cố định vi khuẩn Lactobacillus Plantarum trên Natri aginate

Có rất nhiều phương pháp bảo quản giống ci sinh vật trong đó phương pháp đông khô được sử dụng phổ biến hơn cả. Cố định vi khuẩn trên Natri aginate đem lại hiệu quả giữ gống cao, tránh tạp nhiễm khi hoạt hoá. Lactobacillus Plantarum được ứng dụng nhiều trong ngành sản xuất phomat và sữa chua....

Đồ án Tổng hợp LỜI MỞ ĐẦU Bảo quản giống vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm tảng cho nghiên cứu ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: Sinh học, y học, nơng nghiệp, thực phẩm… Hiện có nhiều phương pháp để bảo quản giữ giống vi sinh vật như: phương pháp cấy truyền, đơng khơ, lạnh sâu….Trong phương pháp đông khô sử dụng phổ biến Giống bảo quản phương pháp đông khô giữ 10-20 năm Song phương pháp có nhược điểm: giá thành cao, lấy giống sử dụng lượng giống lại dễ bị tạp nhiễm Vì cơng tác bảo quản giữ giống ln địi hỏi cải tiến để tìm phương pháp tối ưu Đề tài:“Nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum natri aginate” Về đáp ứng yêu cầu Vi khuẩn Lactobacillus plantarum cố định natri aginate giữ giống lên đến 10 năm đến 20 năm(theo Trung tâm nghiên cứu y học Ấn Độ), khả sống sót tế bào cố định cao Phương pháp cố định đơn gản, hoạt hóa sử dụng giống sản xuất không ảnh hưởng tới hạt chứa giống lại, điều đặc biệt giống bảo quản theo phương pháp có giá thành thấp phù hợp với nhu cầu tâm lí người tiêu dùng Ở chọn vi khuẩn Lactobacillus plantarum để nghiên cứu chúng có nhiều lợi ích đáng kể Lactobacillus plantarum vi khuẩn dùng để sản xuất acid lactic ứng dụng ngành công nghiệp sản xuất mát sữa chua Ngồi xác định probiotic Một số công ty bán chai chứa Lactobacillus plantarum trợ giúp vấn đề đường ruột bao gồm IBS IBD, vi khuẩn giúp "cân hệ sinh thái đường ruột”, có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe người tiêu dùng Các hạt alginate cố định có nhiều lợi tế bào khác tăng cường ổn định bào tử chống lại số điều kiện hóa lý Đề tài nghiên cứu giúp ích cho phịng thí nghiệm nhỏ, ngành công nghiệp nước phát triển có thu nhập thấp So vói cấc phương pháp khác phương pháp khác thương pháp cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum natri aginate tối ưu chi phí thiết bị SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp CHƯƠNG TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM [2] 1.1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.1.1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic vi khuẩn lên men lactic thuộc họ lactobacterium, vi khuẩn Gram(+) Đây trực khuẩn cầu khuẩn, đa số không sinh bào tử, thường không chuyển động kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, chunngs khơng chứa cytochrom enzim catalase, chúng có khả sinh tổng hợp enzim peroxydase mạnh, phân giải H2O2 để phát triển Đa số chúng lên men môn disaccarit, số không lên men saccarose, số khác không lên men đường maltose Các vi khuẩn lactic khơng có khả lên men tinh bột polisaccarit khác Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu, hình ovan, hình que đường kính dạng cầu khuẩn lactic khoảng 0,5-1,5µm , tế bào hình cầu xếp thành từng cặp chổi Khích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8µm, trực khuẩn thường đứng riêng lẽ xếp thành chuổi Các loại vi khuẩn khác có khả nang tạo thành axit mơi trường sức chịu đựng axit cũng khác Đa số trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit cao khoảng 2-3%, liên cầu khuẩn khoảng 1% Các trực khuẩn phát triển pH = 4-3,8 cịn cầu khuẩn phát triển môi trường Hoạt lực lên men tốt trực khuẩn lactic vùng pH 5,5-6 Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt trực khuẩn đồng hình) kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển mơi trường có tương đối đầy đủ yếu tố dinh dưỡng cần thiết axit amin, protein, vitamin, peptide Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, chúng phân hủy protein sữa tới peptide axit amin Hoạt tính lồi có khác nhau, thường trực khuẩn cao Chúng chịu trạng thái khô hạn bền vững với CO cồn ethylic nhiều lồi vẫn sống mơi trường có 10-15% cồn cao hơn, số vi khuẩn bền với NaCl tới 7-10% Các vi khuẩn ưu ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 25-35 0C, loài ưu nhiệt có nhiệt độ tối ưu 40-45 0C.lồi ưu lạnh phát triển nhiệt độ SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp tương đối thấp khoản 50C thấp Khi gia nhiệt tới 60-800C hầu hết chúng bị chết sau 10-30 phút Một số lồi có khả tạo manngf nhầy