Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm trần linh thước

Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần iớn các trường hợp là có nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện d

TRẦN LINH THƯỚC

PHIÍONG PHÁP PHÂN TÍCH

NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC

LỞI NÓI DfiU

ĩ(/gộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên, trỏ

thành mối quan tâm của toàn xã hộ ị Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần iớn các trường hợp là có nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này trong nưỏc uống, thực phẩm Ngày nay, an toàn, nhất là về phưdng diện vi sinh vật, trở thành một trong những yêu cẩu không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm.

Việt Nam là một nước nông nghiệp có tiềm lực lớn về sản xuất nông sản, thủy hải sản, thực phẩm Ngoài thị trường tiêu thụ

nội địa cho gần 80 triệu dân, thực phẩm và thủy sản của nước ta củng đã xuất khẩu được ra thị trường thế giới Đặc biệt, thủy, hải sản chế biến của Việt Nam đã có được thị phần quan trọng tại Bắc Mỹ, châu Ầu, Nhật Bản„, là một trong những ngành kinh tế mang lại ngoại tệ quan trọng cho đất nước, giải quyết việc làm cho một số lượng lớn người lao động ở cả nông thôn và thành thị Do nhận thức ngày càng được nâng cao của người tiêu dùng trong nước về an toàn vệ sinh thực phẩm và sự tăng cường về quản lý nhà nước, kiểm tra, giảm sát của cảc cd quan chức năng, việc phân tích vi sinh vệt gây bệnh và thực hiện các biện pháp đảm bảo sản xuất, chế biến thực phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn về vi sinh vật ngày càng được cảc đdn vị sản xuất, chể biến thực phẩm nội địa quan tâm Đối vổ ị thủy hải sản xuất khẩu, để đáp ứng tiêu chuẩn nghiêm ngặt về vi sinh của các thị trường thế giới và tăng cường năng lực cạnh tranh, trong những năm gần đây, các đdn vị sản xuất chế biến thủy hải sản xuất khẩu Việt Nam đã rất chú trọng đến việc đầu tư đổi mới công nghệ, thực thi các chưdng trình quản lý đảm bảo chất lượng như HACCP <1) , trong đó việc xây dựng phòng phân tích, kiểm định và đào tạo cản bộ phân tích, kiểm định vi sinh vật ngày càng được quan tâm.

Như vậy, hiện nay đang có một nhu cầu thực tiễn rất lớn về phía nhà sản xuất cũng như về phía người lao động về đào tạo cán bộ phân tích vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Nhà sản xuất có phòng thí nghiệm phân tích tốt, có đột ngũ phân tích có tay nghề cao sẽ dễ thuyết phục, tạo được niềm tin ở đối tác để ký kết các hợp đồng sản xuất quan trọng Cán bộ kỹ thuật, kỹ thuật viên được đào tạo, nâng cao kỹ năng về phân tích vị sinh vật sẻ dễ củng cô' vai trò và sự cần thiết của mình đối vôi đơn vị Thanh niên, học sihh, sinh viên được đào tạo về phân tích vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm sẽ có lợi thế hơn trong tìm việc Ịàm trong lĩnh vực sản xuất, chế biến thực phẩm, đặc biệt là thủy hải sản xuất khẩu.

Mặt khác, sau thực phẩm, nhu cầu về làm đẹp đồ trỏ thành mối quan tâm rất quan trọng của xã hội khi đời sống kinh tế ngày càng được cải thiện Thị trường và chủng loại mỹ phẩm được sản xuất và tiêu thụ tạ ị Việt Nam ngày càng được mở rộng Mặc dù không được

iU HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Points (Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn).

đưa vào đường tiêu hóa, nhưng sự tiếp xúc trực tiếp, thường xuyên của mỹ phẩm lên da, mặt mắt, cơ thể là điều kiện rất tốt cho

sự tấn công của ví sinh vật gây bệnh, gây hại lên người sử dụng Sự hiện diện của vi sinh vật, nhất là vi sinh vật gây bệnh trong mỹ phẩm tạo ra mối nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng, rất đáng được quan tâm Trên thực tế, ngày nay, các hãng

mỹ phẩm lớn, có uy tín rất coi trọng việc kiểm soát vi sinh vật trong mỹ phẩm Do vậy, tuy quy mô không được tương xứng như ở lĩnh vực thực phẩm, nhưng cũng đang cỏ một nhu cầu thực tiễn khá lớn về đào tạo cán bộ phân tích vi sinh vật trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm.

Quyển sách 'Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm" được biên soạn nhằm đáp ứng

các nhu cầu thực tiễn nêu trên Sách cung cấp các kiến thức cô đọng về các vị sinh vật gây bệnh, các chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm soát trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, các yêu cầu cơ bản trong viẹc thành lập và vận hành một phòng kiểm nghiêm

vi sinh vật Phần quan trọng nhất được dành cho các nội dung về phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mầu, các kỹ thuật cơ bản trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, quy trình phân tỉch các chỉ tiêu vi sinh vật thường được yêu cầu trong nước, thực phẩm và

mỹ phẩm Để tham khảo và tạo điều kiện tiếp cận cấc kỹ thuật và phương pháp mới, ngoài các phương phấp, quy trình chuẩn, sách củng giới thiệu các phương pháp mới như các phương pháp thử nhanh, phương pháp miền dịch, phương pháp lai phân tử, phương

pháp PCR- được gọi chung là các phương pháp không truyền thống, đang ngày càng được sử dụng rộng rải và có khả năng được

công nhận là phương pháp chuẩn trong tương lai.

Đây là tài liệu được biên soạn trên cơ sở cầc tài liệu thực tập về vi sinh vật học đại cương, phân tích vi sinh vật trong thực phẩm được giảng dạy trong thời gian qua tại Khoa Sinh học Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, cùng cảc tài liệu tham khảo trong và ngoài nước khác Sách có thể được sử dụng một phẩn hay toàn bộ làm giáo trình về phân tỉch, kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm trong các trường trung học chuyên nghiệp, cao đẳng và đại học Sách cũng thích hợp cho kỷ thuật viên cảc phòng phân tlch, sinh viên, học viên sau đại học đã được trang bị kiến thức về vị sinh học đại cương để thực hiện các

thỉ nghiệm, phản tfch các chỉ tiêu vi sinh vật trong nước, thực phẩm hay mỹ phẩm.

Tác giả xin chân thành cảm ơn Nhà Xuất bản Giáo dục đã tạớ điều kiện thuận lợi cho việc xuất bản quyển sách này Tác giả cũng cảm ơn các anh chị học viên cao học đả có nhiều đóng góp trong quá trình chuẩn bị bản thảo.

Lấn xuất bản đẩu tiên của 'quyển sách chắc chắn không tránh khỏi nhiều sai sỏt Rất mong được các đổng nghiệp và bạn dọc góp ý để lấn xuất bàn sau sách được hoàn thiện hơn.

