KỸ THUẬT GIEO CẤY – NUÔI CẤY VI SINH VẬT

MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG .5 DANH MỤC HÌNH BÀI 1: TIỆT TRÙNG DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG LÀM VIỆC CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I II III IV V Mục đích thí nghiệm .7 Tổng quan phịng thí nghiệm vi sinh Hệ thống phịng thí nghiệm vi sinh Thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh Dụng cụ phịng thí nghiệm vi sinh Sơ lược lý thuyết Tiệt trùng dụng cụ môi trường làm việc Chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV 10 Tiến hành làm môi trường 11 Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm, nguyên liệu vô trùng 11 Pha chế 12 Phân phối vào dung dịch chứa .12 Hấp tiệt trùng .12 Định hình .12 Bảo quản môi trường 13 Kết nhận xét 13 BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY – NUÔI CẤY VI SINH VẬT 14 I II III IV Mục tiêu thí nghiệm .14 Kỹ thuật gieo cấy .14 Mục đích gieo cấy 14 Yêu cầu kỹ thuật 14 Dụng cụ 14 Kiểu gieo cấy .15 Thực hành 16 Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm 16 Chuẩn bị môi trường 16 Gieo cấy môi trường thạch nghiêng .17 Gieo cấy hộp Petri .17 Kết nhận xét 18 1 Gieo cấy môi trường thạch nghiêng .18 Gieo cấy hộp Petri .19 BÀI 3: PHÂN LẬP VSV VÀ ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP GIÁN TIẾP .21 I II Mục tiêu thí nghiệm .21 Nội dung thí nghiệm 21 Kỹ thuật phân lập 21 Kỹ thuật định lượng .25 BÀI 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT 29 I II III IV V Mục tiêu thí nghiệm .29 Kính hiển vi .29 Quan sát vi sinh vật 30 Thực hành quan sát tiêu sống 30 Chuẩn bị .30 Cách tiến hành .31 Kết nhận xét 32 BÀI 5: QUAN SÁT NẤM MEN 33 Mục đích thí nghiệm 33 Sơ lược lý thuyết .33 Nấm men 33 Buồng đếm 34 III Tiến hành thí nghiệm 35 IV Kết 36 V Nhận xét 38 VI Ứng dụng 38 I II BÀI 6: QUAN SÁT VI KHUẨN 39 Mục tiêu thí nghiệm .39 Sơ lược lý thuyết .39 Đặc điểm hình dạng vi khuẩn 39 Hình thức sinh sản, phân đơi vi khuẩn 41 Quan sát vi khuẩn 42 III Thực hành nhuộm màu cho tiêu vi khuẩn 43 Làm vết bôi 43 Làm khô 43 Cố định vết bôi 44 Nhuộm màu 44 IV Kết thí nghiệm 44 V Nhận xét 44 VI Ứng dụng I II Nhuộm Gram .45 Vi khuẩn .45 BÀI 7: QUAN SÁT NẤM MỐC 46 I II III IV V Mục tiêu thí nghiệm .46 Sơ lược lý thuyết .46 Đặc điểm hình thái .46 Quan sát nấm mốc 47 Tiến hành thí nghiệm 47 Kết nhận xét 48 Mucor sp 48 Rhizopus sp 48 Aspegillus sp 48 Penicilium sp .49 Ứng dụng 49 BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HÓA CARBONHYDRAT CỦA VSV 50 Mục tiêu thí nghiệm .50 Sơ lược lý thuyết .50 Dị hóa 50 Carbonhydrat .50 Q trình chuyển hóa 50 III Tiến hành làm thí nghiệm 51 Làm môi trường OF .51 Làm môi trường tinh bột 52 IV Kết thí nghiệm 53 Thí nghiệm 53 Thí nghiệm 54 V Nhận xét 55 VI Ứng dụng 55 I II BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG 57 I II III IV V Mục tiêu thí nghiệm .57 Sơ lược lý thuyết .57 Nguyên lý 57 Phương pháp 57 Tiến hành thí nghiệm 58 Chuẩn bị môi trường 58 Cấy vi sinh vật vào môi trường khảo sát 58 Kết thí nghiệm 58 Nhận xét 60 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: So sánh đặc điểm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc 30 Bảng 2: Kết đếm nấm men .37 Bảng 3: So sánh gram (+) gram (-) 43 Bảng 4: Đặc điểm số loại nấm men 46 Bảng 5: So sánh khác lên men hơ hấp hiếu khí 51 Bảng 6: Kết thí nghiệm 53 Bảng 7: Kết thí nghiệm 59 DANH MỤC HÌNH BÀI 1: TIỆT TRÙNG DỤNG CỤ VÀ MƠI TRƯỜNG LÀM VIỆC CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT .7 Hình 1.1: Máy lắc Hình 1.2: Tủ cấy vi sinh vật Hình 1.3: Đĩa Petri Hình 1.4: Que cấy vịng kim loại Hình 1.5: Mẫu thạch nghiêng 13 BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY – NUÔI CẤY VI SINH VẬT 14 Hình 