CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ VÀ LIỆU PHÁP GENE

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ VÀ LIỆU PHÁP GENE GVHD TS Nguyễn Hữu Đức SVTH Trần Thị Kim Chi 580881 Tạ Thị Hiền 580895 Lê Thị May 587023 Nguyễn Thị Phượng 591179 Nguyễn Thị Huyền Trang 587786 Hà Nội - 2016 Nội dung a Hoạt động ribozyme b Các kiểu ribozyme II.2.3 Ribozyme c Những biến đổi ribozyme II.2.4 Triplex DNA d RNAi II.2.5 SMaRT II.2.3 Ribozyme a.Hoạt động ribozyme Các ribozyme xúc tác tồn tự nhiên II.2.3 Ribozyme a.Hoạt động ribozyme Cech cs (1981) phát số hoạt tính cắt nhóm intron I thuộc Tetrahymena thermophilia Ribozyme Enzyme có chất RNA Sự phát triển ribozyme cắt trans khích lệ việc sử dụng ribozyme cho mục đích liệu pháp Hammerhead (ribozyme đầu búa) https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e1/Hammerhead.png?uselang=vi Bacterial RNase P class A https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/90/RF00010.jpg Group I introns https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/4d/GI_catalysis.jpg Ribonuclease P Archaeal RNase P https://en.wikipedia.org/wiki/Ribonuclease_P#/media/File:RNasePimage_ https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/27/RF0037 wiki.png 3.jpg II.2.3 Ribozyme a.Hoạt động ribozyme  Trung tâm xúc tác ribozyme kết hợp với phân tử RNA antisense thể cắt chuyên biệt với chất mục tiêu RNA Hình 10.25 Hoạt động kết hợp RNA antisense ribozyme Kỹ thuật antisense Kỹ thuật ribozyme Lĩnh vực y sinh học II.2.3 Ribozyme Hình 10.26 Cấu trúc thứ cấp I nrdB chế tự cắt inron a.Hoạt động ribozyme II.2.3 Ribozyme a.Hoạt động ribozyme Bất hoạt chức RNA mục tiêu Hoạt tính enzyme Thời gian đủ dài trung tâm xúc tác ribozyme Cắt phá hủy RNA mục tiêu https://vi.wikipedia.org/wiki/Ribozyme#/media/File:Ribozyme.jpg II.2.3 Ribozyme a.Hoạt động ribozyme 10 Phiên mã in vitro siRNA Tạo mạch khuôn Phiên mã dsDNA trình mạch khuôn DNA tự mRNA dài 21 bp mục tiêu bên sườn promoter T7 Tạo siRNA Gắn ssRNA với trưởng thành sử dụng T7 RNA trình tự antisense cách xử lý với phản polymerase để tạo để tạo dsRNA ứng DNase để tạo nhỏ mạch khuôn DNA RNA mạch đơn nhỏ (ssRNA) RNase 31 http://abo.com.pl/ https://www.lifescience.roche.com 32 Tạo siRNA “cocktail” Tạo dsRNA dài chứa RNA phiên mã từ mạch khuôn DNA sử dụng T7 RNA polymerase Để tạo siRNA cocktail, cDNA nguyên vẹn phiên mã để sản xuất mạch sense antisense RNA RNA sense antisense bắt cặp hình thành nên dsRNA , sau loại bỏ DNase siRNA (21-23 nucleotide) tạo in vitro cách cắt dsRNA với RNase tái tổ hợp hay enzyme Dicer cho cocktail siRNA 33 Tạo siRNA sử dụng vectơ biểu Sử dụng vectơ biểu siRNA dạng phân tử RNA loop kẹp tóc Trình tự mã hóa shRNA khoảng 50 nucleotide chứa 20 nucleotide bổ trợ với trình tự mục tiêu, trình tự antisense đặt theo hướng đảo ngược chúng tách biệt với khoảng trống để tạo loop kẹp tóc Sau biểu shRNA chế biến cytoplasm thành siRNA hoạt động, sau chúng thu hút phức hợp RISC dẫn đến RNA mục tiêu 34 Hình 10.31: Tạo shRNA từ cassette biểu shRNA (Ketting cs, 2001) http://jcs.biologists.org/ 35 Các mảnh tạo trình PCR - Đầu tiên, tổng hợp oligonucleotide DNA hai mạch bổ trợ khoảng 50 nucleotide mã hóa trình tự sense antisense shRNA - Các oligonucleotide tách mạch gắn lại, cuối phản ứng nối quy trình PCR sử dụng primer chứa trình tự promoter terminator => tạo mảnh shRNA hoạt động http://www.bio.davidson.edu/ 36 Ribozyme 37 II.2.4 Chiến lược Triplex DNA : làm thay đổi biểu gen dựa Triplex DNA gắn trực tiếp oligonucleotide lên DNA 38 II.2.4 Triplex DNA Cách tiếp cận Làm thay đổi biểu Sử dụng PNA thay Oligonucleotide gắn vào gen dựa gắn trực tiếp đoạn mạch xoắn kép rãnh lớn xoắn DNA lên DNA DNA hình thành triplex 39 II.2.4 Triplex DNA Nguyên lí hoạt động: PNA thay đoạn chuỗi xoắn kép DNA, PNA-DNA ổn định DNA-DNA (Egholm cs, 1993), PNA ổn định tế bào mức độ thành công phụ thuộc tế bào phôi hay tế bào biệt hóa Hình 10.33 Sự bắt cặp kiểu Watson-Crick, Hoogsteen Hoogsteen ngược 40 II.2.4 Triplex DNA 41 II.2.5 SMaRT SMaRT - “cắt nối chéo RNA thông qua spliceosome” (spliceosome mediated RNA trans-splicing) Hình 10.34 Chiến lược SMaRT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Kim Ngọc Phạm Văn Phúc (2007), Công nghệ sinh học người động vật, NXB Giáo dục 43 44 CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE! 45