CHẨN đoán PHÂN tử và LIỆU PHÁP GEN

CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ & LIỆU PHÁP GEN MỤC LỤC Chương 1: Một số khái niệm chẩn đoán .5 1.1 Chẩn đoán .5 1.2 Sàng lọc 1.3 Đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u 1.4 Các vấn đề chẩn đoán 1.4.1 Nhận diện mẫu .8 1.4.2 Lập luận xác suất .9 1.4.3 Ý kiến nguyên nhân .9 Chương 2: Một số kỹ thuật chẩn đoán bệnh 10 2.1 Nuôi cấy mẫu bệnh phẩm 10 2.2 Kỹ thuật tế bào học .11 2.2.1 Nhuộm in vitro .11 2.2.2 Nhuộm in vivo 19 2.3 Phương pháp miễn dịch học 20 2.3.1 Western blot 20 2.3.2 Hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) .24 2.3.3 Miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay- RIA) 26 2.3.4 Xét nghiệm ngưng kết (Agglutination test) 31 2.3.5 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 34 2.4 Phương pháp FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) .39 2.4.1 Các kiểu mẫu dò FISH .42 2.4.2 Hai kiểu tế bào sử dụng FISH 43 2.5 Phương pháp FLOW CYTOMETRY 47 2.5.1 Khái niệm .47 2.5.2 Lịch sử 47 2.5.3 Nguyên tắc hoạt động 48 2.5.4 Phân tích kết 55 2.6 Phương pháp khuếch đại nucleic acid 60 2.6.1 Chuẩn bị mẫu .61 2.6.2 Khuếch đại 64 2.6.3 Phát phân tích 72 2.6.4 Giải trình tự nucleic acid 85 2.6.5 Sử dụng chip phân tích .89 Chương 3: Ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán 90 3.1 Chẩn đoán bệnh nhiễm 90 3.1.1 Quan sát thơng qua kính hiển vi 90 3.1.2 Nuôi cấy xác định 91 3.1.3 Tìm kiếm chứng qua đáp ứng thể .92 3.1.4 Phương pháp miễn dịch .93 3.1.5 Phương pháp sử dụng nucleic acid 94 3.2 Chẩn đoán ung thư 95 3.2.1 Sàng lọc phát sớm 95 3.2.2 Chẩn đốn thơng thường 98 3.2.3 Chẩn đoán phân tử .101 3.3 Chẩn đoán bệnh di truyền 105 3.3.1 Chẩn đoán trước làm tổ (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD)105 3.3.2 Chẩn đoán tiền sinh (Prenatal diagnosis) 109 Chương 4: Một số khái niệm liệu pháp gen 118 4.1 Giới thiếu 118 4.2 Tế bào mục tiêu 120 4.2.1 Tế bào sinh dưỡng 120 4.2.2 Tế bào sinh dục 121 Chương 5: Liệu pháp gen .123 5.1 Lịch sử nghiên cứu liệu pháp gen .123 5.2 Chiến lược liệu pháp gen 127 5.2.1 Liệu pháp in vivo 127 5.2.2 Liệu pháp ex vivo .128 5.3 Vector có chất virus dùng liệu pháp gen 130 5.3.1 Vector có chất virus .131 5.3.2 Vector retrovirus (Rv) .132 5.3.3 Vector adenovirus (Ad) 147 5.3.4 Hệ thống vector virus kết hợp với Adeno 158 5.3.5 Hệ thống vector virus simplex herpes 163 5.3.6 Những vector virus khác 168 5.4 Vector virus dùng liệu pháp gen 168 5.4.1 DNA RNA khuếch đại vi khuẩn tế bào eukaryote 168 5.4.2 Oligonucleotide 174 5.4.3 Ribozyme 198 5.4.4 Triplex DNA .214 5.4.5 SMaRT .216 Chương 6: Sự tồn tạo gen liệu pháp tế bào nhóm gen mục tiêu 218 6.1 Sự tồn gen liệu pháp tế bào 218 6.2 Nhắm gen mục tiêu 219 6.3 Ứng dụng 220 6.3.1 Chữa bệnh di truyền 220 6.3.2 Chữa bệnh ung thư .243 6.3.3 Chữa bệnh nhiễm, bệnh mắc phải 248 6.3.4 Liệu pháp gen ứng dụng cấy ghép 250 6.3.5 Liệu pháp gen việc “thiết kế người” .251 Chương 1: Một số khái niệm chẩn đoán 1.1 Chẩn đoán Trong y học, chẩn đốn (diagnosis) q trình xác định điều