2.1: Que cấy thẳng 14 Hình 2.2: Que cấy vịng 14 Hình 2.3: Que cấy móc 15 Hình 2.4: Một số kiểu gieo cấy chuyền 15 Hình 2.5: Gieo cấy ria hộp Petri .16 Hình 2.6: Kết gieo cấy chuyền 18 Hình 2.7: Kết gieo cấy từ ống nghiệm 19 Hình 2.8: Kết gieo cấy từ ống nghiệm 19 Hình 2.9: Kết gieo cấy từ ống nghiệm 20 BÀI 3: PHÂN LẬP VSV VÀ ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP GIÁN TIẾP .21 Hình 3.1: Các bước tiến hành thí nghiệm phương pháp đổ đĩa 22 Hình 3.2: Kết cấy ria 24 Hình 3.3: Buồng đếm hồng ngoại 26 Hình 3.4: hệ thông MPN .26 Hình 3.5: Phân chia môi trường vào ống nghiệm 27 Hình 3.6: Cây dung dịch 27 Hình 3.7: Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính 27 Hình 3.8: Tra bảng 28 BÀI 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT 29 Hình 4.1: Cấu tạo kính hiển vi 29 Hình 4.2: Phiến kính làm tiêu giọt ép 30 Hình 4.3: Phiến kính làm tiêu giọt treo 30 Hình 4.4: Cách để kính lên phiến kính tiêu giọt ép .31 Hình 4.5: Cách để kính lên phiến kính tiêu giọt treo 31 Hình 4.6: Kết quan sát tế bào nấm men 32 BÀI 5: QUAN SÁT NẤM MEN 33 Hình 5.1: Cấu tạo nấm men 33 Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm vi sinh vật .35 Hình 5.3: Kết sau nhuộm 36 BÀI 6: QUAN SÁT VI KHUẨN 39 Hình 6.1: Song cầu khuẩn 39 Hình 6.2: Liên cầu khuẩn .40 Hình 6.3: Tụ cầu khuẩn 40 Hình 6.4: Trực khuẩn .41 Hình 6.5: Phẩy khuẩn .41 Hình 6.6: Spirilium 41 Hình 6.7: Kết thí nghiệm nhuộm màu phức .45 BÀI 7: QUAN SÁT NẤM MỐC 46 Hình 7.1: Hình dạng Mucor .47 Hình 7.2: Hình dạng Rhizopus 47 Hình 7.3: Hình dạng Penicilium 47 Hình 7.4: Hình dạng Aspegillus .47 Hình 7.5: Mucor sp quan sát vật kính 10* 48 Hình 7.6: Rhizopus sp quan sát vật kính 40* 48 Hình 7.7: Bài tử trần Aspegillus quan sát vật kính 40* 48 Hình 7.8: Penicilium sp quan sát vật kính 10* .49 Hình 7.9: Bào tử Penicilium sp quan sát vật kính 40* .49 BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HÓA CARBONHYDRAT CỦA VSV 50 Hình 8.1: Kết thí nghiệm 54 Hình 8.2: Kết thí nghiệm 54 BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG 57 Hình 9.1: Mẫu thí nghiệm kiểm chứng, đường lactose, glucose, maltose 59 Hình 9.2: Mẫu thí nghiệm đường Saccharose 59 BÀI 1: TIỆT TRÙNG DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG LÀM VIỆC CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Ngày tháng năm 2014 Thời gian: 6h30 – 11h30 I Mục tiêu thí nghiệm: - Biết phương pháp tiệt trùng, khử trùng dụng cụ mơi trường làm việc Biết cách bao gói vơ trùng dụng cụ thí nghiệm Biết cách làm mơi trường để nuôi cấy vi sinh vật, môi trường nấm men II Tổng quan phịng thí nghiệm vi sinh: - - Hệ thống phịng thí nghiệm vi sinh: Phòng nhận trữ mẫu Phòng cấy mẫu Phòng xét nghiệm chung Phịng thủy mẫu Thiết bị phịng thí nghiệm: Thiết bị tiệt trùng: nồi hấp dùng để tiệt trùng khơ, ẩm nhiệt độ áp suất an tồn, autoclave, tủ sấy để sấy khô dụng cụ trước tiệt trùng Thiết bị gia nhiệt Máy lắc: Cho ống ni cấy vào đĩa, máy lắc có tác dụng làm tăng hàm lượng oxy vào mẫu, dùng cho vi sinh vật hiếu khí Thiết bị ni cấy yếm khí: Đặt thêm mẫu hóa chất bên để hút CO2 sinh Tủ ấm: hoạt động 25-60 oC, thường người ta sử dụng từ 30-40 oC Trong phịng thí nghiệm: 37oC Tủ cấy: gồm phịng cấy, hệ thống tiệt trùng dùng tia UV: 200-290nm bơm lọc không khí Bể điều nhiệt: dùng truyền nhiệt cho mơi trường vi sinh vật Dùng nước nhiệt độ nhỏ 100oC Nhiệt độ lớn 100oC dùng dầu Có phận điều chỉnh nhệt kèm theo hệ thống lắc pH kế: điều chỉnh pH môi trường ni cấy Ngồi cịn có thiết bị như: máy phá mẫu, máy trộn mẫu, kính hiển vi, cân, nhiệt kế… Hình 1.1: Máy lắc Hình 1.2: Tủ cấy vi sinh vật Dụng cụ thí nghiệm vi sinh: - Dụng cụ chứa mẫu nuôi trồng: erlen , bercher , pipet, bình định mức, ống - - nghiệm có nắp