CHƯƠNG II YÊU CẦU Cơ BẢN CỦA PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

1 Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật 30

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MAU

CHƯƠNG IV KỶ THUẬT cơ BẢN TRONG PHÂN TÍCH,

KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

Salmonella

Hình 1.1 Salmonella (ảnh chụp qua ■ kính

hiển vi điện tử)

4.1.5 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate 81

4.1.12.Thử nghiệm khả năng sinh indol 88 4.1.13 Thử nghiệm KIA, TSI 89 4.1.14 Thử nghiệm nítratase 91 4.1.15 Thử nghiệm oxidase 92 4.1.16 Thử nghiệm ONPG 93 4.1.17.Thử nghiệm MR (Methyl Red) 94 4.1.18.Thử nghiệm VF (Voges-Proskauer) 95 4.1.19 Thử nghiêm CAMP 96 4.1.20 Thứ nghiệm tính di động 98

4.2 Các bộ kit sinh hóa định danh vi sinh vật và các hệ thống

99 định danh tự động

CHƯƠNG V QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT

CHƯƠNG Vỉ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỔNG TRUYEN thông

1 Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 166

5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT) 181

1.1 Vi sinh vật gây bệnh trong nước và thực phẩm

Nước và thực phẩm nuôi sô'ng con người nhưng cũng có thể gây ngộ dộc hoặc nhiễm bệnh cho con người do có thể chứa các độc tô' vi sinh vật, độc tô' hóa học hoặc chứa các vi sinh vật gây bệnh.

Có râ't nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi sinh vật hiện diện trong nước và thực phẩm Ngộ dộc thực phẩm thường dược hiểu là các triệu chứng gây ra bởi độc tố của vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm và nhiễm bệnh bởi vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do sử dụng thức ăn chứa các vi sinh vật gây bệnh Tuy nhiên hiện nay, khái niệm ngộ độc thực phẩm còn

nguyên liệu hay bị nhiễm vào trong quá trình chế biến vì trong quá trình chế biến hay bảo quản, các vi sinh vật này và độc tô' của chúng có thể tăng lên nhanh đến mức gây ngộ độc.

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệu chứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm Tuy nhiên mức độ tác động sẽ khác nhau phụ thuộc khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực

các vụ ngộ độc khác nhau tùy thuộc vào tác nhân vi sinh vật và được gây ra bởi độc tô' do vi sinh vật tạo ra và tiết vào thực phẩm (trường hợp này được gọi là ngoại độc tô') hay bởi độc tố nằm trong

tế bào vi sinh vật (nội độc tố).

Đối với nước và thực phẩm, các vi sinh vật được quan tâm cần kiểm soát là các vi sinh vật gấy

thể bằng đường phân sẽ làm ô nhiễm nguồn nước bị nhiễm phân này Nước trở thành môi

Sau đây là một số đặc điểm liên quan đến các vi sinh vật gây ngộ độc, gây bệnh chính hoặc một số nhóm vi

sinh vật có liên quan khác thường được quan tâm trong nước và thựcphẩm :

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến

mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm Các triệu chứng do

Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ

bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệuchứng được biểu hiện là 12 - 36 giờ Triệu chứng ngộ độc thường kéodài từ 2 - 7 ngày Không phải tâ"t cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm

bị nhiễm Salmonella đều bị ngộ độc Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản

phẩm từ trứng, thủy sản Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm nàythường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp

Đặc biệt nguy hiểm cho người là các loài Salmonella typhi, s.

gian ủ bệnh phụ thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn đã xâm nhiễm và thể trạng của từng

bệnh nhân Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng trong môi trường có hàm lượng

muối cao, thường phân lập được từ các sản phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm ven bờ

biển

Campylobacter

Campylobacter gây bệnh viêm nhiễm

đường ruột, hiện diện khắp nơi, đặc biệt trong

hệ vi sinh vật của nhiều loại động vật và chim

Tuy nhiên các dòng Campylobacter gây ngộ độc

thực phẩm thuộc loại ưa nhiệt bắt buộc, không

thế phát triến ỏ' nhiệt độ thấp hơn

3 0 ° c Các triệu chứng ngộ độc do

vi sinh vật này gây ra là đau nhức, tiêu cháy,

sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng,

mê sang, thỉnh thoáng có những biểu .hiện

bệnh giông như cảm cúm Thời gian ủ bệnh từ

2 - 1 1 ngày Các sản phẩm sữa, thịt gia cầm,

nước là nguồn có thể gây nên ngộ độc do Campylobacter Campylobacter có thể hiện diện trong các loại thực phẩm hút

chân không Các loài này rất nhạy cảm với nhiệt độ và acid nên có thê bị tiệt trùng hoàn toàn bằng phương phápthanh trùng Pasteur và không tăng trưởng được trong thực phấm có tính acid

Clostridium perfrirtgens

c perfringens được tìm thấy trong' đất, trong phân người Trước đây người ta cho rằng chi các dòng

c perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm Ngày nay, đã

có những ghi nhận các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra bới các dòng c perfringens nhạy cảm với nhiệt, không làm tan

máu Các triệu chứng ngộ độc do độc t<3 của vi sinh vật này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu chảy Thời gian ủbệnh từ 12 - 24 giờ Nguồn thực phẩm có thế chứa các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là gia cầm đônglạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác Bào tử của c perfringen có tính bền đối với nhiệt

nên chúng có thể sông sót qua quá trinh nâu chín, đặc biệt là khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn.Các bào tử sông sót này khi gặp điều kiện thích hợp sẽ nấy mầm, tăng trưởng

Clostridium botulinum

Loài vi sinh vật này phân bố khắp nơi trong đất, nước, trong đường ruột các gia súc và các loài thủy sản Visinh vật này sinh độc tố botulin gây ngộ độc thịt làm thực phẩm cho người Triệu chứng lâm sàng khi ngộ độc là óimửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh

như choáng váng, rối loạn thị

giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng,

đau ở vùng ngực, khó thở và bê liệt,

có thể dẫn đến tử vong, Các triệu

chứng trên biểu hiện 12 - 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm độc tố và kéo dài 2 - 6 ngày tùy theo mức độ nhiễm độc và tình trạng sức khoẻ của từng bệnh nhân Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biẽn không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao Điều kiện thích hợp cho sự tàng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh vật khác cạnh tranh Độc tô" botulin do c botulinum tiết ra gồm

E thường có nguồn gốc từ cá và các sản phẩm thủy sản Dòng vi sinh vật này thường phan lập được từ các mẫu bùn đáy tại các cửa sông.

Staphylococcus aureus

Trong tự nhiên Staphylococcus aureus thường được tìm thây trên

da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng Staphylococcus

aureus sản sinh một sô" loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt,

không bị phân hủy ở 1 0 0 ° c trong 30 phút Khi ãn phảithực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 - 6 giờ người bị ngộ độc cócác triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 - 8 giờ Các loại thựcphẩm có chứa nhiều muôi nhưjambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khiđược xử lý ơ nhiệt độ cao hơn 40°C).và các loại thủy sản, thực phẩmđóng hộp thường hay nhiễm loài vi sinh vật này Con đường lâynhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến

1 1

Hình 1.5 Víbrio (ảnh chụp qua kính

hiển ví điện tử)Kni an pnai tnục pnam DỊ nniem moi

gian ủ bệnh phụ thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn đã xâm nhiễm và thể trạng của từng

bệnh nhân Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng trong môi trường có hàm lượng

muối cao, thường phân lập được từ các sản phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm ven bờ

Các loài Vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na+ để phát triển; một sô loài có khả năng

gây bệnh cho người là Vihrio cholerae, V parahaemoỉyticus, V vulniịìcus, vr hoílisac, V Ịurnsii, V mimicus, V fluvialis,

