Chẩn đoán phân tử trong chẩn đoán Lao

Chẩn đoán bệnh lao bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, ELISA, REALTIME PCR, RTPCR. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, chúng ta có thể chẩn đoán một cách chính xác nhất các bệnh lao và liên quan đến lao như lao xương, lao hạch, lao tủy. Tài liệu được áp dụng cho sinh viên chuyên ngành y dược, sinh học phân tử.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ KHOA VẬT LÝ KỸ THUẬT & CÔNG NGHỆ NANO TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ ĐỀ TÀI CHẨN ĐOÁN BỆNH LAO GV : TS Hà Thị Quyến SV : Phạm Văn Hòa Hà Nội - 2015 2|Page MỤC LỤC I MỞ ĐẦU II TỔNG QUAN Lịch sử bệnh lao Giới thiệu chi tiết bệnh Tác nhân chế gây bệnh 3.1 Giới thiệu vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis 3.2 Cơ chế gây bệnh 3.3 Lao kháng thuốc Cấu trúc phân tử (gene) gen có ý nghĩa chẩn đoán Vắc xin BCG công trình nghiên cứu III CHẨN ĐOÁN BỆNH Phương pháp chẩn đoán thông thường 1.1 Chẩn đoán lâm sàng 1.2 Xét nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen) 1.3 1.4 1.5 Xét nghiệm hình ảnh (X-quang) Nuôi cấy đờm Phản ứng tuberculin (Mantoux) Phương pháp chẩn đoán phân tử 1.1 PCR 1.2 Real time PCR 1.3 ELISA IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 3|Page I MỞ ĐẦU Lao tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp phổi ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương khớp Hiện lao bệnh nhiễm khuẩn thường gặp nhất, ảnh hưởng đến tỉ người tức 1/3 dân số, với triệu ca năm, gây triệu người tử vong, hầu hết nước phát triển Hầu hết (90%) trường hợp nhiễm khuẩn lao tiềm ẩn không triệu chứng 10% người đời họ tiến triển thành bệnh lao có triệu chứng, không điều trị, giết 50% số nạn nhân Lao bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao giới: HIV/AIDS giết triệu người năm, lao giết triệu, sốt rét giết triệu Sự lãng chương trình kiểm soát lao, bùng phát đại dịch HIV/AIDS việc di dân khiến lao trỗi dậy Các chủng lao kháng đa thuốc (MDR, multiple drug resistant) tăng Năm 1993, Tổ chức Y tế Thế giới tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu lao Do đó, việc phát điều trị kịp thời bệnh lao quan trọng Hiện nay, vi khuẩn lao phát nhiều phương pháp khác xét nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng tuberculin hay soi phế quản Tuy nhiên, phương pháp tồn số mặt hạn chế tốn nhiều thời gian để chẩn đoán, cho kết có độ xác không cao,… Ngày nay, với phát triển kỹ thuật sinh học phân tử giúp cho trình chẩn đoán vi khuẩn lao nhanh chóng hiệu Trong tiểu luận xin đề cập đến số phương pháp chẩn đoán bệnh lao sử dụng nước 4|Page II TỔNG QUAN Lịch sử bệnh Lao Năm 1819, người Pháp tên René Laennec (1781-1826) phát minh ống nghe, đăng lần báo chuyên luận ống nghe bệnh Ông áp dụng phương pháp cho bịnh gặm mòn ông để năm sau ông mất, lúc 45 tuổi: bệnh lao Bịnh ông lỡ cắt trúng tay giải phẫu tử thi người chết bịnh lao để khám nghiệm Bệnh lao biết từ thời thượng cổ, có tên "phtisie" (tiếng Hy Lạp phtio nghĩa "tôi giết") Bệnh nổ Anh quốc kỷ thứ 18, lan tràn khắp Âu châu Đó bệnh nghiêm trọng kỷ 19 ám ảnh nhà văn y sĩ Bệnh thường thấy niên, làm họ chết sau 18 tháng đến năm Sự tác hại lớn: điều kiện sống có tốt nghĩa người có sức chống bệnh cao hơn, năm 1900 nguyên nhân 12% số người chết nước Pháp Cho dù bệnh lao công tất quan, từ màng não ruột non qua xương, thận, tử cung, bệnh lao phổi chiếm đến 80% Laennec chứng minh tính riêng biệt bệnh giai đoạn khác phân biệt dạng lao phổi khác với nhiễm trùng phổi khác Những tác giả kỷ thứ 19 diễn tả chu kỳ bệnh này: bệnh nhân ốm yếu dần, ho khan, khạc đờm, đổ mồ hôi nhiều đêm, cảm thấy đau vai lồng ngực, rối loạn tiêu hóa thân nhiệt lên ban đêm Khi khám phổi, y sĩ nghe thấy tiếng khô ráp, tiếng ran nổ nhẹ, tiếng rắc Vài tháng sau, bắt đầu ho thường xuyên đau Đờm màu xanh với mảnh đặc trắng Bệnh nhân ói mửa, ăn ngon, sốt Tiêu chảy làm bệnh nhân yếu Ống nghe bệnh dụng cụ quí báu