ứng lên men nước cà chua tạo sản phẩm probiotic Kết nghiên cứu cho thấy: Mật độ vi khuẩn Lactobacillus plantrum sau ba tháng cố định chất mang natri alginate 1,1.107 tế bào, bảo quản nhiệt độ thường, hoạt lực vi khuẩn so với lúc trước cố định thay đổi không đáng kể, đồng thời tạo sản phẩm có bổ sung probiotic làm đa dạng hóa sản phẩm thị trường tốt cho sức khỏe Từ khóa: Probiotic, cố định, natri alginate,, Lactobaccillus plantarum, nước cà chua ABSTRACT The immobilized bacteria on sodium alginate have more advantages than other preservation methods: Survivability of immobilized cells, strengthening the stability of the spores and against a number of conditions of physicochemical, the simple method, easy to implement, low cost Lactobacillus plantarum has many benefits Moreover, it is also considered as a probiotic to help balance the intestinal ecology influencing on human health This study aims to examine the survivability of Lactobacillus plantarum on sodium alginate and in fermenting tomato juice to create probiotic products The research results showed that the density of Lactobacillus plantarumbacteria fixed after three months on sodium alginate is 1,1.10 cells/ml, storing at room temperature, bacterial motility compared with not immobilized bacteria no change significantly Besides, it also creates new products with adding probiotic to diversify the product in the market and good for health Key words: Probiotic, the fixed, Streptococcus, Lactobaccillus plantarum, tomato juice ĐẶT VẤN ĐỀ giống vi sinh vật như: phương pháp cấy truyền, đông khơ, lạnh sâu….Trong phương pháp đơng khơ sử dụng phổ biến Giống bảo quản phương pháp đơng khơ giữ 10-20 năm Song phương pháp có nhược điểm: giá thành cao, lấy giống sử dụng lượng giống Bảo quản giống vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm tảng cho nghiên cứu ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: Sinh học, y học, nơng nghiệp, thực phẩm… Hiện có nhiều phương pháp để bảo quản giữ lại dễ bị tạp nhiễm Vì cơng tác bảo quản giữ giống ln địi hỏi cải tiến để tìm phương pháp tối ưu Đề tài:“Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillusplantarum natri aginate” đáp ứng yêu cầu N: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu C: tổng số khuẩn lạc đếm hộp petri chọn ni:số hộp petri cấy độ pha loãng thứ i di: hệ số pha loãng tương ứng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU V (ml): thể tích dung dịch mẫu cấy cào đĩa petri 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.3 Phương pháp hóa sinh Vi khuẩn lactobacillus plantarum hoạt hóa từ ống giống lấy từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ Thực phẩm – Khoa Cơng nghệ Hóa học – Trường Cao đẳng Cơng nghệ Đà Nẵng - Khảo sát khả lên men lactic giống trình bảo quản Chuẩn bị bình tam giác 250ml bao gói trùng nhiệt độ 121 0C thời gian 30 phút Sau lấy bình tam giác, thêm vào 100ml sữa tươi, 15 hạt aginate cố định giống chưa qua thời gian bảo quản Sau sau 24h, 48h, 72h, 96h ta đo hàm lượng axit lactic sinh Tiến hành tương tự sau tháng ta tiến hành đo hàm lượng axit lactic sinh hạt alginate có cố định vi khuẩn L.plantarum Cà chua ép lấy nước 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh a Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn Lactobacillus plantarum Giống vi khuẩn lactobacillus plantarum Pha loãng Hoạt hóa Cấy truyền ống thạch nghiêng Định lượng axit lactic sinh sau : Bảo quản giống Lấy 10ml mẫu