Một số khác có khả đối kháng với thể hoại sối rữa thực phẩm vi inh vi sinh vật gây bệnh làm thối rữa thực phẩm Vi khuẩn lactic ngồi khả lên men lactic, chúng cịn có khả sản sinh chất kháng khuẩn gọi bacteriocin ứng dụng nhiều y học cũng bảo quản thực phẩm Vi khuẩn lactic phân bố rộng tự nhiên, đất, nước, khơng khí, chủ yếu có mặt thực vật (đặc biệt có cỏ) thực phẩm( rau, quả, thịt, sữa) số chủng có hệ thống đường ruột thể người động vật Trong thể người động vật ngồi khoang ruột cịn tồn khoang miệng 1.1.1.3 Đặc điểm sinh hóa, trao đổi chất của vi khuẩn lactic Hoạt động sinh hóa, trao đổi chất tiêu biểu vi khuẩn lactic chế q trình lên men lactic Quá trình lên men lactic diễn tương đối rế bào vi khuẩn Đầu tiên đường vi khuẩn lactic đưa vào tế bào nhờ chế vận chuyển đặc trưng màng tế bào Nếu phân tử đường đường đơn glucose vào thẳng chu trình chuyển hóa, cịn phân tử đường đường đơi hay dạng đường khác bị thủy phân thành monosaccharit sau vào chu trình chuyển hóa khác cuối cho sản phẩm axit lactic, axit axetix, CO2… Dựa vào sản phẩm tạo thành trình lên men người ta chia chúng thành nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị hình - Trường hợp lên men lactic đồng hình: trình lên men tạo axit lactic theo chu trình Embden-Meyerhorf (con đường EMF) Trong tế bào vi khuẩn lên men lactic đồng hình có đủ enzim cacboxylase, pyruvate không bị phân giải sâu hơn, mà thay vào nhận hydro tách để chuyển tới pyruvate để tạo thành axit lactic Lượng axit lactic tạo thành chiếm 90% sản phẩm, chỉ mtj phần nhỏ pyruvate lại bị khử cacbon tạo thành axit axetic, ethanol, CO2… SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp C6H12O6 CH3-CO-COOH CH3-CHOH-COOH + lượng Glucose axit lactic - Trường hợp lên men lactic dị hình: xảy vi khuẩn lactic khơng có đủ enzim chu trình AMP andolase trizaphosphattizomerrase Do khơng theo đường EMP nên chúng chuyển hóa theo đường Pentose-Phosphate giai đoạn đầu, từ glucose- 6- phosphate, 6- phosphoglucose, ribulose-5-phosphate tác dụng enzim epimerase chuyển thành xilulose-5-phosphate xilulose-5-phosphate theo hai đường chuyển hóa khác nhau: + xilulose-5-phosphate chuyển hóa tiếp thành glyxeraldehydes-3phosphat Sau bị thủy phân đường EMP để tạo thành axit lactic + xilulose-5-phosphate bị thủy phân đường khác để tạo thành acetyl phosphate Sau tác dụng cuaracetatkinase tạo thành acetate bị khử tiếp thành acetaldehyde thành ethanol, axit acetic, CO C6H12O6 CH3-CHOH-COOH + HOOC-CH2-CH2-COOH + CH3COOH (glucose) (axit lactic) (axit sucxinic) (axit acetic) +CH3-CH2OH +CO2 + H2 (ethanol) + Lượng sản phẩm phụ trình lên men lactic dị sau: axit lactic chiếm 40% (thấp nhiều so với lên men lactic đồng hình), axit sucxinic chiếm 20%, ethanol chiếm 10%, axit acetic chếm 10% khoảng 20% cịn lại loại khí 1.1.2 Vi kh̉n Lactobacillus plantarum 1.1.2.1 Phân loại Loài Lactobacillus plantarum thuộc giới vi khuẩn (bacteria) , ngành Fermicutes, lớp bacilli, lactobacillilales, họ Lactobacillacese, giống Lactobacillaaceae 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum vi khuẩn gram (+), thuộc trực khuẩn Hình que trịn hai đầu thường kết đôi kết chuổi, không sinh bào tử, có khả lên men kị khí hiếu khí Hình dạng khuẩn lạc trịn, màu trắng sữa, đường kính tế bào khoảng 0,5-1µm SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp Hình 1.1 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Lactobacillus plantarum 1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus plantarum a Đặc điểm sinh lí[4] L.plantarum tìm thấy nhiều môi trường khác nhau, phổ biến phân lập từ thực vật đường tiêu hóa người L.plantarum trực khuẩn ưu ấm,có thể phát triển nhiệt độ 15-45 0C, nhiệt độ tối ưu 350C Có thể phát triển pH = 3,2 lớn L.plantarum trực khuẩn, gây lên men sữa chua tự nhiên, hơ hấp yếm khí tùy tiện Lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo môi trường 0,8-1% axit lactic b Đặc điểm sinh hóa  Lên men lactic đồng hình Vi khuẩn L.plantarum phân hủy đường theo đường đơn giản tạo nên axit lactic Vi khuẩn L.plantarum chuyển hóa đường thành axit lactic theo đường lên men rượu tạo thành axit piruvic axit khử hai nguyên tử hiđro nhờ enzim lacticodehidrogenaza để trở thành axit lactic Đây trình lên men lactic đồng hình theo phương trình phản ứng sau: C6H12O6 CH3COCOH +2H2 2CH3CHOHCOOH + 22,5kcal Glucose Axit piruvic Axit lactic Lên men lactic ứng dụng rộng rãi công nghệ thực phẩm, đặc biệt công nghiệp sản xuất sữa để chế biến sản phẩm