kiện y học hay bệnh từ dấu hiệu (sign) hay triệu chứng (symptom) từ kết cộng gộp nhiều q trình chẩn đốn khác, kể hồn cảnh Các kết luận thể tổng hợp từ trình gọi chẩn đốn Thuật ngữ “diagnosis” có nguồn gốc từ chữ “dia” nghĩa “bởi” (by) từ chữ “gnosis” có nghĩa biết (knowledge) Cách 2000 năm, Hippocrate ghi nhận liên hệ bệnh di truyền Tương tự, Pythagorat ghi liên hệ chuyển hóa di truyền Tuy nhiên, gần cộng đồng y học thừa nhận vai trò quan trọng di truyền học trở thành phận tất yếu y học ngày Những năm đầu thập niên 1990 Willian Osler đưa sáng kiến thực hành y học Theo Osler, chức bác sĩ xác định bệnh biểu nó, hiểu chế nó, làm để ngăn chặn chữa trị Ý tưởng Osler tiếp tục đến ngày nay, vấn đề chiến lược “bệnh mà bệnh nhân mắc cách tốt chữa trị cho bênh nào?” Người nối nghiệp William Osler Archibald Garrod Trong Osler đề nguyên lý tảng mà y học nên tiến hành, Garrod đặt nguyên lý ngữ cảnh lớn Chẳng hạn bệnh lí gắn chặt với tính chất đặc trưng cá nhân hóa học di truyền tùy thuộc vào thể chọn lọc tiến hóa Ý tưởng Osler thực hành y khoa thống trị sinh lý y học ngày Bệnh nhân tập hợp triệu chứng, xác định phân tích thuật tốn để đưa chẩn đốn, đồng thời đưa chiến lược chữa trị hiệu nghiệm Khái niệm Garrod tính chất sinh lý cá thể khẳng định gen người giải mã thành công Những mối quan hệ tinh vi di truyền, tính chất sinh học cá thể môi trường trở nên rõ ràng, thông qua biến đổi phát DNA DNA của bệnh nhân cho biết chế họ có thay đổi, hay lâm bệnh Người ta hi vọng từ hiểu biết gen, ốm đau, bệnh tật phát hiện, q trình bệnh dự đốn, trước chúng có hội biểu Mặc dù kiến thức lĩnh vực cịn lâu nữa hồn thiện, có nhiều can thiệp y học phát triển dựa vào vấn đề 1.2 Sàng lọc Ngồi khái niệm chẩn đốn người ta cịn sử dụng khái niệm “sàng lọc” để trình tìm kiếm bệnh Sàng lọc (screen) bệnh thuật ngữ khác mục đích, phương pháp chẩn đốn, phase tiến hành khác biệt Thơng thường, chẩn đoán bệnh đề cập cá thể có biểu bệnh hay triệu chứng bộc phát, sàng lọc bệnh dùng để phát bệnh chưa có biểu lâm sàng 1.3 Đơ ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiêụ Thuâ ̣t ngữ “có thể” và “chắc chắn” đã bản phản ánh đô ̣ nhạy (sensitivity) và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u (specificity) của các xét nghiê ̣m Đô ̣ nhạy được định nghĩa là phần trăm các cá thể có bê ̣nh mà xét nghiê ̣m có thể xác định đúng, đó đô ̣ đă ̣c hiê ̣u được định nghĩa là phần trăm cá thể không bê ̣nh, được xác định chắc chắn Người ta sử dụng các phương pháp đô ̣c lâ ̣p đưa quyết định cuối cùng về người nào bê ̣nh người không bê ̣nh để tính toán các giá trị này Mơ ̣t xét nghiê ̣m lí tưởng phải có đô ̣ nhạy 100% và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u 100%, thực tế, đô ̣ nhạy và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u thường có mối quan ̣ ngược Mô ̣t xét nghiê ̣m có đô ̣ nhạy cao sẽ xác định hầu hết các cá thể bị bê ̣nh, nên thường có phần trăm cao các trường hợp dương tính giả, đó có đô ̣ đă ̣c hiê ̣u thấp Mô ̣t nhân tố quan trọng khác có ảnh hưởng đến kết quả xét nghiê ̣m là tỉ lê ̣ bê ̣nh quần thể sàng lọc Nếu bê ̣nh hiếm, xét nghiê ̣m có đô ̣ nhạy và đô ̣ dă ̣c hiê ̣u cao cũng sẽ có mô ̣t tỉ lê ̣ dương tính giả cao, bởi vì nhiều cá thể không bị bê ̣nh được xét nghiê ̣m Bảng 1.1 Mô ̣t số thuâ ̣t ngữ Thuật ngữ Định nghĩa Độ nhạy Tỷ lệ cá thể bệnh xác định (sensitivity) xét nghiệm Độ đặc hiệu Tỷ lệ cá thể không bệnh (specificity) xác định xét nghiệm Phần trăm âm tính giả (Percentfalse negative) Tính tốn 100xTP/(TP+FN) 100xTN/(TN+FP) Phần trăm cá thể có bệnh mà khơng phát xét 100xFN/(TP+FN) nghiệm Phần trăm dương tính Phần trăm cá thể không bệnh, mà giả (Percent false kiểm tra có bệnh xét positive) nghiệm 100xFP/(TN+FP) Giá trị dự đốn dương Khả cá tính (Positive predictive thể kiểm tra dương tính value) có bệnh Giá trị dự đốn âm tính Khả cá (Negative predictive thể kiểm tra âm tính value) khơng có bệnh TP/(TP+FP) TN/(TN+FN) Chú thích: Dương tính (true positive – TP), dương tính giả (false negative – FN), âm tính giả (false positive – FP), âm tính (true negative – TN) 1.4 Các vấn đề chẩn đốn Ba vấn đề khơng tách biệt thực chẩn đốn đơn là: nhận diện mẫu (pattern regconition), lập luận xác suất (probility reasoning) suy nghĩ nguyên nhân (causal thinking) 1.4.1 Nhận diện mẫu Sự nhận diện mẫu việc xác định so sánh biểu cá thể bệnh với biểu cá thể bệnh với biểu bệnh biết Những dấu hiệu, triệu chứng so sánh với mẫu bệnh xếp loại đánh dấu trước Các phương pháp CNSH sử dụng để phát sớm, nhanh xác biểu bệnh (chẩn đốn), tìm kiếm tác nhân gây bệnh (sàng lọc) mức độ phân tử (protein, nucleic acid), hay tế bào mơ Vì tính hữu dụng phương pháp chẩn đoán sàng lọc bệnh, chúng nhanh chóng giữ vai trị quan trọng y học 1.4.2 Lập luận xác suất Lập luận xác suất phản ánh khả tương đối bê ̣nh đặc biệt mà cá thể mắc phải, có biểu xác định Khả cá thể mắc bệnh cao mơ ̣t số tiêu chẩn đốn gặp, xét nghiệm cho kết dương tính giả Ngồi ra,sự nhận diện mẫu xác góp phần gia tăng độ xác việc lập luận xác suất 1.4.3 Ý kiến ngun nhân Sau chẩn đốn, cần tìm kiếm nhân tố hay trình đáp ứng gây nên bệnh Bằng hiểu biết lọai bỏ nguyên nhân, bệnh ngăn chặn Nguồn:http://yduocvn.com/? x/=newsdetail&n=3508&/c/=13&/g/=50&/25/4/2010/bat-giu xu-ly-va-trinhdien-khang-nguyen.html l Neuroblastoma (U nguyên bào thần kinh) U nguyên bào thần kinh bệnh ung thư phát triển từ tế bào thần kinh tìm thấy số khu vực thể bụng, cổ, ngực 238 Nguồn: Nguồn: http://ungbuouvietnam.com/nhung- http://pedsurgzone.blogspot.com/201 phuong-phap-dieu-tri-u-nguyen-bao- 1/06/neuroblastoma-power-notes- than-kinh-o-tre/ 1.html Nguyên nhân: Do đột biển di truyền tế bào bình thường kiểm sốt xâm lấn mô bên cạnh U nguyên bào thần kinh tế bào thần kinh – tế bào thần kinh chưa trưởng thành Điều trị: - Ghép tế bào gốc tạo máu: tủy xương sản xuất tế bào gốc trưởng thành phát triển thành tế bào, thu thập tế bào gốc qua hóa trị liệu liều cao tiêu diệt tế bào ung thư, sau tiêm vào thể - Đang có nhiều nghiên cứu phase gen mã hóa cho Chemokine Cytokine, biến đổi tế bào ung thư thần kinh để thử nghiệm chữa trị bệnh ung thư tế