cần xác định hàm lượng axit lactic, cho vào bình tam giác 100ml, thêm vào 2-3 giọt chất chỉ thị màu phenolphtalin 1% Chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N Ghi nhận kết thể tích dung dịch NaOH 0,1N chuẩn độ b Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc phát triển môi trường thạch Cách tiến hành xác định: Dùng đĩa petri pha loãng bảo quản tủ ấm nhiệt độ 27-280C, sau thời gian ngày ta lấy nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa petri đó, tiền hành đếm khuẩn lạc mắt thường Ghi số lượng khuẩn lạc đếm - Số lượng tế bào vi khuẩn 1ml mẫu tính theo công thức sau: N (CFU / ghayCFU / ml ) Công thức tính hàm lượng axit tổng sau: Trong đó: v:thể tích NaOH tiêu tốn chuẩn mẫu thử C ( n1 vd ni vd i ) k: hệ số acid ( lactic = 0,009) Trong đó: 1000 hệ số tính g/l n: độ pha loãng V: thể tích mẫu thử 2.4 Cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum natri alginate với dung dịch natri aginate, CaCl pha sẵn với nồng độ định Thanh trùng nhiệt độ 1210C, thời gian 30 phút Sau lấy ra, làm nguội tiến hành tương tự sơ đờ hình 2.4.1 Khảo sát nồng độ natri alginate và CaCl2 Pha chế dung dich natri aginate CaCl2 nhiều nồng độ khác để lựa chọn nồng độ natri aginate CaCl2 thích hợp cho việc tạo hạt Cách tiến hành sau: 2.4.3 Khảo sát khả tồn tại của vi khuẩn Lactobacillus plantarum natri aginate thời gian bảo quản + Pha chế dung dịch natri aginate loại nồng độ: 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4% - Khảo sát mật độ tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum trước bảo quản + Pha chế dung dịch CaCl2 loại nồng độ: 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5 %, 3%, 3,5% Lấy hạt natri alginate vừa tạo hạt xong, ngâm ống nghiệm chứa ml nước cất qua trùng thời gian 40 phút tiến hành pha loãng mẫu từ 10-1 đến 10-8 Tiến hành cấy trải đĩa petri để xác định tế bào ban đầu cách đếm số khuẩn lạc tạo thành 2.4.2 Tạo hạt vi gói cố định vi khuẩn lactobacillus plantarum Qua bước khảo sát nồng độ, alginate CaCl2 ta chọn nờng độ thích hợp để tạo hạt vi gói Sau sau ngày, 14 ngày, 30 ngày, tháng, tiến hành kiểm tra giống lần tương tự natri alginate CaCl2 2.5 Phương pháp vật lí Xác định số lượng tế bào biểu Hạt cacilum alginate kiến vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn cố định plantarum phương pháp đo mật độ quang OD máy quang phổ UV Vis 2.6 Quy trình thử nghiệm sản xuất nước cà chua lên men tạo sản phẩm probiotic Hình Sơ đờ tạo gel alginate Ta tiến hành bao gói pipet, trùng Nguyên liệu Phân loại Rửa Thu hồi dịch Thanh trùng, 1210C Phối chế Vi khuẩn L.p Đường + nước Lên men Lọc Thang trùng, 600C Thành phẩm Hình Quy trình sản xuất nước cà chua lên men KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN sữa, bóng, mặt lời bám chặt 3.1 Hoạt hóa chủng vi Lactobacillus plantarum Sau quan sát hình dạng khuẩn lạc kính hiển vi chúng tơi nhận thấy khuẩn lạc có hình que, xếp chuỗi Hình Khuẩn lạc mơi trường phân lập khuẩn Phân lập vi sinh vật trình tách riêng loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu đưa dạng Từ kết nghiên cứu tài liệu tham khảo chúng khẳng định chủng vi khuẩn Lactobacillus plantrum cần phân lập Sau phân lập hai chủng khiết chúng khiết Sau q trình phân lập chúng tơi thu khuẩn lạc riêng rẽ, khiết ghi lại (Hình 3) Đặc điểm khuẩn lạc: Hình trịn, màu trắng Hình 4.Giữ giống tơi tiến hành cấy chuyền sang ống nghiệm để tiến hành bảo quản giữ giống (Hình 4) khơng đổi, lượng chất dần hết lượng