V alginoỉyticus, K cholerae là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới Loài vi sinh vật này được chia thành

hai kiểu huyết thanh chính lầ OỊ và không Oì Ínon-Oi) Kiểu huyết thanh 0, lại gồm ba kiểu huyết thanh phụ làOgawa, Inaba và Eỉtor (còn được gọi là kiểu 0139) Hai kiểu huyết thanh Inaba và Ogawa ngày nay chỉ còn được tìmthấy tại các nước thuộc khu vực châu Á Trong khi đó, các vụ dịch tả trên khắp thế giới lại gây ra bởi kiểu Eltor

Dịch tả gây ra bởi V cholerae thường được lan truyền rất nhanh qua đường nước, gây nhiễm thực phấm và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ sinh kém V cholerae tạo ra độc tố tả cholerae-toxìn, có độc tính mạnh: chỉ cần

5pg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêu chảy cho người trưởng thành Ngoài độc tô' tả, loài này cũng tiết ramột sỏ' độc tố khác như hemolysin có độc tính tương tự tetrodotoxin của cá nóc hay độc tố tương tự shiga- toxin.Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây, rau quả, sữa và các sản phẩmsữa, các loại thủy sản tươi sống (không qua gia nhiệt hay gia nhiệt nhẹ)

Một loài gây ngộ độcthực phẩm quan trọng

độc tô' hemolysin bềnnhiệt có phản ứng

Kanagawa Tuy nhiên,những năm gần đâyngười ta phát hiện rarằng nhiều dòng V

phản ứng Kanagawa

âm tính cũng có thếgây bệnh Triệu chứng

1 3

Hình 1.6 E coli (ảnh chụp qua kính hiển vi

E coỉi là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện

trong đường ruột của người và các loài động vật

máu nóng Hầu hết các dòng E coỉi không gây hại

và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh

lý đường ruột Tuy nhiên có 4 dòng có thề gây

bệnh cho người và một số loài động vật là

Enteropathogenic E, coỉi (EPEC), Enterotoxigenic

E coli (ETEC), Enteroinvasive E coỉi (EIEC) và

Enterohaemorrhagic E coỉi (EHEC)/Verocytoxin

E coỉi (VTEC) hay E coỉi 0157: H7 Các loài E.

coỉi hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm

phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường Gần đây người ta còn chứng minh được rằng

E coli cũng hiện diện ồ những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ Do sự phân bô' rộng rãi trong tự nhiên

nên E coỉi dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến Các dòng E coỉỉ gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ

đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc vào mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từngngười

Shigelia spp.

Giống Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae)

gồm 4 loài khác nhau là s dysenteriae, s sonnei, s plexneri và s.

hoydii Các loài Shígeỉỉa có tính chuyên biệt ký chủ cao, chỉ xâm nhiễm

và tăng trưởng trong người và các loài linh trưởng Do vậy, các loài

Shigella hiện diện trong môi trường là có nguồn gốc từ phân người hoặc

phân các loài linh trưởng Trong môi trường nước các loài này có thể

tồn tại hơn 6 tháng Các vụ ngộ độc thực phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở các nước kém phát triển, nơi việc sản xuất chế biến thực phẩm được thực hiện trong điều kiện vệ sinh không đảm bảo Shigelỉa cũng có thể lây nhiễm trực tiếp từ người qua người Shigeỉỉa chủ yếu gây

nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực trùng) trong khoảng 1 - 7 ngày saukhi sử dụng thực phẩm bị nhiễm

4

Biếu hiện bệnh lý có thế thay đổi từ dạng nhẹ như tiêu cháy nhẹ đến mức nghiêm trọng (đặc biệt là ỏ' trẻ om vàngười già) như đi tiêu ra máu, có những mảnh niêm mạc ruột, màt nước, sốt cao và bị co rút thành bụng Các triệuchứng trên có thể kéo dài từ 12 - 14 ngcày thậm chí lâu hơn, Hàng năm có khoảng nửa triệu người tử vong do vi sinh

vật gây bệnh này Vi khuẩn Shigella lây nhiễm chủ yếu qua nước và thực phẩm Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ

nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm

Conforms

Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng dể chi thị khá năng có sự hiện diệncủa các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Nhóm Coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram

âm, không sinh bào tử, hình que, lỏn men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng Dựa vào nhiệt

độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành hai nhóm nhỏ là Coliform và Coliform phân có nguồn gốc từ phân củacác loài động vật Trên thực tế kiểm nghiệm Coliform phân được quan tâm nhiều hơn Coliform Coliform phán có

nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter Khi

Coliíbrm phân hiện diện ớ số’ lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng

chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân Trong các thành viên của nhóm Coliform phân thì E coli là loài

được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm

Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở trẻ em, phụ nữ mang thai hay người già trong

những năm gần đây Mặc dù L monocytogenes chỉ hiện diện với sô' lượng nhỏ trong thực phẩm, nhưng khi được đưa

vào cơ thể, chúng tồn tại, khi có điều kiện thuận lợi sẽ tăng trưởng nhanh xâm nhiễm vào các mô sâu hơn và gâybệnh Triệu chứng bệnh thường bắt đầu là tiêu chảy, sốt nhẹ sau đó là nhiễm trùng máu, tổn thương hệ thần kinh

trung ương, tim, mắt; gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi ở phụ nữ mang thai L monocytogenes ưa

lạnh, tăng trưởng được ơ nhiệt độ từ 2 - 44°c, thường được phân lập từ phô mai, sữa, thịt cá, rau quả và trong nước.

Loài này có thể nhiễm vào thực phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả Đặc

biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ơ nhiệt độ thấp, loài này có cơ hội tăng trưởng thành số lượng lớn Các sảnphẩm được thanh trùng bằng phương pháp Pasteur và được bảo quản trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vậtnày rât cao

1 5

Bacillus cereus

Hình 1.8 B cereus (ảnh chụp qua kính hiển vi

điện tủ')

B cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5

-50°c, tối ưu ở 35 - 40°C; pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mẩm râ"t dễ dàng Vi khuẩn này hiện

diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô ) Vi khuẩn có thể tiết rahai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa Ngộ độc thực phẩm gây ra bơi

B ccreus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được gi ừ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng.

Thực phẩm chứa vi khuẩn ờ mạt độ trên 10h tế bào/g đủ gây ngộ độc Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởi B,

cereits là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 - 16 giò' sau khi án thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 - 24

giờ Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 - 5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, khỏng bịtiêu chảv, kéo dài khoảng 24 giờ

Aspergillus

Aspergillus flauits và A parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các loài nấm mốc có khả năng tạo độc

tỏ" mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm Độc tô" mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này đượcgọi chung là aílatoxin có khả năng gây ung thư Gác nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 7 -'401JC và tôi ưu ở

24 - 28°c, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa miến, đậu phộng, bắp, lúa

mì ) không được phơi sấy tốt, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt độ không khí cao Từcác nguyên liệu này, nấm mốc và độc tô" có thể nhiễm vào thực phẩm gây độc cho người, ơ các chủng có khả năngsinh độc tỏ", sau khi tăng trưởng 1 - 3 ngày độc tô" được tạo ra và tiết vào cơ chất Bốn loại aílatoxin được tạo ra bởi