phát minh, nghe phổi truyền tiếng òng ọc từ "bình bị rạn nứt" hay tiếng ồ từ "đáy hang" (theo lời Laennec) 5|Page Trong pha đầu, khám nghiệm tử thi, ông thấy thấy hột nửa nửa đục nhỏ hột kê lớn hột đậu tràn lan phổi Sau hột trở thành mềm đổi màu trăng trắng, "một viên phó mát bị ngón tay đè nát" Chính thứ bắt bệnh nhân khạc cách khó nhọc Bên cạnh hột lỗ hổng lớn cỡ hột hạnh nhân có to nắm tay có chứa không chứa chất lỏng Phổi bị tàn phá, chứa đầy không khí Trong suốt kỷ, gánh nặng qui tụ quanh nhiều ảo giác Vào năm 1840, bệnh lãng mạn, yếu ớt tỉnh táo Sau đến triều đại Napoléon, người ta tưởng bệnh tinh hoa, từ Aiglon, trai Napoléon đệ Chopin bệnh bà Beaumont Chateaubriand miêu tả bà Marie Duplessis, mẫu đàn bà Trà hoa nữ (Dame aux Camélias) Alexandre Dumas fils (1824-1895) Traviata Juiseppe Verdi (1813-1901) Vào cuối kỷ họ khám phá người nghèo bị lao nhiều Những nhà đạo đức học cho bệnh xảy cho người nghiện rượu có sống thác loạn Họ cho thành phố nơi gom tụ xấu xa nên sinh bệnh ác hại Nhưng không chừa tận thôn quê Từ năm 1865 người ta biết bệnh lao truyền nhiễm Giới trưởng giả hốt hoảng, đuổi người hầu thấy họ bắt đầu ho Các nghiệp đoàn khám phá gánh nặng cảnh nghèo bóc lột: năm 1901, Ferdinand Pelloutier nhấn mạnh bệnh phtisie giết gấp lần người quận 15, lúc quận nghèo, khu Opéra Mặc dù có tiến thực tiễn hiểu biết ăn bệnh, y sĩ chưa có khí giới Để chữa trị , họ chữa trị người giàu có cách khuyên họ ăn uống tẩm bổ, nghỉ ngơi, hít thở gió biển, tới Madère, Naples hay đến miền Nam nước Pháp 6|Page Đến kỷ, Hermann Brehmer Peter Dettweiler chế sanatorium, kéo người bệnh khỏi giới kéo dài hàng năm gây cảm hứng sáng tác văn chương nơi có tiểu thuyết Thomas Mann La montagne magique (Núi thần diệu) Năm 1884, hy vọng lớn lao đến nhà khoa học Đức Robert Koch (1843-1910) khám phá trực khuẩn bệnh lao Tuy nhiên phải đợi dến năm 1921 hai nhà bác học Albert Calmette (1863-1933) Camille Guérin (18721961) cô lập trực khuẩn vô hại, nghĩa chủng ngừa, thuốc chủng B.C.G (Baccillus Calmette Guérin) Lúc đầu người ta chủng ngừa bệnh, sau phổ biến rộng rãi cuối hầu hết nước bắt buộc phải chủng ngừa bệnh lao Tuy nhiên người bịnh chưa có thuốc chữa thời kỳ Thế giới Chiến tranh lần thứ Hai, loại thuốc trị chế tạo có hiệu nghiệm streptomycine, isoniazide hay rimifon Trong năm 50, bệnh lao đẩy lùi nước kỹ nghệ hóa Các nhà điều dưỡng vắng dần Con người quên sợ hãi nghe tên bệnh Tuy nhiên bệnh lao tiếp tục hoành hành nước thuộc giới thứ ba mà năm giết khoảng 2-3 triệu người Giới thiệu chi tiết bệnh Lao Lao tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp phổi ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương khớp Hiện lao bệnh nhiễm khuẩn thường gặp nhất, ảnh hưởng đến tỉ người tức 1/3 dân số, với triệu ca năm, gây triệu người tử vong, hầu hết nước phát triển Hầu hết (90%) trường hợp nhiễm khuẩn lao tiềm ẩn không triệu chứng 10% người đời họ tiến triển thành bệnh lao có 7|Page triệu chứng, không điều trị, giết 50% số nạn nhân Lao bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao giới: HIV/AIDS giết triệu người năm, lao giết triệu, sốt rét giết triệu Lao lan truyền qua giọt nước không khí từ chất tiết ho, nhảy mũi, nói chuyện hay khạc nhổ người nhiễm vi khuẩn hoạt động Tiếp xúc gần gũi (kéo dài, thường xuyên, thân mật) nguy nhiễm bệnh cao (khoảng 22%, đến 100%) Người mắc lao hoạt động không điều trị lây sang 20 người khác năm Các nguy khác bao gồm đời vùng lao phổ biến, bệnh nhân rối loạn miễn dịch (như HIV/AIDS), cư dân làm việc nơi đông người nguy cao, nhân viên chăm sóc sức khoẻ phục vụ đối tượng có nguy cao, nơi thu nhập kém, thiếu vắng dịch vụ y tế, dân thiểu số nguy cao, trẻ em phơi nhiễm với người lớn thuộc nhóm nguy cao, người tiêm chích ma tuý Lây truyền xảy người mắc bệnh lao hoạt động (không phải lao tiềm ẩn) Khả lây truyền phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn người mắc lao (số lượng tống xuất), môi trường phơi nhiễm, thời gian phơi nhiễm độc lực vi khuẩn Đờm người bệnh nguồn lây quan trọng Người bệnh ho, nói, khạc, tạo hạt nước bọt nhỏ chứa đầy vi khuẩn lao bay lơ lửng không khí (Nói : 200, Ho : 3.500, Hắt xì : 4.500 – 1.000.000) Người ta hít phải hạt vào phổi mắc bệnh Những bệnh nhân đờm có vi trùng lao lây nhiều Vi trùng lao gây bệnh tất phận thể Người nhiễm lao trở thành bệnh lao, tỷ lệ từ nhiễm lao chuyển thành mắc lao 10% đời người, cao 24 tháng.