axit sinh ngày ít 3.1 Khảo sát sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus plantrum phương pháp đo mật độ quang (OD) máy quang phổ UV – Vis Từ ta thấy hàm lượng axit lactic sinh trình lên men tương đối lớn Theo nghiên cứu sinh viên Phạm Thị Hoa, lớp 09HTP - Khoa Cơng nghệ Hóa học - Trường Cao đẳng Công nghệ - Đại học Đà Nẵng xây dựng đường cong tốc độ sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus plantarum Qua kết chúng thu nhận kết quả: Sau 48 giờ nuôi cấy sinh khối vi khuẩn đạt cực đại, ta lấy mẫu mang cố định khoảng thời gian 45 giờ sau nuôi cấy lúc sinh khối vi khuẩn cịn non trẻ đạt mức cao 3.2 Khảo sát hoạt lực sinh axit lactic vi khuẩn Lactobacillus plantarum Chuẩn bị bình tam giác chứa 100ml sữa, cho dung dịch vi khuẩn có mật độ 109 tế bào vào cho lên men Kiểm tra hoạt lực sau 96h cách chuản độ dung dịch dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalin 1% Từ kết thí nghiệm ta rút nhận xét: Hàm lượng axit sinh ngày thứ nhất, thứ ,3 tăng nhanh, đặc biệt sau 48h hàm lượng axit sinh 7,5% ngày thứ tăng chậm Hình 5.Hoạt lực vi khuẩn Nguyên nhân lượng vi sinh ngày nhiều lượng chất lại 3.3 Khảo sát nồng độ natri alginate CaCl2 trình tạo hạt Bảng Bảng tổng hợp kết khảo sát nồng độ natri aginate Đặc điểm Nồng độ natri alginate(%) 1,5 Khả Tạo hạt tạo mềm hạt dễ bị co rút Hình Hạt bị vỡ Hạt hình dạng cầu, co rút Mềm 2,5 Tạo tốt Hình cầu Hình cầu Cấu trúc hạt Mềm Mềm, Hạt bị vỡ Mềm, hạt Tạo tốt 3,5 hạt Rắn Hình cầu Hình dạng không xác định Mềm Rắn rắn Rắn Hình dạng khơng xác định Rắn Bảng Bảng tổng hợp kết khảo sát nồng độ natri aginate 0,5 Hạt vỡ Khả tạo hạt Cấu Hạt vỡ trúc hạt Nồng độ CaCl2(%) 1,5 2,5 Tạo hạt Tạo hạt Tạo hạt Tạo hạt Tạo hạt trung tốt tốt tốt tốt bình Tạo gel Mềm Mềm Mềm Rắn mềm chắc 3,5 Tạo tốt hạt Rắn Từ kết thu nhận cho thấy: - Nồng độ natri alginate ảnh hưởng đến khả tạo hạt gel cố định + Nờng độ natri alginate q thấp khơng có khả tạo hạt, từ nồng độ - 1,5% khả tạo hat, hạt mềm dễ vỡ + Từ nồng độ 2-2,5% khả tạo hạt tốt, hạt có hình cầu đặc trưng Bắt đầu từ 3,5% hạt gel tạo thành cứng, rắn, đờng thời hình dạng hạt khơng xác định, khơng cịn hình cầu đặc trưng hạt gel cố định Ta chọn nờng độ 3% theo số tài liệu tham khảo tài liệu nghiên cứu cho thấy hạt cứng khả khuếch tán chất vào hạt tế bào trình lên men tế bào cố định Nhưng hạt tạo bền, khả bảo vệ tế bào cố định khỏi tác động bên ngồi tốt Nên ta chọn nờng độ natri alginate 3%.Ở nờngđộ hạt vừa có hình cầu, hạt chỉ rắn nên vừa có khả bảo vệ tế bào tốt, khuếch tán chất trình lên men tương đối tốt so với hạt gel có cấu trúc q cứng.Nếu chọn nờng độ % hạt mềm khả khuếch tán trình lên men tốt khả bảo vệ hạt lại Tương tự hạt có nờng độ natri alginate lớn, hạt cứng Từ kết ta chọn nồng độ natri ainate thích hợp 3% - Nồng độ CaCl2 ảnh hưởng đến khả tạo hạt, CaCl2 có tác dụng giữ phân tử alginate lại với tạo CaCl2 nồng độ 0,5% hạt bịvỡ, khơng có khả tạo hạt, từ 1,5 – 2,5 % khả tạo hạt tốt, hạt mềm chắc, từ 3-3,5% hạt có xu hướng rắn Từ kết ta chọn nồng độ CaCl2 1,5% Tương tự ảnh hưởng nồng độ natri alginate Đối với nồng độ CaCl2 từ 1,5 -2,5% tạo hạt mềm chắc, nồng độ cao hạt cứng ảnh hưởng đến khả khuếch tán chất trình lên men Trong nồng độ CaCl2 từ 1,5 -2,5 % ta chọn 1,5 % vừa tạo cấu trúc hạt mềm vừa tiết kiệm lượng hóa chất sử dụng 3.4 Tảo hảt vi gọi cäú âënh vi khøn Lactobacillus plantarum Chuẩn bị dung dịch natri alginate nồng độ 3%, dung dịch CaCl nồng độ 1,5% Song song ta chuẩn