bào thần kinh dai dẳng, hay tái phát cách sử dụng Vector adenoviruse Sự điều trị gen mã hóa cho kháng sinh Neomycine gắn tế bào T chuyên biệt với tế bào Neuroblastoma 6.3.1.2 Các bệnh di truyền không phù hợp với chữa trị liệu pháp gen a Sự trật tự NST Nguyên nhân: - Do tác nhân đột biến phóng xạ, hóa chất môi trường nội bào bất thường 239 - Kết tác động tùy thuộc NST (NST thường hay giới tính), giai đoạn hình thái NST Cơ chế: - Cơ chế phát sinh: Tác nhân đột biến hay rối loạn nội bào làm q trình nhân đơi tiếp hợp NST xảy bất thường Nói chung, đứt đoạn dạng đột biến ban đầu, thường xảy NST dạng sợi mảnh, chưa xoắn đến mức cao nên dễ đứt phân bào, từ gây đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn chuyển đoạn - Cơ chế di truyền: Nếu đột biến xảy giảm phân sinh giao tử khác thường Giao tử mang NST đột biến kết hợp với giao tử khác (bình thường có đột biến) tạo nên hợp tử mang đột biến từ sinh thể đột biến Bảng 6.1 Các bệnh đột biến NST gây nên STT TÊN BỆNH – HỘI CHỨNG Bệnh LOẠI ĐỘT BIẾN TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN ung thư Do đột biến đoạn NST 21 Biểu máu 22 nam nữ Hội chứng Do đột biến NST dạng thể ba Biểu Down NST 21 (có NST 21), NST nam nữ, có 47 NST hay chuyển đoạn thường xảy không cân liên quan đến trẻ em nhánh dài NST 13,14 (chủ sinh từ người yếu 14) NST 21 mẹ 35 tuổi NST 21 22 Hội chứng Đột biến số lượng NST dạng thể Biểu 240 Edward ba có NST 18 có 47 nam nữ NST Hội chứng Patau Đột biến số lượng NST dạng thể Biểu ba có NST 13 có 47 nam nữ NST Hội chứng Siêu Đột biến số lượng NST dạng thể Chỉ gặp nữ nữ (XXX) Hội ba nên có ba NST giới tính X chứng Đột biến số lượng NST dạng thể Chỉ gặp nữ Turner (XO) NST giới tính X b Tính trạng trội phức tạp Ví dụ thông minh hay sức bền thể chất loạt gen ngấm ngầm chi phối Tính trạng trội: bệnh tính trạng lặn khó khăn việc chữa trị liệu pháp gen tương lai Các bệnh đột biến gen tính trạng trội thường thiếu số loại enzyme cần cho thể Phương pháp điều trị: Các bệnh tính trạng trội phức tạp loạt gen chi phối để điều trị cần chèn lượng lớn gen vào tế bào, với phương pháp liệu pháp gen điều bất khả thi Các phương pháp chuyển gen sử dụng liệu pháp gen cho phép chuyển gen có kích thước nhỏ, mặt khác, đưa gen vào thể cần đảm bảo gen đáp ứng miễn dịch thể để không bị đào thải nên việc đưa lượng lớn gen vào lúc khơng thể kiểm sốt 241  Khó khăn triển vọng liệu pháp gen điều trị bệnh di truyền - Vấn đề an toàn: Liệu pháp gen trường hợp đặc biệt kỹ thuật chuyển gen trực tiếp người bệnh, cần tuân thủ nghiêm ngặt quy định để giảm thiểu rủi ro - Một số rủi ro liệu pháp gen: Trạng thái tự nhiên ngắn (hiệu ngắn) Phản ứng miễn dịch làm giảm hiệu liệu pháp gen lặp lại liệu pháp gen khơng có ý nghĩa Có nhiều bệnh rối loạn đa gen gây (nhiều gen tác động gây bệnh) Gắn sai vị trí gen hay gây đột biến gen lành  Gen đưa vào không nằm phức hợp điều hịa nên điều khiển cách tùy tiện, khơng vị trí (các tế bào hay mô đặc hiệu) không thời điểm (đúng chu trình phát triển cá thể), hay khơng biểu  Một số loại vector liệu