như: phomat, sữa chua, smetan…[4] SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp  Khả sinh chất kháng khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn L.plantarum có khả sinh axit lactic có khả hạn chế phát triển vi sinh vật khác chúng làm giảm pH bên đường ruột Ngoài L.plantarum có khả sinh baterioxin, loại protein có khả tiêu diệt vi khuẩn khác tạo thành kênh làm thay đổi tính thấm màng tế bào, nhiều loại bacterioxin có khả phân giải AND, ARN công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Bacterioxin công vi khuẩn gây bệnh như: E.coli, Samonela, Vibrio [5]  Khả tồn đường tiêu hóa Vi khuẩn L.plantarum có khả tồn điều kiện bất lợi đường ruột môi trường axit dày, môi trường kiềm ruột, dịch tụy, dịch mật Khả tồn điều kiện khác nghiệt đường tiêu hóa giúp cho vi sinh vật probioti cạnh tranh vị trí bám dính nguồn dinh dưỡng, lượng với vi khuẩn gây hại  Tính chất đặc trưng vi khuẩn L.plantarum khả dị hóa arginine, sinh nitrit oxide L.plantarum khơng có khả phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine argine, có đến đường khác để chuyển hóa arginine, sinh nitric oxide Việc sinh NO giúp ngăn chặn vi sinh vật gây bệnh Candida abicans, E coli, Shigella… amid kí sinh trùng[6] 1.1.2.4 Vai trò và ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus plantarum[6] - Vai trò + Bằng cách ngăn chặn bám dính E.coli vào màng nhầy, L.plantarum làm giảm bớt nội độc tố E.coli tiết + L.plantarum 299 299V làm giảm đáng kể vi sinh vật kị khí gram âm + Nghiên cứu gần cho thấy L.plantarum có khả phân hủy acid mật làm giảm cholesterol + Nguồn cung cấp sản phẩm lên men tự nhiên - Ứng dụng + Nó quan trọng việc bảo vệ chất chống vi sinh vật chống lại cách hiệu vi sinh vật gây bệnh nội bào ngoại bào SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp + L.plantarum có khả giúp tiêu hóa loại chất xơ củ hành, tỏi, lúa mì, trứng, lúa mạch đen, men bia Do chúng giúp đỡ vấn đề tiêu hóa đầy 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN VI SINH VẬT[4] 1.2.1 Phương pháp cấy chuyền Phương pháp giữ giống môi trường thạch nghiêng phương pháp phổ biến đơn giản tiện lợi Tuy nhiên thời gian giữ giống chỉ kéo dài vòn tháng, sau phải cấy truyền lại mơi trường Phương pháp tiến hành sau: khiết lại chủng loại vi sinh vật môi trương thạch ỏ đĩa petri, chọn khuẩn lạc điển hình cấy mơi trường thích hợp sau ni tủ ấm để vi sinnh vật phát triển bình thường, lấy ống giống cho vào tủ lạnh giữ 0C, hàng tháng cấy truyền lại vào môi trường 1.2.2 Phương pháp bảo quản lạnh Phương pháp dựa sở: Sự phát triển vi sinh vật bị ức chế nhiệt độ lạnh sâu, phương pháp sủ dụng rộng rãi để giữ giống vi sinh vật Ưu điểm phương pháp đơn giản, thời gian giữ lâu Tuy nhiên với phương pháp tế bào bị vỡ q trình làm lạnh làm tan mẫu Một nguyên nhân làm vỡ tế bào việc tích lũy chất điện giải mẫu bảo quản hình thành tinh chế nước tế bào Để khắc phục tình trạng này, người ta bổ sung chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu làm tan nhanh glycerol, DMSO,…Cũng phương pháp sấy lợi dụng ảnh hưởng nước nhiệt độ tới hoạt động sống vi sinh vật, người ta sử dụng nhiệt độ thấp để làm hình thành tinh thể nước ngồi tế bào vi sinh vật nhằm đình chỉ hoạt động sống vi sinh vật Để bảo vệ vi sinh vật không bị chết nhiệt độ lạnh sâu người ta phải trọn vi sinh vật vào chất bảo vệ sau đây: - Glycerol 15% - Huyết ngựa (loại không cho chất bảo quản) - Dung dịch saccarose 10% + gelatin 1%, pH = 6,8 – - Dung dịch glucose lactose 10% SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp Sau chuẩn bị mẫu dung dịch vi sinh vật để đem lạnh sâu người ta tiến hành lạnh sâu cách Cho vào tủ lạnh bắt đầu làm lạnh từ từ Cho đến nhiệt độ mẫu đạt -200C ta ngưng làm lạnh giữ mẫu nhiệt độ hay tiếp tục làm lạnh Khi mẫu đạt từ -20 0C đến -250C phải giữ tốc độ làm lạnh 120C/phút Tùy theo nhiệt độ lạnh sâu mà thời gian bảo quản cấy truyền khác nhau: - Nếu giữ nhiệt độ -15 0C đến -200C tháng cấy truyền làm lại lần - Nếu giữ nhiệt độ -300C tháng cấy truyền làm lại lần - Nếu giữ nhiệt độ -200C năm cấy truyền làm lại lần - Nếu giữ nhiệt độ -500C đến -600C năm cấy truyền làm lại lần - Nếu giữ nhiệt độ -700C 10 năm cấy truyền làm lại lần Đặc biệt với phương pháp lạnh sâu nitơ lỏng thích hợp với nhiều đối tượng vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virus, tảo dòng tế bào động vật Tuy nhiên phương pháp cũng có nhược điểm đầu tư kinh phí lớn cho thiết bị, điện, nitơ lỏng, xảy