bị dịch tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum với mật độ 109 tế bào/ml( mật độ xác định cách đo mật độ quang rồi tính công thức tính số lượng tế bào biểu kiến Số lượng tế bào biểu kiến/ml tính thơng qua mật độ quang học OD phương trình sau: X= 2,5x10 0,3 OD X: Số lượng tế bào biểu kiến /ml OD: giá trị mật độ quang học đo bước sóng 600nm (cơng thức tham khảo theo (Morohoshi & Kimura, 2002) Sau ta cho vi khuẩn chuẩn bị vào dung dịch CaCl2 trộn Tiếp theo ta tiện hành tạo Hình Hạt gel cố định hạt phương pháp nhỏ giọt Hạt sau tạo thành lấy nước sau đưa vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 380C, sấy khối lượng không đổi ta lấy đưa bảo quản Ta chọn nhiệt độ sấy 380C vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc loại vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng phát triển 35-40 0C Vì ta chọn nhiệt độ sấy 380C không làm vô hoạt vi khuẩn vừa rút ngắn thời gian sấy Từ kết thu nhận chúng thấy rằng: Vi khuẩn Lactobacillus plantarum sau cố định natri alginate có dạng hình cầu, tiện lợi cho bảo quản sử dụng sau 3.6 Kho sạt kh nàng täưn tải ca vi khøn Lactobacillus plantarum trãn natri aginate thåìi gian bo qun Sau tuần Sau tháng Hình Mật độ vi khuẩn trình bảo quản Kiểm tra khả sống sót chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang natri alginate cách gieo mẫu môi trường dinh dưỡng thích hợp quan sát sinh trưởng phát triển khuẩn lạc đĩa petri Kết kiểm tra ghi nhận lại (Hình 8) (Hình 9) Từ sơ đờ (Hình 9) ta thấy: Số lượng tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum sống sót cao Sau tháng bảo quản tỷ lệ sống sót Hình Mật độ tế bào mức cao1,1.107tế bào/ml Từ kết thu nhận chúng rút rađược nhận xét: Phương pháp cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum chất mang natri alginate, bảo quản nhiệt độ thường 300C có tỉ lệ sống sót vi khuẩn cao, hạt cố định có dạng hình cầu dễ bảo quản, sử dụng tránh tác động điều kiện hóa lí Điều chứng tỏ giống bảo quản theo phương pháp vừa mang lại hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện, vừa dễ dàng áp dụng vào thực tế Giống vi khuẩn cố định natri alginate có tỷ lệ sống sót cao do: Khi cho natri alginate kãút håüp våïi ion Ca2+ s tháúy xút cạc hiãûn cạc phán vng tỉí näúialginate giỉỵa mỷt vaỡ taỷo gel theo mọ hỗnh hồỹp trổùng õóứ hỗnh thaỡnh haỷt gel cỏửn coù mọỹt cồ chóỳ, lión kãút giỉỵa hai hay nhiãưu chùi alginate Chøi phán tỉí alginate cọ cạc nãúp v khe håí m ion Ca2+ cọ thãø chui vo âënh vë liãn kãút cạc ion Ca2+ liãn kãút caïc phân tử alginate lại với thành chuỗi alginate, làm cho chuổi alginate trở nên bền Vi khuẩn Lactobacillus plantarum hòa vào dung dịch CaCl2 theo mà chui vào khe hở cố định đó, nhờ mà hạt gel giữ nhiều tế bào vi khuẩn, bên ngồi có lớp bảo vệ làm cho tế bào tránh tiếp xúc với mơi trường bên ngồi nên vi khuẩn bảo quản thời gian dài mà 3.5 Khảo sát khả nàng lên men lactic giống trình bảo quản Chuẩn bị bình tam giác chứa 100 ml sữa tươi, thêm vào hạt gel cố dịnh tuần Sau 24h ,48h ,72h, 96h Kiểm tra hoạt lực vi khuẩn cách cách: Lấy 10ml mẫu huẩn độ dung dịch NaOH 0,1N, có chỉ thị phenolphtalin Sau tháng lại thiến hành kiểm tra lại tháng cuối Ta thu biểu đờ hình Từ biểu đờ ta rút nhận xét: So với mẫu trước bảo quản (Hình 5) hoạt lực vi khuẩn Lactobacillus khuẩn sau plantarum cố định 3có tháng giảm (8,28%), tếkhông bào lên menkể.tự sau 96h(8,8%) đáng tương Đối đối lớn không lệch với tế bào sauquá chênh cố dịnh Điều tháng hoạt