( HIV+ 10% năm) Những người sống gần bệnh nhân, nguy lây bệnh cao Chuỗi lây truyền chấm dứt cách cách ly người bệnh giai đoạn bệnh hoạt động áp dụng biện pháp điều trị kháng lao hữu hiệu 8|Page Mycobacteria lây nhiễm lên nhiều động vật khác, bao gồm chim, động vật gặm nhấm, bò sát Phân loài loài Mycobacterium tuberculosis, dường có mặt loài động vật hoang dã Một nỗ lực để diệt trừ bệnh lao bò Mycobacterium bovis đàn gia súc nai New Zealand tương đối thành công Những nỗ lực Anh thành công Tác nhân chế gây bệnh 3.1 Tác nhân gây bệnh 3.1.1 Vi khuẩn M Tuberculosis Tác nhân gây bệnh lao, Mycobacterium tuberculosis (MTB), vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn phân chia 16 đến 20 giờ, chậm so với thời gian phân chia tính phút vi khuẩn khác (trong số vi khuẩn phân chia nhanh chủng E coli, phân chia 20 phút) MTB không phân loại Gram dương hay Gram âm chúng đặc tính hoá học này, thành tế bào có chứa peptidoglycan Trên mẫu nhuộm Gram, nhuộm Gram dương yếu không biểu Trực khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, chịu đựng chất sát khuẩn yếu sống sót trạng thái khô nhiều tuần nhưng, điều kiện tự nhiên, phát triển sinh vật ký chủ (cấy M tuberculosis in vitro cần thời gian dài để lấy có kết quả, ngày công việc bình thường phòng xét nghiệm) Trực khuẩn lao xác định kính hiển vi đặc tính nhuộm nó: giữ màu nhuộm sau bị xử lý với dung dịch acid, phân loại "trực khuẩn kháng acid" (acid-fast bacillus, viết tắt AFB) Với kỹ thuật nhuộm thông thường nhuộm Ziehl-Neelsen, AFB có màu đỏ tươi bật xanh Trực khuẩn kháng acid xem kính hiển vi huỳnh quang phép nhuộm auramine-rhodamine 9|Page Phức hợp M tuberculosis gồm loài mycobacterium khác có khả gây lao: M bovis, M africanum M microti Hai loài đầu gây bệnh loài thứ không gây bệnh người Hình : Vi khuẩn M tuberculosis (Nguồn : benhlao.net) 3.1.2 Cấu tạo vi khuẩn M Tuberculosis Trực khuẩn lao gồm có thành phần:  Lipit ( lớp sáp): Chiếm 40% trọng lượng khô, chất lipit có mối liên hệ chặt chẽ với cấu trúc vách tế bào làm cho vi khuẩn có tính kháng acid Đây đặc điểm cấu tạo trực khuẩn lao khác với vi khuẩn khác Lớp sáp phân tích có nhiều yếu tố, có yếu tố gây bệnh tích, có yếu tố mang tính kháng nguyên  Các thành phần khác protein, polysaccharide Vi khuẩn có nhiều yếu tố sợi vách chất nguyên sinh gây bệnh.Trên thân vi khuẩn lao có hạt nhiễm sắc không đều, hạt có tên hạt Much Trước 10 | P a g e Có phản ứng nặng sau tiêm BCG Có khoảng1/1.000.000trường hợp bị nhiễm lao sau tiêm BCG, hay xảy trường hợpnhiễm HIVhoặc trường hợp thiếu hụt miễn dịch nặng Tóm tắt tiêm chủng vắc xin BCG Loại vắc xin Sống giảm độc lực Số liều liều Lịch tiêm Ngay sau sinh sớm tốt Liều nhắc lại Không Chống địnhCó dấu hiệu triệu chứng AIDS Phản ứng sauÁp-xe chỗ, hạch, gặp viêm tủy, nhiễm bệnh tiêm lao Chú ý đặc biệt Tiêm da xác Sử dụng bơm kim tiêm riêng để tiêm vắc xin BCG Liều lượng 0,1ml Vị trí tiêm Mặt phía cánh tay vai trái Đường tiêm Trong da Bảo quản Ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C Vắc xin BCG có hạn chế người ta nghiên cứu loại vắc xin TB Một số ứng viên protein thử nghiệm lâm sàng pha Hai phương pháp sử dụng cố gắng cải thiện hiệu loại vắc xin có sẵn Phương pháp thứ liên quan đến việc thêm tiểu đơn vị vắc xin bào BCG, phương pháp lại cố gắng tạo loại vắc xin sống tốt MVA85A, loại vắc xin ví dụ cho trường hợp đầu, vòng thử nghiệm Nam Phi, dựa loại vi-rút vaccinia bị biến đổi gen Các vắc xin hy vọng có vai trò quan trọng việc điều