pháp đưa vào thể người Adenovirus, Retrovirus biến đổi trở thành tác nhân gây bệnh số gen đột biến chưa đầy đủ - Một số khó khăn ứng dụng liệu pháp gen chữa trị bệnh: Liệu pháp gen giới hạn chặt chẽ tế bào sinh dưỡng, tế bào sinh dục bị nghiêm cấm lý đạo đức 242 Kỹ thuật sử dụng liệu pháp gen phức tạp, địi hỏi xác mà số phịng thí nghiệm tiên tiến thực Vì vậy, liệu pháp gen điều trị, chữa bệnh phải nghiên cứu cải tiến có hiệu rõ rệt - Triển vọng liệu pháp gen Trên giới, liệu pháp gen nhiều nước tiên tiến thực nghiên cứu, điều trị cho nhiều bệnh nhân mắc bệnh di truyền bệnh suy giảm miến dịch trầm trọng, thiếu máu hồng cầu hình liềm, bệnh xơ nang Với phát triển khoa học kỹ thuật hứa hẹn khắc phục vấn đề khó khăn nghiên cứu ứng dụng liệu pháp gen điều trị bệnh, đặc biệt bệnh di truyền người 6.3.2 Chữa bệnh ung thư Ung thư nhóm bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào cách vơ tổ chức tế bào có khả xâm lấn mô khác cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận di chuyển đến nơi xa (di căn) Những nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy q trình điều hịa phân bào tế bào liên quan tới nhiều gen mã hóa cho protein Có nhiều mối quan hệ gen bất thường (đột biến) ung thư hoạt hóa oncogene bất hoạt gen ức chế ung thư 243 Nguyên nhân gây ung thư: Là sai hỏng DNA, tạo nên đột biến gen thiết yếu điều khiển trình phân bào chế quan trọng khác Một nhiều đột biến tích lũy lại gây tăng sinh khơng kiểm sốt tạo thành khối u Các phương pháp điều trị ung thư phổ biến bao gồm phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, miễn dịch trị liệu Các phương pháp có nhược điểm: Phẫu thuật khơng hiệu với chứng di Hóa trị liệu, xạ trị liệu miễn dịch trị liệu gây thương tổn đến mô lành Biện pháp phẫu thuật ung thư Biện pháp xạ trị ung thư 244 Biện pháp hóa trị ung thư  Liệu pháp gen điều trị ung thư thường theo xu hướng tác động trực tiếp vào khối u theo phương thức khác nhau: - Thay gen bị thiếu bị thay đổi gen khỏe mạnh - Tăng cường đáp ứng miễn dịch bệnh nhân từ kích thích khả tự nhiên thể chống lại tế bào ung thư - Đưa gen vào tế bào ung thư để làm chúng nhạy cảm với hóa trị, xạ trị phương pháp điều trị khác  Một số chiến lược liệu pháp gen chữa bệnh ung thư gồm: Liệu pháp gen miễn dịch (immunogene therapy) Điều trị ung thư liệu pháp gen miễn dịch cách kích thích hệ miễn dịch thể gia tăng số lượng tế bào miễn dịch,đặc biệt đại thực bào (Macrophage) tế bào giết tự nhiên ''NK'' nhằm tăng cường khả tiêu diệt tế bào ung thư khống chế khả phát triển, di khối u ung thư 245 Liệu pháp gen ức chế khối u (tumor suppressor gene therapy) Việc ức chế khối u nhằm ngăn cho khối u tiếp nhận chất dinh dưỡng để phát triển 246 Liệu pháp gen hóa học (chemogene therapy) Liệu pháp ức chế tạo mạch (aginogenesis therapy) Khối ung thư cần mạch máu cho phát triển chúng máu nguồn cung cấp oxy dinh dưỡng liên tục cho tế bào ung thư Các khối u thường tiết yếu tố kích thích di căn, tăng trưởng nhanh hình thành 247 mạch máu Do khối u khơng thể phát triển khơng có hệ thống