rủi ro cháy nổ Phương pháp khơng thích hợp vi sinh vật thường xuyên dùng đến mà chỉ để bảo quản chủng vi sinh vật quý mà không hợp với phương páp đông khô 1.2.3 Phương pháp bảo quản đông khô Phương pháp đông khô phương pháp làm thăng hoa phần nước có mơi trường nhũ hóa vi sinh vật điều kiện chân không Đầu tiên người ta phải nuôi môi trường lỏng Khi mật độ tế bào đạt mức độ cao nhất, thu tế bào trộn chất bảo vệ, dùng pipet vô trùng phân từng 0,2ml huyền phù vi sinh vật vào ống đông khô chuyên dùng loại  10mm  35mm Tiếp theo đưa chúng vào làm khô thiết bị đông khô Đem lạnh đông nhanh cách để vào tủ lạnh cho toàn dịch chuyển thành tinh thể nước đá nhiệt độ lạnh đông -20ºC, thời gian từ 1620h Khi tồn dịch đã đóng băng đem sấy chân không Tiến hành sấy áp suất chân không, nhiệt độ sấy 40 0C, thời gian 22 Ta kiểm tra độ khô mắt thấy mẫu khơ Hoặc ta kiểm tra mẫu đã khô chưa cách ta dùng chất chỉ thị CoCl 3% tẩm miếng giấy lọc Sấy khô bỏ miếng giấy lọc có tẩm CoCl vào ống nghiệm kiểm tra Nếu mẫu vi sinh vật đã làm khơ giấy lọc có màu xanh cịn độ ẩm cịn cao giấy cho SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp màu hồng Thời gian làm khô tùy thuộc vào thiết bị số lượng giống cần làm khơ, trung bình – 14 Các ống giống đã làm khơ hàn kín lại để tránh bị ẩm ướt trở lại Ưu điểm phương pháo tỉ lệ sống sót vi sinh vật cao, đặc tính di truyền vi sinh vật không bị biến đổi thời gian giữ giống kéo dài lâu, tốn cơng sức để cấy truyền nhiều lần Có thể bảo quản giống kéo dài > 20 năm mà giống hoàn tồn khơng chất lượng Bảo quản nhiệt độ phòng để tủ lạnh Các chất sau thường dùng để trộn vào giống vi sinh vật nhằm bảo vệ vi sinh vật đông khô khơng bị chết hình thành tinh thể nước, cũng chống q trình oxy hóa 1.2.4 Phương pháp cố định chất mang 1.2.4.1 Cố định cát Phương pháp dùng để giữ vi sinh vật có bào tử Cách tiến hành: - Chuẩn bị cát : Cát sông đêm rửa nước sạch, sấy khô, loại bỏ hạt lớn, ngâm HCl đậm đặc, đun sôi 1-2giờ Cho cát vào ống nghiệm trùng tủ sấy nhiệt độ 160-1800C 2-3giờ - Chuẩn bị bào tử : Các vi sinh vật đem ni mơi trường agar thích hợp để chúng tạo nhiều bào tử Thời gian nuôi loài sau : vi khuẩn ngày, nấm mốc 7-8 ngày, xạ khuẩn 14 ngày - Trộn bào tử vào cát : Bằng thao tác vô trùng cho 1-2 g cát đã vô trùng vào ống vi sinh vật đã hình thành bào tử, dùng que cấy vô trùng trộn bào tử với cát, cho cát đã có bào tử vào ống nghiệm vơ trùng, đậy nút cho vào tủ sấy giữ 400C 1.2.4.2 Giữ giống đất Một số vi sinh vật có bào tử Clostridium, Pastetianum thường bảo quản tốt đất Cách tiến bài: Đất đem nghiền nhỏ, rây, thêm 1-2% CaCO 3, để trung hòa loại đất chua, thêm 2% cát, 2% than hoạt tính để làm cho đất tơi xốp Thanh trùng ống nghiệm, đất sau đem trộn với bào tử vi sinh vật sấy khô, SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 10 bảo quản phương pháp bảo quản cát Thời gian bảo quản 10 năm, trường hợp chủng Clostridium sp dùng sản xuất butanol bảo quản phương pháp sau 21 năm hoạt tính vẫn khơng thay đổi 1.2.4.3 Cố định giấy lọc Giấy lọc cắt thành từng miếng nhỏ 1-3 cm, cho vào ống nghiệm 160x16mm, đậy nút trùng 1210C /h, cho vào tủ sấy 1000C/3h V i sinh vật ni cho có bào tử 3-5 ngày, dùng pipet vô trùng cho vào miếng giấy lọc giọt vi khuẩn, đậy nút cho tủ ấm để tiếp 2-3 ngày giấy hoàn tồn khơ, phủ paraffin đặc đun chảy lên nút bơng, để tủ lạnh phòng mát Phương pháp dùng để bảo quản vi khuẩn có bào tử, thời gian bảo quản dài 1.2.4.4 Phương pháp bảo quản hạt ngũ cốc Nhiều loại hạt lúa, ngô, kê, đậu sử dụng để giữ giống vi sinh vật có dạng hình sợi sinh bào tử không - Nguyên tắc: + Đảm bảo tốt điều kiện q trình bảo quản để khơng làm thay đổi phẩm chất ban đầu giống + Làm chậm q trình trao đổi chất hơ hấp vi sinh vật đồng thời ngăn cản trình sinh sản chúng - Cách bảo quản: thời gian bảo quản đạt năm + Hạt đậu nành rửa + Nấu với tỉ lệ 300ml nước sôi cho 100g hạt, khuấy đều, ngâm tiếp 30 phút, lọc bỏ nước, rải đậu lên khay để nước, cho vào bình tam giác chừng 15 -16 g/bình 250ml, đậy nút bong, trùng 121°C/40 phút Bào tử thể dinh dưỡng vi sinh vật đem hòa vào nước vô trùng, dung pipet vô trùng cấy vào bình 3ml, lắc Ni nhiệt độ thích hợp cho từng chủng rong thời gian – 10 ngày, ngày lắc nhẹ để phá khối hạt bết lại, sau đem sấy 38 – 390C 1.2.4.5 Giữ giống miếng gelatin Rất nhiều vi sinh vật giữ giống miếng gelatin phương pháp đơn giản, dễ làm an toàn - Cách tiến hành SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 21 đĩa pêtri