trị giai đoạn ủ phát bệnh 18 | P a g e Để khuyến khích nghiên cứu xa hơn, nhà nghiên cứu nhà làm sách thúc đẩu mô hình kinh tế việc phát triển vắc xin, giải thưởng, ưu đãi thuế, cam kết thị trường Một số tập đoàn, bao gồm Stop TB Partnership, Tuberculosis Vaccine Initiative Nam Phi, Aeras Global TB Vaccine Foundation, tham gia nghiên cứu Trong số này, Aeras Global TB Vaccine Foundation nhận phần thưởng trị giá 280 triệu đô-la từ Bill and Melinda Gates Foundation để phát triển cấp giấy phép cho loại vắc xin cải tiến ngừa bệnh lao sử dụng quốc gia có gánh nặng cao III CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN Chẩn đoán thông thường 1.1 Chẩn đoán lâm sàng Tuy chẩn đoán lâm sàng không cho xác kết bênh nhân bước quan trọng để đưa phán đoán phương pháp chẩn đoán cụ thể Một số dấu hiệu lao lâm sàng:  Ho kéo dài tuần (ho khan, ho có đờm, ho máu) triệu chứng nghi lao quan trọng  Gầy sút, ăn, mệt mỏi  Sốt nhẹ chiều  Ra mồ hôi “trộm” ban đêm  Đau ngực, khó thở 1.2 Xét nghiệm đờm tìm trực khuẩn lao (phương pháp soi trực tiếp) 19 | P a g e Chẩn đoán lao phổi xét nghiệm đờm tìm trực khuẩn lao biện pháp lại đơn giản, rẻ tiền phù hợp với hoàn cảnh điều kiện nước nghèo, nước phát triển Thông thường nhuộm theo phương pháp Ziehl – Neelsen phương pháp huỳnh quang với ánh sáng cực tím Cần làm xét nghiệm nhiều lần, lần buổi sáng liên tiếp Nếu bệnh nhân không khạc đờm cho bệnh nhân dùng nước muối 5% ưu trương để lấy bệnh phẩm Khi người bệnh nghi bị lao đến khám, phải lấy đờm lần lần ngày khác để xét nghiệm tìm trực khuẩn lao Các mẫu lấy sau: Mẫu 1: lấy đờm chỗ bệnh nhân đến khám Mẫu 2: sau lấy đờm chỗ để có xét nghiệm đờm lần thứ nhất, người bệnh giao cho cốc đựng đờm để sáng sớm hôm sau ngủ dậy lấy mẫu đờm đưa đến phòng khám (xét nghiệm đờm lẫn thứ hai) Mẫu 3: Lấy bệnh nhân đến đưa mẫu đờm lần Bệnh nhân phải điều trị nếu: Kết xét nghiệm có lần dương tính trở lên 1.3 X-quang Là phương pháp quí báu góp phần chẩn đoán lao phổi X-quang có độ nhạy cao độ đặc hiệu thấp chẩn đoán lao phổi Nhiều bệnh có hình ảnh X- quang phổi giống lao phổi, lao phổi ngược lại có hình ảnh dễ nhầm lẫn với bệnh phổi khác 20 | P a g e Mặt khác khó phân biệt tổn thương phổi lao cũ ổn định hay lao tiến triển Vì X-quang yếu tố định chẩn đoán lao phổi Ngày với đại dịch nhiễm HIV/AIDS lan tràn tổn thương lao phổi, người lao phổi nhiễm HIV/AIDS thay đổi nhiều so với hình ảnh mô tả trước (tổn thương lao cổ điển mà nói chủ yếu khu trú đỉnh phổi, tổn thương hang v.v ) để chẩn đoán lao phổi phải phối hợp nhiều biện pháp, kết hợp nhiều yếu tố có chụp X-quang Các hình ảnh Xquang phổi nghi ngờ lao phổi:  Đám mờ không đồng vùng đỉnh vùng xương đòn hai phổi (một hai bên)  Hình hang: Có thể nhiều hang (lao hang)  Những nốt, chấm mờ nhỏ hạt kê, đường kính 1mm lan toả hai phổi (lao kê)  Bóng mờ đặc tròn bầu dục góc hạ đòn hạ phân thuỳ (thâm nhiễm Assman)  Những bóng mờ rốn phổi trung thất hạch lympho sưng to  Có vài nốt nhiều nốt to nhỏ khác đường kính – 10mm đậm độ không đều, thường gặp hạ đòn đỉnh phổi hai bên (lao nốt)  Đám mờ hình thuỳ phổi (tam giác) vị trí thông thường thấy thuỳ thuỳ Nuôi cấy đờm 1.4 Làm tăng kết dương tính nuôi cấy phương pháp cổ điển phải – tuần có kết Ngày nay, người ta tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lao phương pháp MGIT Bactec cho kết nhanh sau 1-2 tuần 21 | P a g e Với trường hợp bệnh nhẹ, trực khuẩn, soi trực tiếp cho kết âm tính nuôi cấy đờm cho kết dương tính Trong chờ đợi kết nuôi cấy cần định việc điều trị vào triệu chứng lâm sàng phim X quang 1.5 Phản ứng tuberculin (Mantoux) Phản ứng tuberculin thể phản ứng dị ứng thể trực khuẩn lao Phản ứng tuberculin dương tính thể thể người làm phản ứng có lúc bị nhiễm trực khuẩn lao Phản ứng tuberculin âm tính thể thể người làm phản ứng chưa có dị ứng với trực khuẩn lao, chưa nhiễm trực khuẩn lao thể yếu, suy kiệt, suy giảm khả miễn dịch nên nhiễm trực khuẩn lao thể phản ứng Như theo dõi