khơng nắp… Dụng cụ ni cấy: + Ống nghiệm: thường có đường kính d=8-15 mm, thường sử dụng d=10mm + Đĩa petri: có d=8-12 cm, gồm có nắp nhỏ nắp lớn + Que cấy: Gồm có que thẳng dùng cấy điểm lấy mẫu vi sinh vật Que vòng dùng để cấy chuyền, cấy ria lấy mẫu vi sinh vật Que mốc lấy khuẩn lạc, khuẩn ty, gieo cấy + Que trang: có đầu tam giác, làm thủy tinh + Đũa thủy tinh: Dùng để khuấy dung dịch Dụng cụ quan sát: + Lam kính có dạng hình chữ nhật + Lamen có dạng hình vng, mỏng lam kính + Buồng đếm vi sinh vật + Màng lọc vi sinh vật Hình 1.3: Đĩa petri Hình 1.4: Que cấy vòng kim loại III Sơ lược lý thuyết: Tiệt trùng dụng cụ môi trường làm việc: a Tiệt trùng bề mặt môi trường làm việc: - Khi làm việc với vi sinh vật, để tránh bị lây nhiễm vi sinh vật không mong muốn môi trường xung quanh cần phải đảm bảo môi trường bề mặt làm việc vô khuẩn Sự vô trùng nơi làm việc phụ thuộc vào phương pháp tiệt trùng mà phụ thuộc nhiều vào điều kiện thơng gió nơi làm việc - Cách tiến hành: + Cửa sổ cửa vào phải đóng chặt trước thời điểm làm việc + Để tiệt trùng khơng khí phịng dùng đèn UV, lắp trần nhà, bật 15 phút Khơng khí chiếu UV sinh ozone, sau khơng khí có mùi đặc trưng + Bề mặt làm việc tiệt trùng cách lau ethanol 70% Khi lau cồn, lưu ý khơng bật đèn cồn xảy hỏa hoạn + Thực tế môi trường làm việc khơng đáp ứng u cầu kín gió lắp đèn UV, sử dụng tủ sấy thao tác đèn cồn khéo léo để mẫu thí nghiệm khơng bị nhiễm vi sinh vật b Tiệt trùng dụng cụ làm việc: - Dụng cụ thủy kim loại: + Chuẩn bị trước tiệt trùng: • Trước tiệt trùng cần làm sấy khơ • Sau gói kín giấy, giấy bạc hay hộp kín để đảm bảo sau tiệt trùng dụng cụ không bị nhiễm lại vi sinh vật từ mơi trường ngồi • Ống nghiệm thủy tinh cần đậy nút bơng khơng thấm nước, sau gói kín phần đầu ống nghiệm có nút bơng vào giấy đem tiệt trùng • Hộp petri cần gói kín giấy • Pipet thủy tinh cần gắn nút nhỏ phần cuối pipet, sau bọc kín giấy • Que trang, đũa thủy tinh cần tiệt trùng cần phải gói kín giấy + Phương pháp tiệt trùng: • Phương pháp tiệt trùng nhiệt khô: Sấy tủ sấy nhiệt độ 170180oC, thời gian 1-2 vật cần tiệt trùng khơng có nắp bơng Nếu có nắp bơng, sấy nhiệt độ 150-160oC khoảng • Phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm: thường thực nồi autoclave áp suất 1at, nhiệt độ 121oC - Dụng cụ plastic chịu nhiệt: Ống nghiệm có nắp chứa chịu nhiệt, nắp teflon, cao su hay đầu micropipette tiệt trùng nhiệt ẩm nồi autoclave - Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: + Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường tiệt trùng 121 oC Thời gian tiệt trùng phù thuộc khối lượng đem tiệt trùng, thường từ 20-30 phút + Đối với thành phần dinh dưỡng nhạy cảm với nhệt độ cao sử dụng phương pháp tiệt trùng mà cần sử dụng màng lọc vi khuẩn c Giới thiệu phương pháp tiệt trùng Pasteur Tyndall: - Phương pháp tiệt trùng Pasteur : + Là qui trình làm nóng thực phẩm (luôn chất lỏng) đến nhiệt độ định khoảng thời gian xác định(đối với trùng sữa thường khoảng 71oC 15 giây) sau làm lạnh đột ngột.Phương pháp làm chậm trình hư hỏng thực phẩm + Phương pháp không nhằm mục đích giết chết tất tế bào vi sinh vật, mà nhằm kiểm soát, làm giảm vi sinh vật, làm chậm phát triển sin htruwongr vi sinh vật - Phương pháp Tyndall: + Là phương pháp đun cách thủy 50-55oC mối ngày 70-80oC 30 phút ngày liên tiếp diệt vi khuẩn Phương pháp dùng để tiệt khuẩn dung dịch chứa albumin , dụng cụ chất dẻo số dung dịch đặc biệt để cấy khuẩn + Phương pháp có ưu điểm tiêu diệt vi khuẩn nha bào thời gian ngắn, tiệt khuẩn nhiều dụng cụ, vật dụng khác nhau, dễ kiểm soát nhiệt độ Tuy nhiên thao tác không đúng, chưa thành thạo dễ gây tai nạn nguy hiểm Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật: a Khái niệm