vào tủ ấm nhiệt độ 27-28 0C, sau thời gian ngày ta nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa Dùng que cấy đã khử trùng lấy khuẩn lạc từ đĩa petri cấy vào ống nghiệm để tiến hành giữ giống 2.2.1.2 Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng kh̉n lạc phát triển mơi trường thạch Có thể định lượng tế báo vi sinh vật phương pháp gián tiếp Thông dụng định lượng tế bào sống phương pháp đếm khuẩn lạc thạch đĩa Nguyên tắc: Một tế bào phân chia theo cấp số nhân hình thành khuẩn lạc trơng thấy Đây sở việc định lượng tế bào thạch đĩa, số lượng khuẩn lạc sinh từ thể tích giống vi sinh vật định chỉ số lượng tế bào sống có thể tích giống Thơng thường, tất tế bào phase tăng trưởng hay giai đoạn sớm phase ổn định có khả hình thành khuẩn lạc Vì vậy, số lượng khuẩn lạc đếm gần tương đương với lương tế bào sống Cách tiến hành xác định: Dùng đĩa petri đã pha loãng bảo quản tủ ấm nhiệt độ 27-280C, sau thời gian ngày ta lấy nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa petri đó, tiền hành đếm khuẩn lạc mắt thường Ghi số lượng khuẩn lạc đếm  Cách đếm: - Khoảng sau 72h (3 ngày), tiến hành đếm khuẩn lạc môi trường thạch sau: - Lấy bút kẻ thành nhiều ô vuông đáy đĩa petri đánh dấu thứ tự từng vùng 1, 2, 3, 4… - Đếm số khuẩn lạc từng vùng đó, ý khuẩn lạc đã đếm nên đánh dấu để biết - Số lượng tế bào nấm mốc 1ml mẫu tính theo cơng thức sau: Số tế bào/ml mẫu = n.D V Trong đó: SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 22 N: Số khuẩn lạc trung bình đĩa petri độ pha loãng định V: Thể tích dịch mẫu đem cấy (bằng 0,1ml phương pháp cấy gạt 1ml phương pháp đổ đĩa) D: Hệ số pha loãng 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Khảo sát khả lên men lactic của giống quá trình bảo quản Chuẩn bị bình tan giác 250ml đã bao gói trùng nhiệt độ 121 0C thời gian 30 phút Sau lấy bình tam giác, thêm vào 100ml sữa tươi, 15 hạt aginate đã cố định giống chưa qua thời gian bảo quản Sau sau 24h, 48h, 72h, 96h ta đo hàm lượng axit lactic sinh Tiến hành tương tự sau tháng ta tiến hành đo hàm lượng axit lactic sinh hạt alginate có cố định vi khuẩn L.plantarum Định lượng axit lactic sinh sau : Lấy 10ml mẫu cần xác định hàm lượng axit lactic, cho vào bình tam giác 100ml, thêm vào 2-3 giọt chất chỉ thị màu phenolphtalin 1% Chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N Ghi nhận kết thể tích dung dịch NaOH 0,1N chuẩn độ 2.4 CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM TRÊN NATRI ALGINATE 2.4.1 Khảo sát nồng độ natri alginate và CaCl2 Pha chế dung dich natri aginate CaCl nhiều nồng độ khác để lựa chọn nồng độ natri aginate CaCl thích hợp cho việc tạo hạt Cách tiến hành sau: + Pha chế dung dịch natri aginate loại nồng độ: 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% + Pha chế dung dịch CaCl2 loại nồng độ: 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5 % 2.4.2 Tạo hạt vi gói cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum Qua bước khảo sát nồng độ, alginate CaCl ta chọn nồng độ thích hợp để tạo hạt vi gói Cách tiến hành sau: Dùng pitet mài đầu nhọn pitet đầu nhọn pipet có kích thước khoảng 0,25cm SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 23 - Pha dung dịch natri aginate có nồng độ 2,5% - Pha dung dịch CaCl2 có nồng độ 2,5% Sau bao gói pipet, trùng với dung dich natri aginate, CaCl đã pha sãn nồng độ Thanh trùng nhiệt độ 1210C, thời gian 30 phút Sau lấy Làm nguội, giống vi khuẩn lactobacillus plantarum cho trực tiếp vào dung dịch CaCl nồng độ 2,5%, trộn giống cho giống hịa tan vào dung dịch CaCl 2.sau cho dung dịch natri aginate 2,5% chảy từ từ pitet xuống cốc chứa CaCl đã hòa tan giống Dung dịch natri aginate vừa tiếp xúc với CaCl có đơng tụ tạo hạt có hình cầu Sau tạo hạt xong ta đem lọc lấy hat,sấy nhiệt độ 350C thời gian 12h lấy để vào ống nghiệm đã trùng, bảo quản nhiệt độ thường 2.4.3 Khảo sát khả tồn tại của vi khuẩn lactobacillus plantarum natri aginate thời gian bảo quản - Khảo sát mật độ tế bào vi khuẩn lactobacillus plantarum trước bảo quản Lấy hạt natri alginate vừa tạo hạt xong, ngâm ống nghiệm chứa ml nước cất đã qua trùng thời gian 40 phút tiến hành pha loãng mẫu từ 10-1 đến 10-8 Tiến hành cấy trải đĩa petri để xác định tế bào ban đầu cách đếm số khuẩn lạc tạo thành Sau sau ngày, 14 ngày, 30 ngày, tháng, tiến hành kiểm tra giống lần tương tự CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 24 3.1 HOẠT HÓA CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM Phân lập vi sinh vật trình tách riêng loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Sau trình phân lập thu khuẩn lạc riêng rẽ, khiết ghi lại (Hình 3) Đặc điểm khuẩn lạc: Hình trịn, màu trắng sữa, bóng, mặt lồi bám Hình Khuẩn lạc chặt mơi trường phân lập Sau quan sát hình dạng khuẩn lạc kính hiển vi chúng tơi nhận thấy khuẩn lạc có hình que, xếp chuỗi Từ kết nghiên cứu tài liệu tham khảo khẳng định chủng vi khuẩn Lactobacillus plantrum cần phân lập Sau phân lập hai chủng khiết tiến hành cấy chuyền sang ống nghiệm để tiến hành bảo quản giữ giống (Hình 4) Hình Giữ giống 3.2 KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG (OD)TRÊN MÁY QUANG PHỔ UV-VIS Theo nghiên cứu sinh viên Phạm Thị Hoa, lớp 09HTP - Khoa Cơng nghệ Hóa học - Trường Cao đẳng Công nghệ - Đại học Đà Nẵng đã xây dựng đường cong tốc độ sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus plantarum Qua kết thu nhận kết quả: Sau 48 nuôi cấy sinh khối vi khuẩn đạt cực đại, ta lấy mẫu mang cố định khoảng thời gian 45 sau nuôi cấy lúc sinh khối vi khuẩn cịn non trẻ đạt mức cao 3.3 KHẢO SÁT HOẠT LỰC SINH AXIT LACTIC CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM Chuẩn bị bình tam giác chứa 100ml sữa, cho dung dịch vi khuẩn có mật độ 109 tế bào vào cho lên men Kiểm tra hoạt lực sau 96h cách chuẩn độ dung dịch dung dịch NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphtalin 1% Từ kết thí nghiệm ta rút nhận xét: Hàm lượng axit sinh ngày thứ nhất, thứ ,3 tăng nhanh, ngày thứ tăng SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 25 chậm Đặc biệt sau 48h hàm lượng axit sinh 7,5% ngày thứ 96h 8,8% Nguyên nhân lượng vi sinh ngày nhiều lượng lượng chất dần hết lượng axit sinh ngày Từ ta thấy hàm lượng axit lactic sinh Hình 5.hoạt lực của vi khuẩn trình lên men tương đối lớn 3.4 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ NATRI ALGINATE VÀ CaCl Ta kết sau: Bảng 3.1 Bảng tổng hợp kết quả khảo sát nồng độ natri aginate và CaCl2 Đặc điểm Khả Tạo hạt tạo kém hạt Nồng độ natri aginate(%) 1,5 Tạo hạt mềm dễ bị co rút Mềm chắc 2,5 Tạo hạt tốt SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Tạo hạt tốt 3,5 Rắn chắc Rắn chắc Đồ án Tổng hợp Hình dạng Hạt bị Cấu Hạt bị trúc hạt 0,5 Hạt Khả tạo hạt Cấu Hạt trúc 26 Hạt hình cầu, co rút Hình cầu Hình cầu Hình cầu Mềm, chắc Mềm Mềm, chắc chắc Nồng độ CaCl2(%) 1,5 Tạo hạt Tạo hạt tốt tốt Mềm rắn Mềm Tạo hạt trung bình Tạo gel mềm Mềm chắc Hình dạng khơng xác định Rắn chắc Hình dạng khơng xác định Rắn, chắc 2,5 Tạo hạt tốt Tạo hạt tốt 3,5 Tạo hạt tốt Mềm chắc Rắn chắc Rắn chắc Từ kết thu nhận cho thấy: - Nồng độ natri alginate ảnh hưởng đến khả tạo hạt gel cố định + Nồng độ natri alginate cao bắt đầu từ 3,5% hạt gel tạo thành cứng, rắn, chắc đồng thời hình dạng hạt khơng xác định, khơng cịn hình cầu đặc trưng hạt gel cố định + Nồng độ natri alginate q thấp khơng có khả tạo hạt, từ nồng độ - 1,5% khả tạo hat, hạt mềm dễ vỡ + Từ nồng độ 2-2,5% khả tạo hạt tốt, hạt có hình cầu đặc trưng Từ kết ta chọn nồng độ natri alginate thích hợp 3% Ta chọn nồng độ theo số tài liệu tham khảo tài liệu nghiên cứu cho thấy hạt cứng khả khuếch tán chất vào tế bào vi khuẩn trình lên men kém Nhưng hạt tạo thành bền, khả bảo vệ tế bào cố định khỏi tác động bên ngồi tốt Ngược lại, hạt mềm khả khuất tán chất vào tế bào cố định lớn khả bảo vệ tế bào khỏi tác động bên ngồi kém Từ lí nên ta chọn nồng độ natri alginate 3% Ở nồng độ hạt vừa có hình cầu, hạt chỉ rắn nên vừa có khả bảo vệ tế bào tốt, khuếch tán chất trình lên men cũng tương đối tốt so với hạt gel có cấu trúc cứng Nếu chọn nồng độ % hạt mềm khả khuếch tán trình lên men bảo vệ hạt kém Tương tự hạt có nồng độ natri alginate lớn 3% SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 27 - Nồng độ CaCl2 ảnh hưởng đến khả tạo hạt, CaCl2 có tác dụng giữ phân tử alginate lại với tạo thành chuổi alginate, alginate làm cho hạt cứng rắn Nồng độ CaCl2 cao hạt cứng, chắc + CaCl2 nồng độ 0,5% hạt bịvỡ, khơng có khả tạo hạt, từ 1,5 – 2,5 % khả tạo hạt tốt, hạt mềm chắc, từ 3-3,5% hạt có xu hướng rắn chắc Từ kết ta chọn nồng độ CaCl2 1,5% Tương tự ảnh hưởng nồng độ natri alginate Đối với nồng độ CaCl2 từ 1,5 -2,5% tạo hạt mềm chắc, nồng độ cao hạt cứng chắc ảnh hưởng đến khả khuếch tán chất trình lên men Trong nồng độ CaCl2 từ 1,5 -2,5 % ta chọn 1,5 % vừa tạo cấu trúc hạt mềm chắc vừa tiết kiệm lượng hóa chất sử dụng 3.5 TẠO HẠT VI GĨI CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM Chuẩn bị dung dịch natri alginate nồng độ 3%, dung dịch CaCl nồng độ 1,5% Song song ta chuẩn bị dịch tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum với mật độ 109 tế bào/ml( mật độ xác định cách đo mật độ quang tính cơng thức tính số lượng tế bào biểu kiến Số lượng tế bào biểu kiến/ml tính thơng qua mật độ quang học OD phương trình sau: X= 2,5x10 0,3 OD X: Số lượng tế bào biểu kiến /ml OD: giá trị mật độ quang học đo bước sóng 600nm (công thức tham khảo theo (Morohoshi & Kimura, 2002) Sau ta cho vi khuẩn đã chuẩn bị vào dung dịch CaCl trộn Tiếp theo ta tiện hành tạo hạt phương pháp nhỏ giọt Hạt sau tạo thành lấy nước sau đưa vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 38 0C, sấy khối lượng khơng đổi ta lấy đưa bảo quản Ta chọn nhiệt độ sấy 38 0C vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc loại vi khuẩn ưa ấm,nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng phát triển 35-400C Vì ta chọn nhiệt độ sấy 380C không làm vô hoạt vi khuẩn vừa rút ngắn thời gian sấy SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 28 Từ kết thu nhận thấy rằng: Vi khuẩn Hình Hạt gel cố định Lactobacillus plantarum sau cố định natri alginate có dạng hình cầu, tiện lợi cho bảo quản sử dụng sau 3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TỒN TẠI CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM TRÊN NATRI ALGINATE TRONG THỜI GIAN BẢO QUẢN Kiểm tra khả sống sót chế phẩm vi khuẩn lactic chất mang natri alginate cách gieo mẫu môi trường dinh dưỡng thích hợp quan sát sinh trưởng phát triển khuẩn lạc đĩa petri Kết kiểm tra ghi nhận lại (Hình 8) (Hình 9) Sau tuần Sau tháng Hình Mật độ của vi khuẩn Từ sơ đồ (Hình 9) ta thấy: Số lượng tế bào vi khuẩn La ctobacillusplantarum sống sót giảm dần theo thời gian, nhiên giảm không nhiều Sau tháng bảo quản tỷ lệ sống sót vẫn mức cao1,1.107tế bào/ml Từ kết thu nhận rút rađược nhận xét: Phương pháp cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarumtrên chất mang natri, alginate bảo quản nhiệt độ thường 300C có tỉ lệ sống sót vi khuẩn cao, hạt cố định có dạng hình cầu dễ bảo quản, sử dụng tránh tác động điều kiện hóa lí Hình Mật độ tế bào Điều chứng tỏ giống bảo quản theo phương pháp vừa mang lại hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện, vừa dễ dàng áp dụng vào thực tế Giống vi khuẩn cố định natri alginate có tỷ lệ sống sót cao do: SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 29 Khi cho natri alginate kết hợp với ion Ca2+ thấy xuất vùng nối mạch phân tử alginate tạo gel theo mơ hình vĩ trứng Để hình thành hạt gel cần có chế liên kết hai hay nhiều chuỗi alginate Chuỗi phân tử alginate có nếp khe hở mà ion Ca 2+ chui vào, định vị liên kết, ion Ca 2+ liên kết phân tử alginate lại với thành chuỗi alginate, làm cho chuổi alginate trở nên bền chắc Vi khuẩn Lactobacillus plantarum đã hịa vào dung dịch CaCl cũng theo mà chui vào khe hở cố định đó, nhờ mà hạt gel giữ nhiều tế bào vi khuẩn, bên ngồi có lớp bảo vệ làm cho tế bào tránh tiếp xúc với mơi trường bên ngồi nên vi khuẩn bảo quản thời gian dài mà không bị nhiễm khuẩn hay vô hoạt 3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN LACTIC CỦA VI KHUẨN TRONG THỜI GIAN BẢO QUẢN Chuẩn bị bình tam giác chứa 100 ml sữa tươi, thêm vào hạt gel đã cố dịnh tuần Sau 24h ,48h ,72h, 96h Kiểm tra hoạt lực vi khuẩn cách cách: Lấy 10ml mẫu huẩn độ dung dịch NaOH 0,1N, có chỉ thị phenolphtalin Sau tháng lại thiến hành kiểm tra lại tháng cuối Hình Hoạt lực của vi khuẩn(%) Ta thu biểu đồ hình Từ biểu đồ ta rút nhận xét: Sau thời gian bảo quản tuần, tháng, tháng, hàm lượng axit 24h đầu có thay đổi, sau 96h lên men hàm lượng axit sinh khơng có thay đổi nhiều Điều chứng tỏ thời gian bảo quản đã làm ảnh hưởng đến hoạt lực vi khuẩn, vi khuẩn bị ức chế điều kiện bảo quản Trong 24 đầu vi khuẩn cần thời gian để hoạt hố lại Lúc vi khuẩn chưa có thời gian để thích nghi với mơi trường lên men Sau 96 vi khuẩn sau thời gian bảo quản đã hoạt hố lại thích nghi với mơi trường nên hoạt lực lên men mẫu Như vậy, điều kiện SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 30 bảo quản nhiệt độ thường, q trình bảo quản khơng ảnh hưởng lắm đến hoạt lực vi khuẩn Lactobacillus plantarum Từ ta rút kết luận: Bảo quản theo phương pháp làm cho hoạt lực vi khuẩn cố định tương đối ổn định sau tháng bảo quản.Nguyên nhân làm cho hoạt lực vi khuẩn giữ ổn định do: Sau tế bào vi khuẩn cố định hạt gel, hạt gel