chuyển phản ứng tuberculin từ âm tính sang dương tính suy đoán tình hình thể bị nhiễm lao chưa Nếu theo dõi chuyển phản ứng tuberculin cộng đồng dân cư hàng năm, tính số bị nhiễm lao hàng năm tập hợp dân cư Phản ứng tuberculin âm tính thường gặp trường hợp sau: + Suy giảm miễn dịch, nhiễm HIV/AIDS + Dùng corticoid kéo dài + Suy dinh dưỡng, suy kiệt + Đẻ non, thiếu tháng + Người già + Nhiễm virus (sởi, cúm, thuỷ đậu ) + Ung thư, ốm dài ngày, bệnh nặng, nhiễm khuẩn nặng 22 | P a g e Nói chung phán ứng tuberculin có giá trị chẩn đoán trước bệnh nhân làm phản ứng kết âm tính (giá trị chẩn đoán nằm tình trạng chuyển phản ứng) Ở nơi có số nguy nhiễm lao cao, bệnh lao phổ biến trẻ em tiêm chủng BCG, phản ứng tuberculin có giá trị hạn chế dùng để chẩn đoán tình trạng nhiễm lao Có nhiều loại tuberculin quan trọng hai loại tuberculin PPD (purified protein derivative) sau:  PPD-S công nhận PPD tiêu chuẩn quốc tế tuberculin loài có vú  PPD-RT23 lô lớn loại tuberculin tinh khiết, sản xuất năm 1958 dùng rộng rãi nghiên cứu giới Một đơn vị PPDRT23 tương đương đơn vị quốc tế PPD-S Trong chẩn đoán điều tra dịch tễ thường sử dụng đơn vị RT23 Thường tiêm tuberculin da phần 1/3 mặt trước cánh tay trái Không vô khuẩn da aceton hay ether Dùng bơm tiêm tuberculin kim tiêm da số 26 dài 10 mm tiêm 0,1 ml dung dịch tuberculin tiêm da tạo nên cục sần đường kính 5-6 mm Nếu không cục sần tiêm sai kỹ thuật Kết đọc sau 48-72 Ngoài số chẩn đoán thông thường khác để chẩn đoán bệnh lao xét nghiệm máu, lấy dịch dày… Chẩn đoán phân tử 2.1 PCR 2.1.1 Định nghĩa Phương pháp PCR phương pháp khuếch đại nhanh nhiều 23 | P a g e đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp K.Mullis đưa năm 1985 Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR thực hoàn toàn eppendoff thời gian ngắn ta thu nhận nhiều DNA Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phôi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hoá sinh vật mức độ phân tử,… 2.1.2 Nguyên lý Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polymerase hay gọi PCR phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào sợi DNA đơn khác làm khuôn đoạn oligonucleotide làm mồi Sợi DNA đơn tổng hợp nên có trình tự bổ trợ với sợi khuôn Các oligonucleotide dùng làm mồi cho enzyme DNA polymerase sợi biến tính phân đoạn DNA lớn dùng làm sợi khuôn Kết tổng hợp sợi DNA bổ trợ cho sợi khuôn bố mẹ Những sợi có đầu 5’ (chính đầu 5’của mồi oligonucleotide), đầu 3’ chưa xác định độ dài Quá trình tổng hợp định hướng theo oligonucleotide sợi DNA nhắc lại sợi kép biến tính (bằng nhiệt) mồi bổ sung phép gắn vào sợi khuôn (nhờ hạ xuống nhiệt độ thích hợp) Các bước bao gồm: a) biến tính, b) gắn mồi, c) kéo dài mồi tạo chu kỳ phương pháp khuếch đại PCR Sau chu kỳ sợi DNA tổng hợp làm khuôn chu kỳ Một sợi sợi tổng hợp từ chu kỳ trở có đầu 5’ 3’ xác định vị trí gắn mồi oligonucleotide Sau n chu kỳ, khuếch đại phân đoạn tuân theo quy luật sau: 1) có 1x sợi khuôn ban đầu (sợi kép –dna-), PCR không tái tạo sợi dài sợi khuôn, trừ trường hợp hai mồi nằm tận hai đầu sợi khuôn 2) Có n sợi đơn 24 | P a g e loại (-dna dna-) với độ dài không xác định, n số chu kỳ Những phân đoạn có độ dài không xác định có đầu giới hạn mồi PCR đầu không xác định 3) Có [2n – (n+1)] sợi đơn loại (dna xuôi ngược) có độ dài xác định hai mồi PCR 2.1.3 Chu trình nhiệt  Biến tính Thường biến tính 0.5-2 phút 94-95oC đủ, sản phẩm PCR tổng hợp chu kỳ khuếch đại thứ ngắn đáng kể so với khuôn DNA ban đầu biến tính hoàn toàn điều kiện Nếu DNA khuếch đại có hàm lượng GC cao, thời gian biến tính tăng lên 3-4 phút  Gắn mồi Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp 5oC so với nhiệt độ nóng chảy sợi kép mồi-khuôn DNA Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút đủ Tuy nhiên, sản phẩm PCR không đặc hiệu thu sản phẩm mong đợi, nhiệt độ bắt cặp phải tối ưu cách tăng bước 1-2oC  Kéo dài Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) thực 