chung: - Môi trường để nuôi cấy vi sinh vật hỗn hợp chất cần thiết cho sống vi sinh vật Muốn nghiên cứu sử dụng phải gieo cấy chúng mơi trường thích hợp - Để trì sống mình, hầu hết loài vi sinh vật cần số nguyên tố hóa học gần giống nhau, khả đồng hóa loại vi sinh vật khác Vì khơng có mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho tất loài vi sinh vật - Môi trường gieo cấy vi sinh vật đạt yêu cầu sau: + Có đầy đủ dinh dưỡng cần thiết + Có pH thích hợp, độ nhớt định + Hồn tồn vơ khuẩn - Về tên mơi trường: Có thể gọi theo tên người tìm môi trường Endo, Saburo, Raulin… Nhưng tốt gọi tên theo nguồn cacbon nito mơi trường saccharose nitrat, pepton glucose… b Phân loại: Dựa vào thành phần, nguồn gốc, cấu trúc, mục đích sử dụng mà có nhiều cách để phân loại mơi trường - Phân loại theo thành phần nguồn gốc: + Môi trường tự nhiên:thường bao gồm hợp chất chưa xác định rõ thành phần, khơng có cơng thức hóa học rõ ràng Ví dụ pepton, cao thịt - - + Mơi trường tổng hợp: Có thành phần hóa học xác định cách xác Được chuẩn bị từ hợp chất hóa học tinh khiết, có cơng thức hóa học xác định + Mơi trường bán tổng hợp: Ngồi sản phẩm tự nhiên có thêm số hóa chất có thành phần định Phân loại theo cấu trúc: môi trường nuôi cấy vi sinh vật chia làm loại + Mơi trường lỏng: dung dịch chất dinh dưỡng hòa tan nước, không chứa chất làm đặc môi trường agar, gelatin… Môi trường thường dùng để nhân giống, lên men, nghiên cứu đặc tính vi sinh vật + Môi trường rắn: môi trường tạo thành cách thêm lượng nhỏ agar, gelatin(10-20%), vào môi trường lỏng Môi trường dùng để phân lập vi sinh vật, quan sát hình thái khuẩn lạc nghiên cứu số đặc tính khác + Mơi trường bán rắn: Là môi trường lỏng, tỉ lệ agar vào khoảng 0.1-1%, có cấu trúc dạng dẻo Mơi trường dùng để sản xuất, thu nhận enzyme,hay xác định khả sinh trưởng, cách chuyển động số loài vi khuẩn + Môi trường thô: Gồm chất chất tạo xốp, tạo enzyme tinh Phân loại theo mục đích sử dụng: + Mơi trường bản: thành phần mơi trường khơng có đặc biệt, thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác + Mơi trường riêng biệt: thích hợp cho số lồi vi sinh vật định + Mơi trường phân lập chẩn đốn: Thích hợp cho số lồi vi sinh vật định để nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa di truyền vi sinh vật IV Tiến hành làm môi trường Là khâu quan trọng việc nghiên cứu sinh trưởng phát triển vi sinh vật Vì vậy, cần phải tiến hành cách cẩn thận, xác Q trình làm mơi trường trải qua bước sau: Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm, nguyên liệu vơ trùng: Rửa với xà phịng Tráng lại với nước cất Sấy Làm nút bông, nút giấy cho ống nghiệm, erlen, gói giấy cho đĩa petri,pipette, que trang….Sau đem tiệt trùng 121oC, at, 15-20 phút - Nguyên liệu vật liệu làm môi trường cần sử lí thích hợp Pha chế: - Từ công thức, thành phần môi trường nuôi cấy nấm men cho 250 ml, pH=6 - Glucose: 12.5g Pepton : 2.5g KH2PO4: 0.75g MgSO4 : 0.75g 10 Hình 6.7: Kết thí nghiệm nhuộm màu phức V Nhận xét: - Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ Vi khuẩn Gram (+) làm khả giữ màu tím tế bào già nên cho kết xác Nếu làm vết bôi dày, tế bào chồng lên nhau, khó quan sát tế bào riêng rẽ Sử dụng q nhiều cồn gây màu tím VI Ứng dụng: Nhuộm Gram: Nhuộm Gram thực thể mẫu dịch thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn Nó cho biết kết nhanh, xác giúp phân biệt bệnh nhiễm khuẩn với trường hợp khác Vi khuẩn: - Tham gia vào q trình chuyển hóa chất tự nhiên, vơ hóa chất cặn - bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái Sản xuất acid hữu dung môi hữu cơ, hợp chất có hoạt tính sinh học cao enzyme, vitamin… Có ý nghĩa quan trọng lên men thực phẩm Ví dụ: nem chua, yaourt… 44 BÀI 7: QUAN SÁT NẤM MỐC