A ỷĩavus và A parasiticus là aílatoxin Bi, B2 phát huỳnh quang màu xanh (blue) và G|, phát huỳnh quang màu lục(green) Khi ãn cỏ hoặc thức ăn chứa aílatoxin B] hoặc B^, bò sữa có thể chuyển hóa chúng thành các độc tốaílatoxin MỊ, M>> hiện diện trong sữa bò Do aílatoxin là chất gáy ung thư mạnh nên được kiểm tra nghiêm ngặt.Hầu hết các nước đều có tiêu chuẩn quốc gia về hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tô này trong nôngsản, thực phẩm, thường là lOppb (một phần tỷ)

Virus

Các vụ dịch bệnh gây ra do tác nhân virus từ thực phám cho đến nay vẫn là vân đề bí

ẩn Các nghiên cứu về virus thực phẩm, đặc điểm sinh lý của virus đường ruột, phương phápnuôi cấy, phát hiện virus trong thực phẩm cho đến nay vần còn nhiều hạn chế Tuy nhiên,bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, kỹ thuật PCR người ta có thể phát hiệnvirus có hại cho con người trong thực phẩm Sự lan truyền virus qua người thông qua đườngmiệng đã được biết từ những năm 1950 Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu

có nguồn gốc từ các sản phẩm thủy sản Trong khoảng hơn 100 loại virus đường ruột đượcbiết hiện nay chí một vài loại có khả năng gây bệnh cho người (Hepatitis type A virus, HAV,Norwalk virus, Calicivirus, Astrovirus, Virus Non A, Virus Non B) Virus tồn tại ở thể

không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, không thể tự nhân lên trong nước hay trong thực

phẩm Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ônhiễm Các loài nhuyễn thể ăn lọc như nghêu, sò có khả năng tích lũy nhiều virus trongnước làm mật độ virus trong nhuyễn thế cao hơn rất nhiều so với môi trường nước xungquanh Liều lượng gây nhiễm của virus từ thực phẩm có thế thấp hơn rất nhiều so với vikhuẩn Virus hiện diện trong cơ thế người và các loài động vật và được tìm thây với số lượnglớn trong phân của những người bị nhiễm, tồn tại từ nhiều ngày đến nhiều tuần Nước bịnhiểm phân là con đường lây nhiễm gián tiếp hay trực tiếp của virus vào thực phẩm Khảnăng sông sót của virus trong mỏi trường hay trong thực phẩm phụ thuộc vào các yếu tô' :nhiệt độ, nồng độ muôi, cường độ bức xạ mặt trời hay sự hiện diện của các thành phần hữu

cơ khác Tất cả virus đường rưột đều có tính kháng với acid, các enzym thủy phân, muôi mật

có trong đường tiêu hóa Một số’ virus có thể kháng nhiệt như virus viêm gan siêu vi A(HAV), hoặc kháng phenol, ethanol 0 zôn và chlorine là những tác nhân có thể làm bấthoạt một vài loại virus đường ruột Đế ngăn ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loạithức ăn phải được nấu chín đế khử virus trước khi dùng, các loại nhuyễn thể ăn lọc phải đượckhai tlhác từ những vùng nước không nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạchtrước khi tiêu thụ

1.2 Vi sinh vật trong mỹ phẩm

Trước đây ngành công nghiệp mỳ phẩm không xem trọng công tác kiểm nghiệm visinh vật Người ta cho rằng mỹ phẩm không nhất thiết phải ở trạng thái vô trùng vì vi sinhvật hiện diện khắp nơi, có thế nhiễm vào mỹ phẩm bâ't kỳ lủc nào Ngoài ra, các biện phápnhằm ngăn chặn sự nhiễm vi sinh vật vào mỹ phẩm lại có thể ảnh hương đến mặt thẩm mỹcủa sản phẩm Tuy nhiên gẳn đây các kiến thức về sự gây hỏng mỹ phẩm và hậu quả bởi visinh vật ngày càng được tích lũy do vậy việc kiểm nghiệm vi sinh vật trở nên rất cần thiếtđối với các nhà sản xuât mỹ phẩm Mặt khác, hiện nay các loại mỹ phẩm sử dụng các thànhphần có nguồn gốc thiên nhiên rất được người tiêu dùng ưa chuộng Việc đưa các thành phầnnày vào mỹ phẩm tạo diều kiện cho vi sinh vật tăng trương dễ hơn Vi sinh vật tăng trưởngtrong mỹ phẩm khi tiếp xúc với da, nhất là ở chỗ da bị rách hay tổn thương, có thể gây nhiễmcho người sử dụng Nguy cơ gây nhiễm này càng cao ở các loại mỹ phẩm sử dụng cho trẻ sơsinh, người già, người có sức khỏe yếu cũng như người bệnh đang được điều trị Sự nhiễm

và gây hỏng mỹ phẩm bởi vi sinh vật có thể xảy ra trong quá trình sản xuất cũng như sau khisản phẩm đã được bán Vì vậy, trong mỹ phẩm, các chât bảo quản có tác dụng diệt khuẩn

khác nhau được sử dụng nhằm mục đích ngăn cản sự gây hỏng mỹ phẩm bởi vi sinh vật đếkéo dài thời gian sử dụng và bảo vệ người sử dụng tránh nguy cơ nhiễm vi sinh vật có hại;mặt khác, cần có sự tham gia của các nhà vi sinh vật trong sản xuất mỹ phẩm kể từ giai đoạnrất sớm như phát triển sản phẩm Sự nhiễm và tăng trưởng của vi sinh vật có thể được pháthiện bằng mắt thường như sự xuất hiện khuẩn lạc nấm men, nấm mốc trên bề mặt mỹ phẩm,

sự trở đục hoặc lắng tụ của mỹ phẩm dạng lỏng, sự xuất hiện màu lạ, sự tạo bọt khí Việc nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong mỷ phẩm có thể gây hậu quả rất lớn Ví dụkem dưỡng tay được dùng rất nhiều trong bệnh viện Các mỹ phẩm đã qua sử dụng rất dễ bị

nhiễm các loài Staphylococcus, Micrococcus, nấm môc, nám nem Đặc biệt trong bệnh viện dễ xảy ra dịch nhiễm trùng máu bởi Klebsiella pneumoniae được tìm thấy bị nhiễm trong các lọ

lanolin hay kem dưỡng da Một khảo sát về sự nhiễm vi sinh vật trong các loại kem dưỡng dacòn mới hoặc đã qua sử dụng trong một bệnh viện cho thấy có 4/26 loại bị nhiễm vi khuẩngram âm Tỷ lệ này phản ánh mức độ thường sử dụng.các loại kem dưỡng da trong bệnh viện

và nguy cơ gây nhiễm vi sinh vật gây bệnh qua loại mỹ phẩm này, nhất là gây nhiễm dối vớibệnh nhân là người trở nên rất dễ bị nhiễm Ngoài ra, mỹ phẩm dùng cho mắt cũng rất dễ bịnhiễm

Ngoài khả năng bị nhiễm khi mỹ phẩm được sử dụng như trên, vi sinh vật có thểnhiễm vào mỹ phẩm ngay từ giai đoạn sản xuất Nguồn gây nhiễm tại nơi sản xuất có thể là

từ nguyên liệu, nhất là nước là thành phần chiếm tỷ trọng cao nhất trong mỹ phẩm, từ cácdạng nhựa, cây cỏ, các nguyên liệu thiên nhiên khác, từ các dụng cụ chứa nguyên liệu Môitrường sản xuẫt cũng có thể góp phần gây nhiễm, nhất là không khí có thề mang bào tử visinh vật Sự nhiễm còn có thể được gây ra thông qua tiếp xúc bề mặt của nguyên liệu hoặcbán thành phẩm với thiết bị, với công nhân

Hịnh 1.9 p aeruginosa (ảnh chụp qua kính hiển

vi điện tử)

rnmem line ' ĩ

PANG

17

18

Các vi sinh vật không được phép hiện diện trong mỹ phẩm thường là Staphylococcus

aureus, các loài thuộc họ Enterbobacteriaceac, Pseudomonas aeruginosa và Candida albicans.