70-75oC Tốc độ tổng hợp DNA Taq DNA polymerase đạt cao nhiệt độ Thời gian tổng hợp phân đoạn PCR dài kb đề xuất phút Khi khuếch đại phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp tăng lên phút cho kb 2.1.4 Quy trình  Pha hỗn dịch Mix 25 | P a g e Để pha chế hỗn dịch mix, tính số lượng mẫu cần xét nghiệm tính toán lượng Mix cần thiết với thành phần tương ứng  Xử lý bệnh phẩm - Bước 1: • Dịch : Ly tâm lấy cặn ống Eppendorf, 12000 v/ phút x10 phút • Đờm : Khử nhiễm thể tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + thể tích Natri Citrat 0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC) (15mg/100ml), lắc cho đờm loãng 15 phút, ly tâm tách cặn dịch • Mảnh sinh thiết mủ: Ly giải Protease K qua đêm 560C - Bước 2: Xử lý bệnh phẩm có máu TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris-HCl pH 8.3, 1m EDTA): cho ml dung dịch TTE vào mẫu tách cặn, lắc kỹ cho tan máu, ly tâm loại bỏ nước - Bước 3: Bất hoạt 100OC 10 phút  Tách ADN vi khuẩn lao bệnh phẩm (Phương pháp BOOM) - Bước 1: Phá tế bào giải phóng ADN • Cho 0,9ml dung dịch ly giải tế bào L6 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH 8.0 2.6 ml Triton X 100) 20ml diatom 20% vào bệnh phẩm • Lắc kỹ máy lắc 10phút • Ly tâm, lấy cặn - Bước 2: Tinh ADN 26 | P a g e • Rửa lần dung dịch L2 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M TrisHCl pH 6.4) • Rửa lần Ethanol 70% • Rửa lần acetone • Phơi khô bể nước 56oC (10-15 phút ) - Bước 3: Thu hồi ADN • Cho 70ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) vào mẫu, ủ 56 C, 10 phút • Lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng / phút • Tách nước chứa ADN sử dụng để chạy PCR  Cho mẫu vào ống phản ứng PCR Dung dịch có chứa ADN sau tách từ bệnh phẩm cho vào ống phản ứng chứa sẵn 35 ul hỗn dịch mix Mỗi bệnh phẩm cần có hai ống phản ứng (ống a ống b) ống a sử dụng để chạy phản ứng với bệnh phẩm, ống b dùng để kiểm tra chất ức chế có bệnh phẩm ống b ADN tách từ bệnh phẩm cho thêm ADN M.smegmatis biễn đổi gắn thêm đoạn trình tự IS6110 Cặp mồi Pt18 INS2 có khả khuyếch đại trình tự 249 đôi bazỏ IS 6110 M tuberculosis, khuyếch đại trình tự 305 đôi bazơ IS6110của M smegmatis - ống a: 10ml d2 ADN tách từ bệnh phẩm - ống b: 5ml d2 ADN tách từ bệnh phẩm + 5ml d2 ADN M smegmatis 10-11g/ml - ống chứng dương : 10 ml ADN M tuberculosis 10-12g/ml (hay 10 femtogram ống phản ứng tương đương lượng ADN tách từ 2-3 vi khuẩn) 27 | P a g e - ống chứng âm : 10 ml d2 TE  Chương trình chạy PCR  Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% (2 gr agarose/100 ml đệm TBE pH 8,3 với 0,89M Tris, 0,89M axit boric 0,02 EDTA): 20ul/giếng, hiệu điện 110V, dòng điện 40 mA, từ 30 đến 45 phút Gel lấy nhuộm dung dịch ethidium bromide 0.2mg/ml (20 phút)  Chụp ảnh đọc kết - Soi gel đèn UV, chụp ảnh phim Polaroid - Phân tích kết quả: Bệnh phẩm có kết PCR dương tính ống phản ứng a b dương tính, ống thứ cho vạch đặc hiệu đoạn ADN có độ dài phân tử 249 đôi bazơ ống thứ hai cho vạch đặc hiệu ứng với phân tử có độ dài 305 đôi bazơ, PCR cho kết âm tính ống thứ âm tính (không có vạch) ống thứ hai dương tính, hai ống cho kết âm tính bệnh phẩm có chất ức chế phản ứng 2.2 Real-time PCR Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại phát qua phân tích điểm kết thúc, phương pháp điện di DNA gel agarose phản ứng kết thúc Ngược lại , real-time PCR cho phép phát định lượng tích lũy DNA khuếch đại phản ứng xảy Hiện có kiểu phản ứng sử dụng kĩ thuật real-time PCR với độ nhạy tương đương Cả phương pháp sử dụng chất nhộm huỳnh quang (fluorescent dye ), có kết hợp bước nhân phát sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thực Phản ứng real-time PCR thực nhờ bổ sung vào phản ứng 28 | P a g e phân tử huỳnh quang báo hiệu gia tăng lượng DNA tỷ lệ với gia tăng tín hiệu huỳnh quang Những hóa chất phát quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA trình tự gắn huỳnh quang liên kết với đoạn