Ngày 21 tháng 10 năm 2014 Thời gian: 7h – 11h30 I Mục tiêu thí nghiệm: - Quan sát hình thái, cấu tạo nấm mốc phân biệt chúng Nắm vững cách sử dụng kính hiển vi II Sơ lược lý thuyết: Đặc điểm hình thái - Nấm mốc loại nấm hiển vi có cấu tạo sợi Có hai loại sợi nấm là: sợi có vách ngăn (đa bào) sợi khơng có vách ngăn (đơn bào) - Khi phát triển, sợi chằng chịt làm thành hệ sợi nấm gọi khuẩn ty Một số sợi sinh trưởng cách đâm sâu vào môi trường gọi khuẩn ty chất, phần phát triển bề mặt chất gọi khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty chất hay cịn gọi khuẩn ty dinh dưỡng có nhiệm vụ hút muối khoáng chất dinh dưỡng để ni tồn hệ sợi Khuẩn ty khí sinh có chức hơ hấp mang quan sinh sản bào tử - Nấm mốc không di chuyển phân bố rộng rãi tự nhiên nhờ bào tử phát tán khơng khí - Có hai loại bào tử: báo tử kín bào tử trần - lồi nấm mốc điển hình: Mucor sp, Rhizopus sp, Aspergillus sp, Penicillium sp - Ta chia nấm mốc thành hai nhóm lớn + Có bào tử kín: Mucor Rhizopus + Có bào tử trần: Aspergillus Penicillum Đặc điểm Sợi khuẩn ty Cuống bào tử Bào tử Đơn bào Rhizopus sp Đơn bào, không vách ngăn Đơn bào, khơng vách ngăn, có rễ giả Kín Đa bào Mucor sp Aspergillus sp Đơn bào, không Đa bào, có vách vách ngăn ngăn Đơn bào, phân Đa bào, khơng nhánh rễ giả Kín Trần Bảng 4: Đặc điểm số loại nấm mốc 45 Penicillin sp Đa bào, có vách ngăn Đa bào, khơng rễ giả Trần, có hình chai thể Hình 7.1: Hình dạng Mucor Hình 7.2: Hình dạng Rhizopus Hình 7.3: Hình dạng Penicillium Hình 7.4: Hình dạng Aspergillus Quan sát nấm mốc - Quan sát đại thể: gieo cấy nấm mốc khiết mội trường đặc chọn lọc - đĩa petri, cấy thành đưởng, 1-3 chấm để quan sát khuẩn lạc Nuôi 300C 3-5 ngày sau đem quan sát Chú ý hình dạng sợi nấm, màu sắc, mọc lan hay mọc thẳng đứng hướng lên Quan sát vi thể: lấy mẫu quan sát kính hiển vi, phân biệt sợi khuẩn ty, cuống bào tử, bào tử từ phân biệt loại nấm mốc khác III Tiến hành thí nghiệm: Làm tiêu có ni cấy nấm mốc - Dùng que cấy lấy thạch lỏng lên kính Sau dùng que cấy nhọn, lấy sợi nấm cấy ria xung quanh thạch Lấy kính tiệt trùng, bơi dầu paraffin lên xung quanh sau đậy lại 46 - - Lấy hộp petri tiệt trùng, cho giấy thấm vào, nhỏ vài giọt nước lên giấy thấm để tạo độ ẩm Đặt phiến kính lên giấy thấm, đóng nắp hộp lại, để vào nơi nuối cấy thích hợp ngày, sau lấy quan sát Chú ý ta quan sát xung quanh viền nơi cấy ria, môi trường thạch Đặt tiêu chuẩn bị lên kính hiển vi, dùng vật kính 10 x để quan sát xem có phân nhánh hay khơng chuyển qua vật kính 40x để quan sát phần lại IV Kết nhận xét: Mucor sp Rhizopus sp Hình 7.5: Mucor sp quan sát Hình 7.6: Rhizopus sp quan sát vật kính 10* vật kính 40* Aspegillus sp: Hình 7.7: bào tử trần Aspegillus quan sát vật kính 40* 47 Penicillin sp Hình 7.8: Penicillium quan sát vật kính 10* Hình 7.9: Bào tử Penicillium quan sát vật kính 40* Tuy khơng thể quan sát rõ rang đặc điểm loại nấm mốc dựa vào đặc điểm quan sát như: sợi khuẩn ty, cuống bào tử, bào tử… để phán đoán kết V Ứng dụng: - Dùng quy trình chế biến thực phẩm cần có lên men vi sinh vật Dùng để tổng hợp kháng sinh, acid hữu cơ, vitamin, kích thích tố, số enzymes… Phân giải chất hữu tạo độ màu mỡ cho đất trồng Sống cộng sinh với rễ số loài thực vật, giúp sử dụng chất vô khó tan, tăng suất trồng 48 BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HÓA CARBONHYDRAT CỦA VI SINH VẬT Ngày 28 tháng 10 năm 2014 Thời gian: 7h – 11h30 I Mục tiêu thí nghiệm: - Tìm hiểu khả dị hóa carbonhydrat đường hơ hấp hay lên men Tìm hiểu khả thủy phân tinh bột không mạnh hay yếu thông qua việc đo vịng trịn thủy phân Mục đích để hiểu rõ đặc tính lồi vi sinh vật khảo sát để tạo điều kiện ni cấy thích hợp phục vụ cho sản xuất II Sơ lược lý thuyết: Dị