Đặc điểm chính của s aureus và các loài thuộc họ Enterobacteriaceae đã đươc trình

bày ở mục 1.1 ơ đây giới thiệu một số đặc điểm của Pseudomonas aeruginosa và Candida

albicans.

Pseudomonas aeruginosa

p aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí

Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc

tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một

tiêm mao đơn cực Là vi khuẩn hiếu khí bắt

buộc, nhưng p aeruginosa có thế phát triển

trong môi trường kỵ khí nếu có NOG làm

chất nhận điện tử, phát triển tối ưu ở 37°c.

Loài này hiện diện phổ biến trong đât, nước,

bề mặt cơ thể động thực vật, là loài vi khuẩn

gây bệnh cơ hội trên người Sự nhiễm bệnh

bắt đầu từ khi có những biến đổi làm suy yếu

hệ bảo vệ của tế bào chủ p aeruginosa có thế

gây nhiều bệnh khác nhau ở người: gây viêm

màng trong tim ở những người có van tim giả; gây viêm đường hô hấp ở những người có

đường hô hâp hoặc hệ thông tự bảo vệ bị suy yếu; gây viêm phổi ở những bệnh nhân có bệnh

mãn tính về phổi và bị chứng sung huyết tim; gây nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu ở

những bệnh nhân suy giảm hệ thống miễn dịch như AIDS, giảm bạch cầu trung tính, tiểu

đường, bỏng nặng; gây viêm màng não mủ và áp xe não; gây viêm tai; gây bệnh hóa sừng ở mắt ở những người có hệ thống bảo vệ suy yếu; gây viêm tủy xương; gây nhiễm trùng da,

mô mềm p aeruginosa là vi khuẩn kháng thuổc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ có một sô' ít các kháng sinh có tác dụng đối vđi giông Pseudomonas ỉà

fluoroquinolone, gentamicin và imipenem

c albicans là nâm men có thể phát

triênTaT^nìĩỉỆtndự-âG^^íC, pH 2,5 - 7,5, hình

dạng tế bào thay đổi từ đơn bào hình bầu dục sang

dạng sợi c albicans thường sông vô hại ở màng nhầy (miệng, ruột, âm đạo)

và không thường xuyên ở dạng đơn bào trên da người và động vật máu nóng Ớ nhừng điềukiện nhất định, nấm men phân hóa thành dạng sợi để xâm nhập vào màng nhầy, tăng trưởngkhông kiểm soát và gây

2-PHƯƠNG PHÁP PHÁN TÍCH

các nhóm mệt mỏi mạn tính, suy yếu hệ miễn dịch, dị ứng Một số bệnh có thể gây ra bởi

nhiều kháng sinh; viêm nấm đường âm đạo ồ những phụ nừ đang mang thai; bệnh nâ'm ở

miệng đôi với những người đeo răng giả; viêm ruột kết; thiếu hụt hormon trên vỏ thượngthận và hormon tuyến giáp, các bệnh hô hấp, bệnh về thần kinh, dị ứng; bệnh tiểu dường,

hạ đường huyết

2 CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG NƯỚC

Nước được dùng cho sản xuất, sinh hoạt và thực phẩm Tùy theo mục đích sử dụngcác chỉ tiêu vi sinh vật cần kiểm soát sẽ thay dổi Đối với nước tự nhiên, nước sản xuấtnông ngư nghiệp và nước sinh hoạt, cần phải đảm bảo không bị nhiễm phân, không mangmầm bệnh bằng cách kiểm nghiệm vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân ví dụ như coliíbrm,coliíorm phân Đối với nước uống và các loại nước giải khát, ngoài các chỉ tiêu về vi sinhvật chỉ thị như coliíorm, coliíorm phân, một số vi sinh vật gây bệnh khác cũng được yêucầu kiểm tra tùy thuộc vào nguy cơ gây nhiễm

Sau đây là tiêu chuẩn về nước với các mục đích sử dụng khác nhau :

2.1 Nước dùng cho mục đích sản xuất, sinh hoạt

Các loại nước dùng cho mục đích này được gọi chung là nước mặt, tiêu chuẩn quôcgia Việt Nam (TCVN 5942 - 1995) quy định hai mức như sau :

- Loại A dùng làm nguồn cấp nước sinh hoạt nhưng phải qua quá trình xử lý, giớihạn tốì đa số coliform cho phép là 5.000 MPN/lOOml

- Loại B dùng cho các mục đích khác, giới hạn tối đa số coliíbrm cho phép là 10.000MPN/lOOml Nước dùng cho nông nghiệp và nuôi thủy sản có quy định riêng

Đôi với nước ngầm, tiêu chuẩn chất lượng về vi sinh vật (TCVN 5944 - 1995) đượcquy định là colìíbrm không được quá 3MPN/100ml, không cho phép có coliíbrm phân

Hình 1.10 c, albicans (dạng lưỡng hình)

Nước uông bao gồm nước đóng chai, nước giải khát (không cồn, có cồn) Tiêu chuẩnNhà nước (TCVN 6096 - 1995, TCVN 5042 -1994) quy định về vi sinh vật của các dạngnước này là như sau:

- Nước giải khát có cổn:

Ngoài ra, chất lượng nước biển ven bờ được quy định (TCVN 5943 - 1995) dùng chobãi tắm, nuôi thủy sản và các mục đích khác là coliíbrm không quá l.OOOMPN/lOOml

Để tham khảo, Bảng 1.1 trình bày tiêu chuẩn vi sinh vật và phân loại chất lượng nước

theo các mục đích sử dụng khác nhau tại Nhật Bản

Bảng 1.1 TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI SINH VẬT CÁC LOẠI NƯỚC

- Nước giải khát không cồn:

1 Tổng vi khuẩn hiếu khí (CFƯ/ml) cn

Không đóng chai Đóng chai

3 CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THựC PHAM

Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm được quy định bởi tiêu chuẩn của Bộ Y tế

(Bảng 1.2) bao gồm các chỉ tiêu sau: tổng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E coli,

Staphylococcus aureus, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, tổng sô' nấm

-men, nấm mốc Quy định về giới hạn cho phép của các chỉ tiêu thay đổi theo nhóm vàchủng loại thực phẩm

Các mặt hàng thủy sản chế biến xuất khẩu được quy định bởi tiêu chuẩn quô'c gia

(TCVN) và tiêu chuẩn của ngành (TCN, Bộ Thủy sản, Bảng 1.3) và của thị trường xuất khẩu (Bảng 1.4) Các chỉ tiêu thường được quan tâm là: tổng vi khuẩn hiếu khí, Coliforms,

(1) Coliform

Nước sông (MPN/lOOml) tối đa 50 (loại AA) tối đa 1.000 (loại A) tối đa 5.000 (loại B)

Nước hồ (MPN/lOOml) tối đa 50 (loại AA) tối đa 1.000 (loại A)

Nước biển ven bờ

(MPN/lOOml)

tối đa 1.000 (loại A)

Nước nuôi thủy sản (MPN/

tối đa 50 (loại 1) tôi đa 1.000 (loại 2) tối đa 5.000 (loại 3)

Nước hồ bơi kiểm 10ml mẫu nước, lặp ỉại 5 ô'ng, sô' ông dương tính tô'i đa là 2

Coliforms phân, E coliStaphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae,

Vibrio parahaemolyticus, tổng sô' nấm men, nấm mốc, Clostridia, Listeria monocytogenes.