tạo thành mạng lưới bao quanh tế bào Cấu trúc hạt gel tạo thành lỗ xốp, thuận tiện cho viêc khuếch tán chất sản phẩm khỏi hạt gel (sau 96h hoạt lực axit tăng lên) Bằng cách ta dễ dàng khống chế phản ứng, tách sản phẩm khỏi bình phản ứng cách dễ dàng Xung quanh tế bào vi khuẩn lớp gel bảo vệ nên hoạt lực vi khuẩn ổn định thời gian bảo quản KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian dài tiến hành nghiên cứu đã thu kết Hoạt hóa chủng vi khuẩn lactobacillus plantarum từ ống giống gốc giữ giống ống thạch nghiêng để có nguồn giống gốc nghiên cứu Tơi đã tiến hành nghiên cứu cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum natri alginate, với mật độ tế bào sống sót sau tháng cố định 1,1.107 tế bào/ml, bảo quản điều kiện thường nên tiện dụng Sau bảo quản tiến hành hoạt hóa trở lại đã thu hình ảnh khuẩn lạc, số lượng tế bào sống SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 31 Thực nghiên cứu nhằm xác định hoạt lực vi khuẩn cố định thời gian bao quản nhận thấy hoạt lực vi khuẩn tháng bảo quản thay đổi khơng đáng kể KIẾN NGHỊ Q trình nghiên cứu tơi nói thành cơng mong đợi, vẫn muốn tiếp tục nghiên cứu mình, khơng chỉ dừng lại mốc thời gian, phương pháp đã tiến hành mà muốn mở rộng thời gian, phương pháp, chất bảo vệ nhiều vấn đề khác liên quan MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT……………………………………1 SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 32 1.1 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus plantarum…………………………1 1.1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic……………………………………………2 1.1.2 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum………………………………………4 1.2 Các phuương pháp bảo quản vi sinh vật 11 1.3 Tổng quan về alginate 15 1.3.1 Phương pháp vi gói 15 1.3.2 Tổng quan về chất mang alginate 17 1.3 Tổng quan về alginate 15 1.4 Tình hình nghiên cứu nước và giới .15 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 20 1.4.2 Tình hình nghiên cứu giới 21 Chương đối tượng và phương pháp nghiên cứu .22 2.1 Đối tượng nghiên cứu .22 2.1.1 Nguyên liệu , 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Dụng cụ 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu .23 2.2.1 Phương pháp vi sinh 23 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 25 2.2.3 Phương pháp cố định vi khuẩn natri alginate .25 Chương Kết quả và thảo luận 28 SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 33 3.1 Hoạt hóa vi khuẩn Lactobacillus plantarum .28 3.2 Khảo sát hoạt lực của vi khuẩn Lactobacillus plantarum .29 3.3 Khảo sát nồng độ natril alginate và CaCl2 29 3.4 Tạo hạt vi gói cố định vi khuẩn Lactobacillus plantarum 3.5 Khảo sát khả tồn tạ của vi khuẩn quá trình bảo quản 30 3.6 Khảo sát khả sinh axit lactic của vi khuẩn quá trình bảo quản 30 1.3.2 Tổng quan về chất mang alginate 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng viêt [1] Nguyễn Đức Lượng, “Cơ sở vi sinh vật công nghiệp”, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hồ Chí Minh, năm 2002 [2] Lê Văn Nhương, “ Cơ sở công nghệ sinh học, tập 4_ Công nghệ vi sinh”, Nhà xuất bản giáo duc, năm 2009 [3] Lê Xuân Phương, “ Vi sinh công nghiệp”, NXB xây dựng [4] Nguyễn Thị Xô, Lê Xuân Phương, “Thí nghiệm vi sinh hóa sinh”, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng Tài liệu trang web [4]http://luanvan.co/luan-van/khao-sat-anh-huong-acid-lactic-va-mang-alginate-denchat-luong-va-thoi-gian-bao-quan-ca-tra-phile-dong-lanh-2564/ [5] http://luanvandaihoc.com/archive/index.php/t-52946.html [6] http://menvisinh.org/content/dac-tinh-dieu-tri-cua-chung-vi-khuan-sinh-axitlactic SVTH: Đinh Thị Tú Uyển Đồ án Tổng hợp 35 [7] http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Lactobacillus_plantarum [8] www.vjol.info/index.php/JSTD/article/viewFile/459/1054 SVTH: Đinh Thị Tú Uyển ... VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM [2] 1.1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.1.1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic vi khuẩn lên men lactic thuộc họ lactobacterium, vi khuẩn. .. sản xuất hạt calcium aginate có cố định vi khuẩn lactobacillus spp Kết nghiên cứu cho thấy hoạt động khả kháng khuẩn vi khuẩn lactobacill spp cố định vẫn ổn định sau tháng - Khoa Kỹ thuật Hóa... hoạt lực vi khuẩn, vi khuẩn bị ức chế điều kiện bảo quản Trong 24 đầu vi khuẩn cần thời gian để hoạt hoá lại Lúc vi khuẩn chưa có thời gian để thích nghi với mơi trường lên men Sau 96 vi khuẩn sau