oligonucleotide gọi mẫu dò Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị phận phát huỳnh quang, sử dụng kiểm soát tín hiệu huỳnh quang trình khuếch đại xảy Tín hiệu huỳnh quang đo lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại chu kỳ Cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng DNA nên tăng gấp đôi theo cấp số nhân lượng DNA sau chu kỳ Cho đến cuối chu kỳ phản ứng kết thúc, tín hiệu huỳnh quang không tăng Nhìn chung phương pháp cho độ nhạy cao, chi phí cho việc phát bệnh đầu tư máy móc lớn nên không phổ biến chẩn đoán 2.3 Phương pháp ELISA Dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể , người ta sử dụng kháng nguyên vi khuẩn lao (MTP64) nhằm phát kháng thể lao có huyết dịch não tủy bệnh nhân Phương pháp có độ hạy độ đặc hiệu tương đối cao có khả xảy phản ứng chéo với Mycobacteria không điển hình Gồm phương pháp :  ELISA gián tiếp  Sandwich ELISA  ELISA cạnh tranh Trong phương pháp trên, phương pháp sandwich ELISA hay sử dụng chẩn đoán bệnh lao - Phương pháp: Người ta có kháng thể với MPT64 kết hợp công nghệ di truyền gây miễn dịch hệ thống tiến hóa 29 | P a g e dấu nối kết (ligands) cách làm giàu số mũ Một aptamer kháng thể lực cao với MPT64 chọn lựa từ thư viện DNA xoắn đơn ngẫu nhiên, phương pháp ELISA bánh kẹp dựa lên aptamer phát triển Phương pháp ELISA dùng để phát lao 328 mẫu huyết thanh, 160 mẫu từ bệnh nhân lao phổi (PTB) 168 mẫu kiểm soát không mắc lao - Kết quả: Giới hạn tối thiểu phát phương pháp ELISA 2,5 mg/L, phạm vi tuyến tính thay đổi từ 10 mg/L đến 800 mg/L Độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ suất xác xuất (+), tỷ suất xác xuất âm tính khu vực đường biểu diễn, với 95% CI tương ứng 64,4 % (56,7 % – 71,4 %); 99,4 % (96,7 % – 99,9 %); 108,2 (15,3 – 765,9); 0,350 (0,291 – 0,442) 0,819 (0,770 – 0,868) Không có khác biệt ý nghĩa độ nhạy quan sát mẫu đờm cá nhân dương tính (73/112, 65,2 %) âm tính (30/48, 62,5%) IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Bệnh lao ngày loại bệnh nhiễm khuẩn phổ biến giới nói chung Việt Nam nói riêng Chính việc chẩn đoán phát bệnh để đưa phương pháp điểu trị phù hợp cần thiết , tránh tình trạng lao kháng thuốc ngày tràn lan Kỹ thuật chẩn đoán phân tử với ưu điểm nó, ngày sử dụng rộng rãi chẩn đoán xét nghiệm bệnh lao Hy vọng tương lai không xa người ta ngăn chặn lây lan vi khuẩn lao 30 | P a g e Về mặt cá nhân, hy vọng xây dựng kit mẫu băng thử giúp phát nhanh bệnh lao với chi phí rẻ sử dụng gia đình 31 | P a g e TÀI LIỆU THAM KHẢO Lư Nhật Huy (2001), Tìm hiểu quy trình phát lao kháng thuốc kỹ thuật sinh học phân tử Ngô Thị Tú Trinh (2010), Sử dụng phương pháp PCR để phát Lao Bộ môn Lao trường đại học Y Hà Nội (2002), Bệnh lao học, NXB Y học Hà Nội Viện vệ sinh dịch tễ , Kỹ thuật PCR chẩn đoán lao Bệnh viện nhiệt đới trung ương, Đánh giá giá trị lâm sàng ELISA dựa lên kháng thể MPT64 aptamer chẩn đoán huyết bệnh lao phổi Midori Kato-Maeda, John Z Metcalfe Laura Flores , (2015), Genotyping of Mycobacterium tuberculosis: application in epidemiologic studies 32 | P a g e [...]... báu góp phần chẩn đoán lao phổi X-quang có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp trong chẩn đoán lao phổi Nhiều bệnh có hình ảnh X- quang phổi giống lao phổi, lao phổi ngược lại cũng có hình ảnh dễ nhầm lẫn với các bệnh phổi khác 20 | P a g e Mặt khác khó phân biệt tổn thương ở phổi do lao cũ đã ổn định hay lao mới đang tiến triển Vì thế X-quang không phải là yếu tố quyết định trong chẩn đoán lao phổi Ngày... ngừa bệnh lao được sử dụng ở những quốc gia có gánh nặng cao III CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN 1 Chẩn đoán thông thường 1.1 Chẩn đoán lâm sàng Tuy chẩn đoán lâm sàng không cho chính xác kết quả bênh nhân nhưng đây là bước rất quan trọng để đưa ra phán đoán và phương pháp chẩn đoán cụ thể Một số dấu hiệu lao lâm sàng:  Ho kéo dài trên 2 tuần (ho khan, ho có đờm, ho ra máu) là triệu chứng nghi lao