mạch máu ni dưỡng nên việc ngăn chặn hình thành mạch (sự phát triển mạch máu mới) mục tiêu điều trị ung thư Liệu pháp virus hủy khối u (oncolitic vius therapy) VD: Bệnh bạch cầu lympho mãn tính biểu tăng sinh bất thường số bạch cầu lympho bào B Tận dụng loại virus vô hại, chúng gắn vào mã gen lympho T, gắn vào protein CD19, diện bề mặt lympho B Sự gắn kết gây hai hậu quả: lympho T phá hủy lympho B tự nhân Sau lympho bào T bị biến đổi gen tiêm vào thể bệnh nhân, tiêu diệt ung thư Trong liệu pháp gen ung thư, vector có chất virus vector khác sử dụng, vector khơng có chất vius có hiệu biến nạp in vivo thấp hơn, nên vector virus thường sử dụng Đối với vector virus vector retrovirus vector adenovirus trọng Song, vector retrovirus nhiễm vào tế bào bị ung 248 thư sát nhập vào tế bào chủ, chúng gây đột biến chèn đoạn Vì vậy, hầu hết quy trình liệu pháp gen bệnh ung thư nên sử dụng adenoviruse 6.3.3 Chữa bệnh nhiễm, bệnh mắc phải Các nhà khoa học tích cực nghiên cứu, ứng dụng liệu pháp gen chữa trị bệnh người tác nhân vi sinh vật, đặc biệt với tác nhân gây bệnh virus Trong hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải người (AIDS) virus HIV gây tìm hiểu nhiều tính nguy hiểm chúng Một số chiến lược liệu pháp gen cho bệnh AIDS: - Can thiệp trực tiếp vào trình chép virus nucleotide, hay protein chống virus - Cảm ứng trình chết virus HIV tế bào - Tăng cường miễn dịch cách đưa gen hay chất vào thể Công việc cần tiến hành can thiệp vào đường xâm nhập virus HIV Sự gắn virus HIV lên bề mặt tế bào bước trình chép virus Mục đích đặt khóa tương tác virus HIV receptor CD4 hay đồng receptor khác Ở bước thứ hai, khóa phiên mã dịch mã virus, việc sử dụng antisense, ribozyme…để phân hủy gen hay sử dụng protein trị liệu nhằm gắn kết, gây bất hoạt protein virus, từ q trình phiên mã dịch mã khơng thể xảy Gần đây, vaccine DNA nghiên cứu mã hóa cho phân tử protein gây đáp ứng miễn dịch đưa vào thể 249 Các DNA sử dụng làm vaccine thường gen mã hóa cho phân tử protein đặc trưng, gây đáp ứng miễn dịch mạnh không độc virus Khi hạt virus HIV khỏi tế bào nhiễm gen cịn tốn tế bào chủ (đã sát nhập vào gen tế bào) Do vậy, để xóa dấu vết virus thể phải cảm ứng tạo chết cho tế bào bị nhiễm Đây cảm ứng chết chọn lọc với tế bào bị nhiễm virus với tế bào có DNA virus sát nhập gen Tăng cường đáp ứng miễn dịch cho tế bào tiến hành ba phương pháp sau: (1) Đưa gen mã hóa cho thymidine kinase virus herpes simplex vào tế bào nhiễm virus HIV (HSV-tk), thông qua vector HIV-1 Những tế bào biểu gen HSV-tk bị tiêu diệt ganciclovir Đây liệu pháp trước dùng thuốc (produg) (2) Sự biểu nội bào kháng thể, chuỗi nặng nhẹ mảnh Fab bảo vệ tế bào limpho khỏi nhiễm HIV (3) Tăng cường hệ miễn dịch cách them vào lymphokine cytokine, chẳng hạn interferon có tác dụng lên nhiều bước khác chu trình sống virus HIV 6.3.4 Liệu pháp gen ứng dụng cấy ghép Những thành tựu to lớn việc sử dụng loại thuốc ức chế miễn dịch cyclosporine, corticosteroid, rapamycin… làm tăng tỉ lệ dung nạp mảnh ghép thành công từ 70 – 85% kéo dài thời