hóa: - Là q trình vi sinh vật phân giải hợp chất hữu phức tạp môi trường tạo thành hợp chất đơn giản mà chúng hấp thụ đồng thời giải phóng lượng để tổng hợp hợp chất cần thiết cho hoạt động sống vi sinh vật - Đồng hóa dị hóa q trình đối lập song chúng phải song song tồn để trì hoạt động sống cho tế bào Carbonhydrat: - Carbonhydrat nguồn carbon chủ yếu hầu hết loại vi sinh vật - Carbonhydrat gồm loại đường đơn, đưởng oligo (tức số đơn phân đường từ đến 10) hay đường đa phân tử + Đường đơn + Đường oligo + Đường đa phân tử - Thực tế vi sinh vật có khả sử dụng loại đường đơn phân tử nên chúng cần dùng hệ enzyme để phân giải loại đường đa phân tử thành loại đường đơn phân tử - Để chuyển hóa loại đường đa phân tử thành loại đường đơn phân tử, vi sinh vật thường dùng hệ enzyme ngoại bào, phần lớn enzyme thủy phân, từ mà ta khảo sát khả thủy phân tinh bột thành đường đơn chúng Ngồi vi sinh vật cịn có hệ enzyme nội bào thể khả oxi hóa khử vi sinh vật Q trình chuyển hóa: đường - Hô hấp: chất nhận điện tử cuối chất vơ + Hơ hấp hiếu khí: chất nhận điện tử oxi C6H12O6 + O2  CO2 + H2O 49 - + Hơ hấp yếm khí: chất nhận điện tử cuối chất vô khác oxi Lên men: chất nhận điện tử cuối hợp chất hữu Sản phẩm cuối thường acid hữu cơ, rượu  So sánh lên men hô hấp - Đều q trình dị hóa, tạo sản phẩm lượng Tạo sản phẩm trung gian gần giống (acid pyruvic) Có tham gia hệ enzyme oxi hóa khử Q trình xảy chuỗi phản ứng oxi hóa khử Sự khác nhau: Lên men - Xảy tế bào chất vi sinh vật - Hơ hấp hiếu khí - Xảy màng ty thể (vi sinh vật có nhân thực) màng tế bào (đối với vi khuẩn) - Không cần oxi - Cần oxi - Quá trình oxi hóa khơng hồn tồn - Q trình oxi hóa hồn tồn - Khơng có chuỗi hơ hấp - Nhiều chuỗi hô hấp - Chất cho nhận điện tử hợp chất hữu - Chất cho điện tử hợp chất hữu cơ chất nhận điện tử hợp chất vô (oxi) - Sản phẩm: hợp chất hữu (các acid hữu - Sản phẩm: hợp chất vô (CO2 H2O) cơ) Bảng 5: So sánh khác lên men hô hấp hiếu khí Hơ hấp yếm khí q trình oxi hóa xảy khơng hồn tồn Trong q trình hơ hấp hiếu khí q trình oxi hóa xảy hồn tồn III Tiến trình thí nghiệm: Làm môi trường OF: - - + Đường: 10g + Pepton: 2g + NaCl: 5g + NaH2PO4: 0,3g + Chất thị: bromthymol blue 1% Chất thị bromthymol blue 1% hiển thị màu môi trường sau: + Acid: vàng + Base: xanh + Trung tính: xanh Tiến hành lên men: Chỉnh pH=7 + Lên men kị khí: • Hấp tiệt trùng mơi trường cịn 45-50oC • Cho 10ml dung dịch OF vào ống nghiệm 50 Hút 0,2ml dung dịch nghiên cứu chủng vi sinh vật cho vào môi trường, đậy nút lại, hút quanh trục ống nghiệm • Hút 1ml paraffin vào ống nghiệm • Hơ miệng ống nghiệm lửa đèn cồn để đuổi khí • Đậy nút bơng • Nhỏ sáp lên nút bơng cho kín miệng ống • Đậy ống nghiệm bao ni lông • Nuôi cấy tủ ấm 32oC ngày lấy quan sát + Lên men hiếu khí • Hấp tiệt trùng mơi trường cịn 45-50oC • Cho 10ml dung dịch OF vào ống nghiệm • Hút 0,2ml dung dịch nghiên cứu chủng vi sinh vật cho vào ống mơi trường, đậy nút bơng lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm • Đậy nút bơng nút giấy lại • Nuôi cấy tủ ấm 32oC ngày lấy quan sát Làm môi trường tinh bột: + Bột chiết nước thịt bò + Tinh bột 10% + Agar 2% + Nước cất - Cân 3g bột chiết nước thịt bò, đổ thêm nước cất vào 1000ml, chia cho tổ, tổ 150ml - Đem hấp tiệt trùng 121oC 15 phút - Cân 1,5g tinh bột 10% 3g agar 2%, thêm nước cất - Tiến hành đổ hộp Petri: + Đổ 50ml môi trường tinh bột vào hộp Petri + Chờ thạch đặc + Cấy điểm vi sinh vật lên mặt thạch + Lật ngược hộp thạch + Gói giấy + Nuôi cấy 48 30oC + Nhỏ lugol lên bề mặt thạch + Kết luận có enzyme ngoại bào (amylase) •  Lưu ý: - - Phương pháp cấy điểm: + Khử trùng que cấy + Dùng que cấy chấm vào canh trường lấy vi sinh vật + Ghim vào mặt thạch đĩa Petri + Nhanh chóng lấy que