4 CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG MỸ PHAM

Hiện nay chưa có tiêu chuẩn nhà nước về vi sinh vật trong mỹ phẩm Một sô' chỉ tiêu

vi sinh thường được kiểm tra là tổng vi khuẩn hiếu khí, tổng sô' nấm men, nấm mốc, kiểm

tra sự hiện diện của các vi sinh vật như Staphylococcus aureus, E coli, Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger.

- Sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp

- Nước giải khát không cồn

- Nước khoáng đóng chai

* Nhóm thức ăn khô và chứa dinh

dưỡng cho trẻ em, thức ăn thay thế

đặc biệt

- Phải xử ]ý nhiệt trước khi sử dụng 10 5 10 10 2 0 10 2 10

- Dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt

TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí; ECO: E coli] SAU: Staphylococcus aureus] SAL: Salmonella] BCE: Bacillus cereus] COL: Coliforms; CPE: Clostridium perfringens] VP A; Vibrio parahaemolyticus] NM-MO: tổng số nấm men, nâm môc; SFA: Streptococcus faecalis] PAE: Pseudomonas aeruginosa] CBO: Clostridium botulinum, G.MP : Good

Manufacturing Practice : quy phạm sản xuất GMP.

Thị

trường

Giáp xác và nhuyễn thề luộc m = 0 M

= 10

m - 0

M = 10“ 0Hàng dạng nguyên liệu (raw material) m = 0 M

Giáp xác / tôm luộc nguyên con đông

Bảng 1.4 MỘT số TIÊU CHUẦN VI SINH TRÊN THỦY HẢI SAN Ở CÁC THI TRƯỜNG THÊ GIỚI

Thị

trường

Giáp xác và nhuyễn thề luộc m = 0 M

= 10

m - 0

M = 10“ 0Hàng dạng nguyên liệu (raw material) m = 0 M

Giáp xác / tôm luộc nguyên con đông

Bảng 1.4 MỘT số TIÊU CHUẦN VI SINH TRÊN THỦY HẢI SAN Ở CÁC THI TRƯỜNG THÊ GIỚI

Tất cả các chỉ tiêu nêu trên đều tương ứng với 25g mẫu (trừ trường hợp có chú thích riêng)

TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí (30°c/72h); COL: Coliforms; FCO: Faecal coliforms; ECO: E coỉi; SAU: Staphylococcus aureus; SAL: Salmonella spp.; SHI: Shigella spp.' VCH: Vibrio cholerae;

VP A: Vibrio parahaemolyticus; NM; tổng số nấm men, nấm mốc, CLO: Clostridia; LIS: Listeria monocytogenes] m: khoảng chấp nhận, M: khoảng không chấp nhận, n: sôL.mẫu thử nghiệm, c : số mầu

được phép nằm trong khoảng làn cận giới hạn.

m = 10 2 M

= 10 2 c - 2

0 n= 5

0 n= 5

0 n= 5

CHƯƠNG II

YÊU CẦU Cơ BẢN CỦA PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

Nhân viên phòng kiểm nghiệm phải có đủ kiến thức và kinh nghiệm về công tác kiếm nghiệm vi sinh, phảituân thủ đúng những quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm

1.1 Các yêu cầu vể phòng kiểm nghiệm

Phòng kiểm nghiệm vi sinh vật phải có diện tích làm việc và cách bô trí phù hợp Khoảng cách làm việc phải

hợp lý để hạn chế tối đa sự di chuyển trong phòng; sự di chuyển làm xáo động không khí và làm tăng nguy cơ nhiễm

trong quá trình phân tích kiểm nghiệm Thông thường phòng kiểm nghiệm cần được phân thành các khu vực riêngbiệt như:

- Thu mẫu và lưu mẫu

- Rửa dụng cụ thủy tinh, khử trùng dụng cụ, tủ ấm ủ mẫu

- Bảo quản hóa chất

- Chuẩn bị môi trường

- Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu

- Khu vực thao tác các vi sinh gây bệnh

Ngoài ra phòng phải được chiếu sáng đầy đủ, cần có hệ thông thông khí đảm bảo ngàn sự đóng bụi và khôngcho lan truyền các bào tử nấm cũng như các vi sinh vật khác Khu vực thao tác nuôi cây nên được lắp đặt đèn tửngoại để đảm bảo tiệt trùng không khí và không gian thao tác Khu vực này nên được trang bị máy điều hòa khôngkhí Máy điều hòa đem lại các lợi ích sau:

- Không khí đi vào luôn được lọc để làm giảm ngoại nhiễm từ môi trường bên ngoài

- Cửa dóng làm giảm tối thiểu sự dịch chuyển của không khí, ngăn ngừa bụi làm giảm ngoại nhiễm

- Điều hòa không khí giúp chủ động kiểm soát độ ẩm, nhiệt độ theo hướng có lợi cho quá trình làm việc.Mặt khác cần lưu ý nên hạn chế hoặc không đùng quạt trong phòng kiểm nghiệm vi sinh và tránh để môitrường, hóa chất trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời

Sổ lưu ký ghi lại các dữ liệu cho phép theo dõi, kiểm tra sự chính xác của các kết quả thu được, cần phải ghilại tỉ mỉ các công việc đã làm, các kết quả thu được một cách cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự xác định Ví dụ:

- Ngày tháng tiến hành thí nghiệm, ngày kết thúc

- Tên thí nghiệm.

- ĐỐI tượng làm việc

- Phương pháp lựa chọn để tiến hành

- Các kết quả thu được

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật,chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn vá đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng visinh vật là tác nhân gây bệnh nên cần luôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác Mặt khác, nhân viênkiểm nghiệm cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc những hóà chất có độc tính Do vậy,cần tuân thủ một số’ quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho bản thân và -cho những người khác trong phòng thínghiệm như sau:

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm Mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh vật

- Mặc áo blouse trong thời gian làm việc

- Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 70° hoặc dung dịch chất diệt khuẩn khác(lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thực hiện tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn hoặc đènBunsen khi tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng này sau khi hoàn thành công việc

- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ông nghiệm môi trường, bình nuôi cấy

- Khi lỡ tay làm đô, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tấm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau dó thựchiện khử trùng lại bàn làm việc

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngaysau khi thực hiện xong mỗi thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trườnghợp có tóc dài

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ông hút định lượng (pipette), không hút bằng miệng

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ vào một túi rác riêng

- Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng

- Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ vàocác bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel)trước khi rửa và tái sử dụng

- Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên nhau

- Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp

- Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn ĩửa để tránh sựvăng nhiễm vi sinh vật vào không khí

- Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm

2 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ

2.1 Các dụng cụ bằng thủy tinh

- Ông nghiệm: dược dùng để chứa môi trường nuôi cấy và nuôi cấy vi sinh vật Môi trường có thể ở dạng lỏng

hoặc rắn Miệng ống nghiệm có thể được đậy bằng nút bằng bông không thấm nước, bằng Silicon, nắp nhôm hayinox

- Đĩa petri: gồm một nắp lớn và một nắp nhỏ lồng vào nhau, đường kính 8, lơ, 12cm Chọn những đĩa có đáy

bằng, không trầy xước để độ dày môi trường được đồng nhất Đĩa petri được gói bằng giấy trước khi đem đi hấp khửtrùng Hiện nay các đĩa petri nhựa vô trùng bán sẵn rất tiện lợi được sử dụng khá phổ biến trong các phòng kiểmnghiệm vi sinh

cầu đáy bằng và tròn + Bình tam

giác + Các loại ổng đong + Ong

hút

- Que cấy vòng: dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh vật

trong môi trường lỏng hoặc raôi trường đặc

- Que cấy móc: dùng cấy các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn.