lực chứng tỏ thời gian bảosinh quảnrađãsau làm ảnh hưởng đến hoạt lực axit vi khuẩn, 24h (2,7%) vi khuẩn bị ức chế điều kiện bảo quản Trong 24 giờ đầu vi khuẩn cần ít so với tếthời bàogian lên để menhoạt hoá lại Lúc vi khuẩn có thời tựchưa sau 24h gian để thích nghi với môi trường lên men (4,32%) Sau 967.giờ thìlựcvicủa khuẩn sau thời gian Hình Hoạt vi khuẩn(%) bảo quản hoạt hoá lại thích nghi với Nhưng sau 96h lên men hoạt lực vi môi trường nên hoạt lực lên men mẫu Như vậy, điều kiện bảo quản nhiệt độ thường, q trình bảo quản khơng ảnh hưởng đến hoạt lực vi khuẩn Lactobacillus plantarum Từ ta rút kết luận: Bảo quản theo phương pháp làm cho hoạt lực vi khuẩn cố định tương đối ổn định sau tháng bảo quản.Nguyên nhân làm cho hoạt lực vi khuẩn giữ ổn định do: Sau tế bào vi khuẩn cố định hạt gel, hạt gel tạo thành mạng lưới bao quanh tế bào Cấu trúc hạt gel tạo thành lỗ xốp, thuận tiện cho viêc khuếch tán chất sản phẩm khỏi hạt gel (sau 96h hoạt lực axit tăng lên) Bằng cách ta dễ dàng khống chế phản ứng, tách sản phẩm khỏi bình phản ứng cách dễ dàng Xung quanh tế bào vi khuẩn lớp gel bảo vệ nên hoạt lực vi khuẩn ổn định thời gian bảo quản 3.6 Ứng dụng sản xuất nước cà chua lên men tạo sản phẩm probiotic 3.6.1 Khảo sát hàm lượng axit lactic sinh các lần tái sử dụng Sử dụng giống qua bảo quản tháng để lên men nước cà chua Sau tạo thành sản phẩm nước cà chua lên men ta tiến hành xác định hàm lượng axit lactic tạo thành sản phẩm, hàm lượng axit tạo thành qua lần tái sử dụng sau: Lấy 10ml dung dịch nước cà chua lên men cho vào bình tam giác, thêm giọt phenolphatlin 1%, chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N dung dịch chuyển sang màu hồng bền phút ta kết (Hình 9).Từ sơ đờ (Hình 9) ta rút nhận xét: Hàmlượng axit sinh lần tái sử dụng có thay đổi Hàmlượng axit tăng sau lần tái sử dụng - Sau 24h hàm lượng axit sinh ít, sau 96h hàm lượng axit sinh nhiều hàm lượng axit tăng chậm Nguyên nhân 24h đầu giống vi khuẩn cần phải có thời gian để hoạt hóa, sau 96h vi khuẩn thích nghi với điều kiện lên men nên hàm lượng axit sinh nhiều hơn, hàm lượng axit tăng - chậm lượng chất ít dần Hình 10 Hàm lượng axit (%) Hàm lượng axit lactic qua lần sử dụng có xu hướng tăng Nguyên nhân sau kết thúc lần lên men thứ ta chuyển sang lần lên men thứ hai lần lên men thứ 3, lúc giống vi khuẩn hoạt hóa từ lần lên men trước nên lần lên men trải qua giai đoạn hoạt hóa giống Nên lượng axit sinh so với lần lên men trước nhiều - Trước mắt ta kiểm tra lần tái sử dụng giống, ta thấy qua lần tái sử dụng không làm giảm hàm lượng axit tạo thành Sử dụng giống vi khuẩn Lactobacillus plantarum sau thời gian bảo quản tháng chất mang natri aginate để tiến hành lên men nước cà chua Sản phẩm tạo thành thu (Hình 11) Hình 11 Nước cà chua lên men ... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU V (ml): thể tích dung dịch mẫu cấy cào đĩa petri 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.3 Phương pháp hóa sinh Vi khuẩn lactobacillus plantarum hoạt hóa từ ống giống lấy... bị tạp nhiễm Vì cơng tác bảo quản giữ giống ln địi hỏi cải tiến để tìm phương pháp tối ưu Đề tài: ? ?Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillusplantarum natri aginate” đáp ứng yêu cầu N: số tế bào... Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh a Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn Lactobacillus plantarum Giống vi khuẩn lactobacillus plantarum Pha loãng Hoạt hóa Cấy truyền ống thạch nghiêng