cấy khử trùng khử trùng vị trí mở hộp Petri Các chủng vi sinh vật nghiên cứu: + Nấm men + Nấm mốc 51 + Lactobacillus Acidofillus + Bacillus Subtilic IV Kết thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Vi sinh vật Nấm men Nấm mốc Bacillus Subtilic Lactobacillus Acidofillus Ống kiểm chứng Hiếu khí Yếm khí Dung dịch vàng đục, Dung dịch vàng, không tạo không tạo váng váng, đáy đục Dung dịch vàng Dung dịch vàng trong, trong, xanh xanh trong, lớp trong, khơng có váng parafin có váng Dung dịch vàng Dung dịch xanh khơng có có váng váng Dung dịch vàng Dung dịch vàng khơng có khơng có váng váng Không tượng Vẫn màu xanh rêu lúc đầu Bảng 6: Kết thí nghiệm Hình 8.1: Kết thí nghiệm Thí nghiệm 2: 52 - Hình 8.2: Kết thí nghiệm Ở hộp Petri vi sinh vật phát triển thành hình trịn, bao quanh hình trịn hình vành khun trong, tới lớp môi trường đục Sauk hi nhỏ lugol vào tạo mơi trường từ đục thành màu tím đen (do iod tạo phức với tinh bột) cịn hình vành khun khơng đổi màu vị trí khơng thấy vi sinh vật chúng thủy phân hết tinh bột để cung cấp lượng thực cho trình trao đổi chất V Nhận xét: - - Bacillus subtilic: lên men không sinh loại đường glucose, saccharose, xylose… Đồng thời có khả tiết enzyme ngoại bào Nó vi khuẩn hiếu khí phát triển điều kiện kị khí nên lên men ống nghiệm điều kiện kị khí hiếu khí Saccaromyces có khả lên men điều kiện hiếu khí kị khí Chúng nhóm vi sinh vật kị khí tùy tiện Khi môi trường đủ loại oxi, nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn lượng cấu tạo tế bào tăng sinh khối Trường hợp thiếu oxi (kị khí) nấm men sử dụng phần oxi hịa tan mơi trường để sinh 53 - - - trưởng chủ yếu lên men Trong trình lên men giai đoạn đầu, yêu cầu oxi cao để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối Aspegillus Oryzea: hiếu khí tồn  hơ hấp hiếu khí  khơng lên men + Ống hiếu khí: hơ hấp hiếu khí, tạo acid pyruvic nhiều nên có màu vàng đậm, có váng lên Nếu để lâu ngày ta thấy bề mặt sợi khuẩn ti màu xanh chằng chịt nhau, bịt kín miệng ống nên nghiêng ống nghiệm môi trường bên không di chuyển ống khác Dưới đáy ống nghiệm có kết tủa, sợi nấm sinh bào tử bào tử rụng chìm xuống đáy + Ống yếm khí: theo lý thuyết khơng xảy tượng nên phải có màu xanh Tuy nhiên quan sát thấy ống nghiệm có màu vàng do: • Lúc đầu cho mơi trường vào ống nghiệm cịn sót lại oxi nên xảy hơ hấp yếm khí sinh acid pyruvic • Hoặc bị tạp nhiễm Lactobacillus Subtilic: vi sinh vật hiếu khí lên men điều kiện kị khí Do nên điều kiện hiếu khí khơng lên men Tuy nhiên có hệ enzyme ngoại bào có khả chống chịu lại với oxi khơng khí nên làm cho dung dịch có màu xanh nhạt so với ban đầu Nếu để thời gian ni lâu dung dịch chuyển sang màu vàng Còn điều kiện kị khí dung dịch có màu vàng ánh xanh thời gian nuôi chưa đủ, vi khuẩn chưa lên men hoàn toàn Hiện tượng tạo váng sinh khối vi sinh vật VI Ứng dụng: Biết tính chất sinh hóa vi sinh vật ta có hướng ứng dụng vào thực tế - - - Sản xuất sinh khối protein đơn bào + Lên men chất thải từ nhà máy chế biến rau quả, bột sữa… để thu sinh khối làm thức ăn chăn nuôi + Sản xuất acid amin cần thiết glutamic… + Sản xuất số acid amin không thay cho người gia súc Sản xuất chất xúc tác sinh học + Amylase: làm tương, rượu nếp, sản xuất bánh kẹo + Protease: chế biến thịt, sản xuất bột giặt + Cellulose: xử lý rác thải + Lypase: sản xuất bột giặt, chất tẩy rửa + Enzyme cắt nối: ứng dụng kỹ thuật chuyển gen Sản xuất gum sinh học 54 Bài 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG Ngày tháng 11 năm 2014 Thời gian: 7h -11h30p I Mục tiêu thí nghiệm: - Chuẩn bị mơi trường nhằm xác định khả lên men loại đường (đường nhiều, pepton ít) - Khảo sát khả lên men khác vi sinh vật khác loại đường khác Đánh giá sản phẩm q