Các nhiệt kế thường dùng nên có khoảng chia độ đến 0,2°c hoặc ít hơn Các nhiệt

kê chuẩn nên dùng loại chia độ đến 0,1°C, đo được nhiệt

Nước cất dùng để pha chế môi trường, pha các dung dịch Nước cất không chứacác chất hòa tan nhưng còn chứa khí hòa tan và hợp chất hữu cơ bay hơi Cần kiểm tra,làm vệ sinh máy và bình chứa nước cất

thường xuyên đế đảm bảo độ sạch của

nước

3'PHƯƠNG PHÁP PHÁN TÍCH

2.7 Tủ sấy

Tu sấv được dùng đế sấv khô dụng cụ hoặc để khử trùng bằng phương pháp nhiệtkhô Tủ sấy thường được dot nóng bằng điện tro' Nhiệt độ có thế lên đến 200DC Khí nóngđược quạt đều trong lò để tránh sự sai biệt, về nhiệt độ

2.8 Tủ ấm

Tủ ấm được dùng cho mục đích nuôi cấv vi sinh vật Tủ ấm phải duy trì nhiệt độ ổnđịnh dế cho vi sinh vật táng trưởng Dải nhiệt độ của tủ ấm thường ơ khoảng 0 - 50°c.Thường vi khuẩn được nuôi cấv ở 37°c, một số vi khuẩn có nhiệt độ tăng trương tối ưu ởcao hơn, khoảng 40 - 42°c Đối với mỗi đôi tượng vi sinh vật cần phải điều chỉnh lại nhiệt

độ nuôi cấy cho phù họp

2.9 Máy lắc

Máy lắc nhằm đảo trộn môi trường, tăng cường ôxi tan trong môi trường, được dùng

đế nuôi vi sinh vật hiếu khí trong môi trường lỏng

2.10 Bể điểu nhiệt

Thiết bị nàv được sử dụng đế giữ môi trường rắn được đun chảy ổn định ở nhiệt độthích hợp (45°C) trước khi đổ dĩa petri

2.11 Tủ lạnh

Sử dụng tủ lạnh có nhiệt dộ từ 4 - 10°c đế lưu giừ mẫu, môi trường, hóa chất Ngăn

tủ đông để giữ giống hoặc các hóa chất cần đế lạnh sâu Không giữ thực phẩm, thức uốngchung với tủ lạnh dành cho vi sinh vật

2.12 Màng lọc vô trùng

Màng lọc vô trùng được dùng để lọc thanh trùng môi trường có chứa những thànhphần không chịu được nhiệt độ cao, không thể khử trùng bằng nồi hấp bình thường Mànglọc có kích thước lỗ 0,2pm, nhỏ hơn đường kính của vi khuẩn Vi sinh vật sẽ bị giữ lại trênmàng lọc còn dung dịch đi qua sẽ yô trùng Màng lọc có thể bằng sứ, amiante, cellulosehay hỗn hợp cellulose và muôi ester của cellulose,

2.13 Đèn tử ngoại (UV)

Tia ƯV có tác dụng khử trùng không khí trong phòng, khử trùng bề mặt, nước, cácdung dịch nhạy cảm với nhiệt Nguồn bức xạ trong đèn ưv là tia lửa điện sinh ra trong hơithủy ngân áp suất thấp và làm phát ra các phố’ vạch trong vùng tử ngoại Hơn 80% nănglượng của tia tử ngoại thuộc bước sóng 200 - 290nm Đèn được chế tạo bằng một loại thủytinh dặc biột giữ lại các bước sóng nho hơn 200nm Đế’ khử trùng không khí cần chiêu tia

tứ ngoại từ 30 phút đến vài giờ tùy theo mức độ nhiẻm bẩn của không khí

Nồi hâp là một thiêt bị bắt buộc phải có của một phòng kiểm nghiệm vi sinh chophép tiêu diệt cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật Nồi hâp có cấu tạo 2 vỏ và cókhả năng gi ừ áp suất cao Phía trong của nồi là buồng khử trùng, nơi đặt các vật liệu cầnkhử trùng Buồng khứ trùng có lắp van thoát không khí, áp kế để xác định áp suất và van

báo hiểm để xì hoi khi áp suất vượt quá mức yêu cầu và đảm bảo an toàn Khoảng trônggiữa 2 lớp vỏ là nơi chứa hơi nước Nên dùng nước cất hoặc nước lọc, trao đổi ion cho nồihấp để tránh bị đóng cặn Nước cán được bô sung đên mức quy định.

Kính hiển vi dùng để phóng đại, quan sát vi sinh vật Kính hiển vi cần được đặt tạinơi tránh được bụi và chấn động Sau khi dùng kính với dầu soi, dùng giấy lau kính chuyêndụng thấm xylol lau vật kính 100X, sau đó lau lại bằng giây lau kính khô Khi không dùngphải đậy kính lại

Bình thúy tinh hoặc nhựa kín trong đó 02 bị loại bằng ngọn nến hoặc bằng túi khử ôxi

do phản ứng hóa học giữa H2 và 02 tạo H20 Phản ứng này có thế được thực hiện bằng cáctúi Gas-Pak"J chứa bicarbonate natri, borohydride natri và xúc tác Khí C02 và H2 được tạo

thành khi có sự hiện diện của hơi nước (X ảnh 1)

Các thiết bị trong phòng kiểm định vi sinh cần được kiểm tra định kỳ tính chính xáccùng với những chương trình bảo trì, hiệu chuẩn phù hợp Trên đây giới thiệu chung về cácdụng cụ, thiết bị tối thiểu cần có của một phòng kiểm định vi sinh Các phương pháp kiếmtra thiết bị cần được tiến hành theo những quy tắc của hệ thống an toàn chất lượng phòngthí nghiệm và theo khuyên cáo của nhà san xuất

CHƯƠNG 111

PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN

VÀ CHUẨN BỊ MẪU

1 ĐẶC ĐIỂM CỦA MẪU

Trong đa số các trường hợp, việc phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỷphẩm là nhằm xác định sự hiện diện hay không (định tính) của một hav một số" loài vi sínhvật gây bệnh nhất định trong mẫu Hầu hết các phương pháp chuẩn để phấn tích vi sinh vậttrong các mẫu nước, thực phẩm và mỹ phẩm được xây dựng từ các phương pháp phân tích

vi sinh vật bệnh phẩm Tuv nhiên khác với mẫu bệnh phẩm, các mẫu nước, thực phẩm và

mỹ phẩm có một số' đặc điểm sau đây:

- Mật độ của vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỳ phẩm thường thấp hơn từ vàichục đến vài triệu lần so với trong bệnh phẩm

- Trong mẫu bệnh phẩm, vi sinh vật gây bệnh thường ở trong trạng thái tăng trướngtốt và hiện diện khá đồng nhất trong mầu Ngược lại, trong mẫu thực phẩm và mỹ phẩm, visinh vật hiện diện ở mật độ thấp và không có sự phân bô' đều trong mẫu.

