Phương pháp giải đông phôi và Những tổn hại đến tế bào phôi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Khoa Công nghệ sinh học Phương pháp giải đông phôi Những tổn hại đến tế bào phôi Giảng viên TS Nguyễn Hữu Đức Sinh viên Bùi Hà My – 587048 Ta Thị Hiền – 580895 Nguyễn Thị Huệ - 580903 Hà Nội – 2015 III – Phương pháp giải đông phôi Tại phải giải đông phôi? Giải đông • Phôi đông lạnh -1960C • Trong chất bảo vệ sinh học lạnh có tinh thể nước đá => Không sử dụng • Phôi đưa trạng thái ban đầu • Không có tinh thể nước đá • Không chất bảo vệ sinh học lạnh => Sử dụng Phụ thuộc vào: • Phương pháp đông lạnh • Việc bổ sung chất bảo vệ sinh học lạnh Nguyên tắc giải đông phôi Làm tan đông lạnh Phương pháp giải đông Tốc độ tăng nhiệt chậm Tốc độ tăng nhiệt từ 4ºC/phút đến 25ºC/phút Tốc độ tăng nhiệt nhanh Tốc độ tăng nhiệt 360ºC/phút Rút tách chất bảo vệ sinh học lạnh Pha loãng nhiều giai đoạn • – giai đoạn • Nồng độ nồng độ cao đông lạnh, nồng độ sau giảm dần • Thời gian phân cách – 10 phút Pha loãng giai đoạn • Sử dụng tập hợp chất khả xâm nhập vào tế bào • Nguyên lý: pha loãng khuếch tán bị động đơn giản • Sức sống phôi giảm • Số lượng tế bào phôi chết tăng lên • Tế bào phôi bị phá hủy cấu trúc • Biến dạng hình thái tế bào Tinh thể nước đá Nhiệt độ cách sử dụng chất bảo quản sinh học lạnh Tế bào phôi Sự hình thành tinh thể nước đá Nhiệt độ Sự hình thành tinh thể nước đá Bản chất nồng độ chất hòa tan Nhiệt độ Tinh thể có dạng sáu cạnh Tinh thể dạng khác thường “hình gỗ” Tinh thể dạng hạt đám hình cầu có diện tích lớn Chiều tăng tốc độ đông lạnh Băng vô định hình thu nước ngưng đọng giá -160oC Băng đá nội bào tan Phôi giải đông hoàn toàn Tái tạo tinh thể nước đá ngoại bào Trong trình làm nóng lên xảy tái tạo tinh thể hóa tinh thể nước đá tạo trình đông lạnh • Phải trải qua từ phân tử nước có diện tích tinh thể nhỏ đến phân tử nước có diện tích tinh thể lớn • Kết sản sinh tinh thể nước cách đột ngột với dung dịch đậm đặc (có 25% - 60% chất hòa tan) làm nóng lên từ từ sau đông lạnh nhanh Nâng nhiệt độ từ từ giải đông bất lợi Làm giảm giá trị tốc độ đông lạnh tới hạn => Không có tinh thể hình thành Làm giảm giá trị tốc độ nâng nhiệt => Giai đoạn thủy tinh không kịp tái tạo tinh thể Trả lại sử ổn định trạng thái không tinh thể (vô định hình) dung dịch nhiệt độ thấp Những biến đổi lý hóa dung dịch phức hợp Môi trường tế bào phôi môi trường đông lạnh dung dịch phức hợp tạo nên pha trộn chất ion hóa không ion hóa với phân tử nước phân cực mạnh hướng tới bao quanh chất hòa tan đồng thời đẩy dung môi phân cực 2.1 Độ pH dung dịch biến đổi theo nhiệt độ • Sự cân Với bằngnồng axit-bazơ (acid (50%) – base) môi trường cải độ mạnh biến sau:dung lực ion lêncủa để dễ dàng làm cho kết tủa môi,tăng độ pH đệm tan (PBS) photphat hợp chất hòa trongvới môi trường protein DMSO tăng • Sự biếnglycerol đổi độ pH dung độsống khác có thểnhau nhanh lại ổn định dịch theo nhiệtSự sau bảo tùy theosoloại bảo vệ sinh hay học lạnh đượctồn sử dụng vớichất propandienol methanol Với nồng độ yếu (10-20%), độ pH dung dịch PBS glycerol tiếp tục ổn định với dung dịch đệm TRIS có biến đổi bật quản nhiệt độ xấp xỉ 0oC có pH > 2.2 Nồng độ dung môi hữu Nhiệt độ giảm Độ nhớt dung dịch tăng Sự chuyển động nước giảm Nồng độ tăng Các thành phần dung dịch xáo trộn Những biến đổi màng tế bào phôi Ở nhiệt độ thấp băng đá nội bào căng giãn học làm biến đổi màng tế bào Những biến đổi protein màng tế bào nguyên nhân chủ yếu tồn hồi phục màng From what ? Những biến đổi khởi đầu từ: • Những rối loạn tốc độ phản ứng enzym • Sự gãy màng sau giải đông 3.1 Tốc độ phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào lượng hoạt hóa phân tử phản ứng Từ 20oC, tốc độ phản ứng enzym giảm theo nhiệt độ cách ổn định theo trình tự từ hai đến ba với khoảng cách 10 oC Trong số trường hợp hạ nhiệt thấy xuất tác hại thực đến biến đổi cấu trúc hoạt động protein 3.2 Làm Sự lạnh gãy nhiệtmàng độ xấp xỉtế bào 0oC làm giảm độ khuếch tán chiều protein màng Ở nhiệt độ thấp hơn, màng hướng nồng độ cao muối, trình đông lạnh chậm Các màng hướng nồng độ ion tăng trở nên nhạy cảm với “stress” Màng gãy Cảm ơn thầy Và bạn lắng nghe