quan trọng... (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Trong chẩn đoán phân tử, gen có ý nghĩa trong việc chẩn đoán là gen IS6110, đây là một đoạn gen ngắn có tính đặc trưng cho loài Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao trên người, mà không không có ở các loài khác Gen IS6110 phân bố rải rác nhiều nơi trong bộ gen Đây là đoạn gen có tính bảo tồn cao Các phương pháp PCR, real-time PCR phát hiện vi khuẩn lao đều dựa trên tín hiệu... Bệnh lao ngày nay vẫn còn là một loại bệnh nhiễm khuẩn phổ biến nhất trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Chính vì thế việc chẩn đoán phát hiện bệnh để đưa ra phương pháp điểu trị phù hợp là rất cần thiết , tránh tình trạng lao kháng thuốc ngày càng tràn lan Kỹ thuật chẩn đoán phân tử với những ưu điểm của nó, đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và xét nghiệm các bệnh lao. .. còn một số chẩn đoán thông thường khác để chẩn đoán bệnh lao như xét nghiệm máu, lấy dịch dạ dày… 2 Chẩn đoán phân tử 2.1 PCR 2.1.1 Định nghĩa Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các 23 | P a g e đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời... của phân tử kháng sinh 4 Cấu trúc phân tử (gene) và gene có ý nghĩa trong chẩn đoán Bộ gen của vi khuẩn lao đã được giải trình tự vào năm 1998, có chiều dài 4411522 bp trong đó có 3924 bp trình tự được dự đoán mã hóa cho protein, tỉ lệ G+C chiếm đến 65,6% Bộ gen của của vi khuẩn lao có tới 90,8% trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả 16 | P a g e Hình 3 : Cấu trúc gen một số chủng vi khuẩn lao (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)... e Nói chung phán ứng tuberculin có giá trị chẩn đoán nếu trước đó bệnh nhân đã làm phản ứng nhưng kết quả âm tính (giá trị chẩn đoán nằm trong tình trạng chuyển phản ứng) Ở những nơi có chỉ số nguy cơ nhiễm lao cao, bệnh lao phổ biến và trên các trẻ em đã được tiêm chủng BCG, phản ứng tuberculin chỉ có giá trị hạn chế khi dùng để chẩn đoán tình trạng nhiễm lao Có nhiều loại tuberculin nhưng quan trọng... 2 Ngô Thị Tú Trinh (2010), Sử dụng phương pháp PCR để phát hiện Lao 3 Bộ môn Lao trường đại học Y Hà Nội (2002), Bệnh lao học, NXB Y học Hà Nội 4 Viện vệ sinh dịch tễ , Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao 5 Bệnh viện nhiệt đới trung ương, Đánh giá giá trị lâm sàng của ELISA dựa lên kháng thể MPT64 aptamer đối với chẩn đoán huyết thanh bệnh lao phổi 6 Midori Kato-Maeda, John Z Metcalfe và Laura Flores ,... khuẩn lao (MTP64) nhằm phát hiện kháng thể lao có trong huyết thanh hoặc dịch não tủy của bệnh nhân Phương pháp này có độ hạy và độ đặc hiệu tương đối cao nhưng có khả năng xảy ra phản ứng chéo với Mycobacteria không điển hình Gồm 3 phương pháp chính :  ELISA gián tiếp  Sandwich ELISA  ELISA cạnh tranh Trong các phương pháp trên, phương pháp sandwich ELISA hay được sử dụng trong chẩn đoán bệnh lao. .. xơ hang, hạt kê, ít gặp ngoài phổi  Thường khu trú ở thuỳ trên và phân thuỳ 6 của thuỳ dưới 3.2.2.1 Lao tiên phát tiến thẳng sang lao hậu tiên phát Do sức đề kháng của cơ thể giảm, trực khuẩn lao tiếp tục sinh sản, lan tràn và phát triển thành lao hậu tiên phát ngay trong thời kỳ lao hậu tiên phát Cơ chế này hay gặp ở người đồng nhiễm lao / AIDS, do LymphoT CD4 giảm nhiều 3.2.2.2 Tái hoạt động nội tại ... III CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN Chẩn đoán thông thường 1.1 Chẩn đoán lâm sàng Tuy chẩn đoán lâm sàng không cho xác kết bênh nhân bước quan trọng để đưa phán đoán phương pháp chẩn đoán cụ thể Một số... 3.3 Lao kháng thuốc Cấu trúc phân tử (gene) gen có ý nghĩa chẩn đoán Vắc xin BCG công trình nghiên cứu III CHẨN ĐOÁN BỆNH Phương pháp chẩn đoán thông thường 1.1 Chẩn đoán lâm sàng 1.2 Xét nghiệm... sần tiêm sai kỹ thuật Kết đọc sau 48-72 Ngoài số chẩn đoán thông thường khác để chẩn đoán bệnh lao xét nghiệm máu, lấy dịch dày… Chẩn đoán phân tử 2.1 PCR 2.1.1 Định nghĩa Phương pháp PCR phương