- Trong quá trình chế biến thực phẩm, sản xuất mỹ phẩm, vi sinh vật hiện diện trongnguyên liệu và bán thành phẩm thường bị tổn thương ít nhiều và giảm sức sống do các biệnpháp vật lý (nhiệt độ, ánh sáng ), hóa học (chất ức chế, chất diệt khuẩn, nồng độ cao củarmkh, dung môi ) được sử dụng nhằm hạn chế thấp nhất sự hiện diện và tăng trưởng của

vi sinh vật trong quá trình chế biến sản xuất Sự tổn thương và sức sông yếu của vi sinh vậtcần phát hiện có thể làm sai lệch kết quả các phản ứng sinh hóa dùng để định danh vi sinhvật

Do vậy, khác với các quy trình phát hiện vi sinh vật dùng trong bệnh phẩm, hầu hêtcác quy trình kiểm nghiệm vi sinh trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm đều có thêm cácbước nuôi tăng sinh để phục hồi sức sông của các vi sinh vật bị tổn thương và bước nuôităng sinh chọn lọc nhằm làm gia tăng mật độ tương đôi của vi sinh vật cần phát hiện, ứcchê sự tăng trưởng của các nhóm vi sinh vật không mong muốn khác Các biện pháp nàygiúp làm độ nhạy phát hiện của các quy trình phân tích vi

thu mẫu, bảo quản và

Hình 3.1 Bình thu mẫu

nước

sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm cao hơn rất nhiều

so với các quy trình dùng cho mẫu bệnh phẩm Độ nhạy cao là yêu cầu rất quan trọng đế đạt mức giới hạn cho phép sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu nước, thực phẩm và mỹ phẩm (trong hầu hết các trường hợp là không có vi sinh vật gâv trong 25g mẫu).

2 1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu nước

Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khỗi nước cầnkiểm nghiệm Khi thu mẫu nước cần lưu ý :

- Sử dụng bình thu mẫu loại dùng một lần hoặc có thế dùng nhiều lần Trường hợpdùng bình chứa dùng nhiều lần, chất liệu cua bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần

mà không tạo ra các tạp chất ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi sinh vật

- Khi cần thiết phải bổ sung tác chất vô trùng để trung hòa các dư lượng châT diệtkhuẩn hiện diện trong mẫu nước Tác chất trung hòa này phải không ảnh hưởng đến sứcsống hoặc sự tăng trường của vi sinh vật Ví dụ đôi với các mẫu nước có chứa dư lượngchlor như nước máy, cần bổ sung 0,lml dung dịch 1,8% sodium thiosulfate (Na^S^.SLCO)vào bình thu mẫu có dung tích 100ml trước khi khử trùng bình này.

- Lưu ý tránh gây tạp nhiễm mẫu trong lúc vận chuyến

mẫu

Trường hợp nước mặt, mẫu nước được thu vào bình

thủy tinh dung tích 100 đến lOOOml đã khử trùng, cần chú

ý không để mẫu nước bị nhiễm bởi tay hay bởi dây sử dụng

khi thu mẫu Để thu các mẫu nước ờ độ sâu nhất định người

ta dùng bình thu mẫu chuyên dụng như hình bên Trường

hợp này người ta thả bình thu mẫu xuống độ sâu cần thiết,

dùng dây mở nắp bình rồi thu mẫu Trường hợp nước ngầm,

dùng bơm để thu mẫu Đối với hầu hết các mẫu nước, cần

chừa một khoảng không khí đủ lớn giữa mặt nước và nắp

bình

Do chủng loại và mật độ vi sinh vật trong nước thay

đổi rất nhiều theo bề mặt, độ sâu và chất lượng nước nên cần

đánh giá chất lượng

chung về vi sinh vật, khi thu mâu nước cần chọn nhiều vị trí thu mẫu khác nhau.

Trường hợp nước mặt, vi sinh vật trong nước mặt có dòng chảy như nước sông cómật độ thay đổi rất nhiều theo lưu tốc, độ sâu Do vậy để có được mẫu có tính đại diện cầnchọn nơi nước chảy (giữa dòng) và độ sâu 20 - 30cm đế thu mẫu Thông thường cần thumẫu tại nhiều điểm từ thượng lưu xuống cửa sông Trường hợp nước ao hồ, để có sô" liệu

về sự phân bô bề mặt của vi sinh vật, tùy kích thước của ao hồ, cần chọn tìí 5 đến 10 điếmcách nhau những khoảng thích hợp Đế có số liệu phân bố theo chiều sâu, thông thườngngười ta lấy một mẫu ở đáy ao hồ và sau đó thu các mẫu theo một khoáng cách nhất định từđiểm đáy Trường hợp nước ngầm, cần chọn 5 đến 10 địa điểm trở lên Trường hợp này cầnlưu ý đến các yếu tố như độ sâu, thành phần đất, khoảng cách từ nguồn ô nhiễm

Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ các thông tín cán thiết lièn quanđến mầu (địa điếm, thời gian, mục đích, người thu )

Mẫu nên được phân tích trong vòng 6 giờ sau khi thu mẫu Do việc phân tích thường

được tiến hành ở tại phòng thí nghiệm nên cần vận chuyển mẫu từ nơi thu mẫu về phòng thí nghiệm Trường hợp này cần bảo quán mẫu ở nhiệt dộ dưới 10°c bằng nước đá hoặc đá

khô trong khi vận chuyển Trường hợp không thực hiện được việc phân tích ngay thì cầnbáo quản mẫu ỏ' 0 - 5°c trong tủ lanh và nên phân tích trong vòng từ 6-12 giò'

2.2 Chuẩn bị mẫu

Trong đa số các trường hợp, mẫu nước không cần được xử lý gì đặc biệt trước khiphân tích vi sinh vật Khi cần thiết, mẫu cần được pha loãng thập phân để được các độ phaloãng cần thiết bằng nước cất, nước muối sinh lý hay môi trường lỏng vô trùng

3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm

Tiêu chuấn quy định về mật độ cho phép của các vi sinh vật trong thực phẩm thayđổi tùy theo nhóm vi sình vật cần phân tích, đối tượng thực phẩm, tiêu chuẩn về vệ sinh antoàn thực phẩm của từng nước Đối với vi sinh vật gây bệnh, mức độ nguy hiểm cao, tiêuchuẩn thường quy định không cho phép có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong mộtđơn vị khôi lượng thực phẩm nhất định Trường hợp này cần định tính sự hiện diện của visinh vật Thông thường, tiêu chuẩn quy định mật độ vi sinh vật cho phép hiện diện trongmột khối lượng thực phẩm xác định, trong trường hợp này cần tiến hành định lượng mật độ

vi sinh vật hiện diện trong mẫu kiểm Tuy nhiên, kết quả phân tích, định lượng vi sinh vậttrong từng mẫu thực phẩm thường không phản ánh chính xác mật độ vi sinh vật thực tếhiện diện trong mẫu Do vậy, thông thường cần thực hiện việc định lượng trên một sô"lượng mẫu xác định và sử dụng những khoảng giới hạn quy ước để nhận định kết quả nhưsau:

- Khoảng chấp nhận: khi mật độ vi sinh vật nằm dưới một trị số

là rn