gian dung nạp từ – năm Tuy nhiên, việc tiềm ẩn rủi ro lớn phát triển ung thư, bệnh nhiễm… Do vậy, liệu pháp gen chiến lược tốt, tối ưu hóa cho việc cấy 250 ghép, đồng thời giải hạn chế thuốc ưc chế miễn dịch Trong lĩnh vực cấy ghép quan, liệu pháp gen ứng dụng nhằm ngăn cản đào thải cấp tính, hay mãn tính mơ ghép cách đưa gen có vai trị ngăn cản thải loại (như gen mã hóa cho phân tử khóa đồng kích thích, cytokine ức chế miễn dịch, hay antisense khóa biểu gen mã hóa cho phân tử liên quan đến thải loại mơ ghép) Ngồi ra, nhà khoa học thử nghiệm tiến hành đưa gen mã hóa dị kháng ngun (alloantigene) nhằm kích thích dung nạp mô ghép Liệu pháp gen ứng dụng cấy ghép tiến hành Haskova Medawar (1958) Trong thí nghiệm Medawar, DNA từ lách chủng chuột cho mô ghép (A) tách chiết tiêm 5mg vào khoang màng bụng chủng chuột nhận mô ghép (CBA) Sau -5 ngày tiêm, tiến hành cấy da chuột cho mảnh ghép A cho chuột nhận mảnh ghép (CBA) theo dõi Kết cho thấy mảnh ghép cấy chuột tiêm DNA bị thải loại tỉ lệ với mảnh ghép cấy chuột không tiêm DNA khơng biểu đáp ứng tăng cường Ở thí nghiệm khác, Medawar tiến hành tiêm DNA chủng với liều cao vào chuột sinh để cảm ứng dung nạp miễn dịch Kết cho thấy có dung nạp mảnh ghép, nhiên dung nạp không kéo dài đến lần cấy ghép sau 6.3.5 Liệu pháp gen việc “thiết kế người” Đã từ lâu, nhiều gia đình mong muốn sinh khỏe mạnh, thơng minh, ngoại hình đẹp… Sự kết hợp chẩn đoán phân tử liệu pháp gen giúp thực ước mơ Chẩn đốn phân tử tiến sinh giúp sáng lọc chọn lọc 251 tính trạng mong muốn (chẳng hạn giới tính trẻ), số bệnh, đặc biệt bệnh di truyền mà đứa trẻ mắc phải Hơn nữa, liệu pháp gen cịn giúp thay đổi tính trạng đứa trẻ Để thay đổi tính trạng, phải xác định tất (hay đủ) gen đặc biệt khác mà diện hay vắng mặt đồng tương tác với tính trạng mong muốn thơng minh hơn, trí nhớ tốt hơn, chịu lạnh, chịu nóng… Sau gen xác định, tiến hành tách chiết, chép, hay tổng hợp sau chèn vào tế bào phơi giai đoạn sớm (blastomere) hay vào tinh trùng hay trứng Bằng cách này, đứa trẻ đời mang tính trạng mong muốn Tuy nhiên tính trạng mà người mong muốn (ngoại hình đẹp, thơng minh, trí nhớ tốt…) hầu hết đa gen, nghĩa phụ thuộc vào nhiều gen đặc biệt vài hay nhiều locus khác Mối quan hệ tương tác gen ảnh hưởng chúng môi trường phức tạp Do vậy, để “thiết kế người” mong muốn, khoa học tiếp tục giải nhiều khó khăn đặt Ngồi ra, liệu pháp gen, người tạo sinh vật Sinh vật kết kết hợp tính trạng cá thể khác Tuy nhiên, việc thiết kế người tạo sinh vật gây tranh cãi nhiều 252 ... cứu liệu pháp gen .123 5.2 Chiến lược liệu pháp gen 127 5.2.1 Liệu pháp in vivo 127 5.2.2 Liệu pháp ex vivo .128 5.3 Vector có chất virus dùng liệu pháp gen. .. 98 3.2.3 Chẩn đoán phân tử .101 3.3 Chẩn đoán bệnh di truyền 105 3.3.1 Chẩn đoán trước làm tổ (Preimplantation Genetic Diagnosis – PGD)105 3.3.2 Chẩn đoán tiền sinh (Prenatal... 248 6.3.4 Liệu pháp gen ứng dụng cấy ghép 250 6.3.5 Liệu pháp gen việc “thiết kế người” .251 Chương 1: Một số khái niệm chẩn đoán 1.1 Chẩn đoán Trong y học, chẩn đốn (diagnosis)