trình lên men acid, rượu, khí CO2 - II Sơ lược lý thuyết: Nguyên lí: - Khơng phải vi sinh vật có khả men lên men với loại đường - Sản phẩm trình lên men: Acid hữu cơ, rượu hay số hợp chất khác khơng có tính acid, tạo khí CO2 không tạo Phương pháp:  Môi trường ống thử lên men M10 - Đường: 5g Pepton: 10g Bột chiết nấm men: 5g Dung dịch chất thị: 2ml Nước cất vừa đủ: 1l pH cuối: 6,8-7,2 Tiệt trùng môi trường 121oC thời gian 15 phút Để pha dung dịch chất thị, hòa tan 8g Bromthymol blue vào hỗn hợp 250ml ethanol 90% 250ml nước cất  Với chất thị Bromthymol blue: - Nếu mơi trường sau lên men có acid, dung dịch có màu vàng Nếu mơi trường sau lên men khơng có acid, mơi trường trung tính, dung dịch có màu xanh  Khí CO2 tạo bị giữ lại ống Durham 55  Nếu thời gian lên men dài, vi sinh vật sử dụng hết đường, chuyển qua dịch pepton, làm tăng pH môi trường, chuyển sang màu xanh dương III Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị mơi trường: - erlen chứa môi trường sở: 10g pepton 5g bột chiết nấm men 2ml dung dịch chất thị màu Thêm nước cất vừa đủ 1l, chuẩn tới pH=7 - erlen chứa loại đường: glucose, saccharose, maltose, lactose với nồng độ 5% Mỗi loại gồm 5g đường pha với nước cất vừa đủ 100ml - Đem tất hấp tiệt trùng autoclave 121oC 15 phút Cấy vi sinh vật vào môi trường khảo sát: - Phân phối vào 13 ống nghiệm, 9ml môi trường sở - Cho 1ml dung dịch glucose vào ống làm ống chuẩn - Cho 1ml đung dịch đường loại vào 12 ống, loại đường ống - Cho nước cất vào đầy ống Durham, khơng cong bọt khí, cho vào ống thí nghiệm - Làm nút bông, hấp tiệt trùng Autoclave 121oC 15 phút - Cấy loại vi sinh vật vào 12 ống, loại vào ống chứa loại đường khác nhau: Lactobacillus acidophilus, Acetobacter xylinum, Sacharomyces cerevisiae - Đuổi khí, làm nút bơng, đốt nến, bọc nilon bên ngồi nhằm tạo mơi trường yếm khí - Ni tủ ấm vịng 48h - Quan sát ghi nhận kết IV Kết thí nghiệm: Vi sinh vật Đường Sinh khí Sacharomyce s Cerevisiae Maltose Glucose Lactose Saccharos e Maltose Glucose Lactose Saccharos e Maltose Glucose Có Có Lactobacillus Acidophilus Acetobacter xylinum Tạo bọt Có Đục, kết Váng tủa Có Có Có Có Có Có Có Có Có 56 Có Có Màu Vàng đục Vàng đục Xanh Vàng đục Có Có Có Có,ít Vàng đục Vàng Vàng đục Vàng Có Vàng Vàng Lactose Có Saccharos e Có khí, Có Có Durham Khơng Bảng 7: Kết thí nghiệm Mẫu kiểm chứng Có Có có Vàng xanh Vàng đục Khơng Xanh Hình 9.1: Mẫu thí nghiệm kiểm chứng, đường lactose, Glucose, Maltose Hình 9.2: Mẫu thí nghiệm đường Saccharose V Nhận xét: 57 - - - - Nấm men Sacharomyces Cerevisiae lên men đường Glucose, Maltose, Saccharose tốt mơi trường kị khí Tạo acid pyrucic theo chu trình EMP làm giảm pH môi trường Tuy nhiên nấm men Sacharomyces Cerevisiae khơng thể lên men Lactose tạo ethylen khí CO2, nên ống nghiệm có màu xanh Qua ống nghiệm chứa nấm men váng nấm men lên men nổi, sinh khối chúng lơ lửng lên bề mặt tạo váng Vi khuẩn Lactobacillus Acidophilus vi sinh vật hiếu khí, có khả lên men tất loại đường Quá trình lên men lactic điều kiện kị khí sinh acid lactic, làm giảm pH môi trường khiến dung dịch chuyển màu vàng, khơng sinh khí Tất ống tạo váng bề mặt sinh khối vi khuẩn tạo Acetobacter xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy tế bào vi khuẩn, glucose kết hợp với acid béo tạo thành tiền chất nằm màng tế bào Nó ngồi với enzyme Enzyme polyme hóa Glucose thành cellulose A.xylinum sử dụng glucose, maltose, lactose, dextrin, saccharose Acetobacter xylinum vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Nên loại đường lên men tạo khí CO2 váng lên sinh khối vi sinh vật Riêng ống chuẩn cho đường, khơng tạo khí, khơng tạo váng, kết tủa… màu xanh Do đó, ống khơng bị nhiễm tạp cho thấy thao tác làm thí nghiệm 58