2. Chẩn đoán phân tử 1 PCR
2.1.3. Chu trình nhiệt
Biến tính
Thường biến tính 0.5-2 phút ở 94-95oC là đủ, do sản phẩm PCR được tổng hợp ở chu kỳ khuếch đại thứ nhất ngắn hơn đáng kể so với khuôn DNA ban đầu và được biến tính hoàn toàn dưới các điều kiện này. Nếu DNA khuếch đại có hàm lượng GC rất cao, thời gian biến tính có thể được tăng lên 3-4 phút.
Gắn mồi
Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp hơn 5oC so với nhiệt độ nóng chảy của sợi kép mồi-khuôn DNA. Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút là đủ. Tuy nhiên, nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thu được ngoài sản phẩm mong đợi, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước 1-2oC.
Kéo dài
Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) được thực hiện ở 70-75oC. Tốc độ tổng hợp DNA bằng Taq DNA polymerase đạt cao nhất ở nhiệt độ này. Thời gian tổng hợp phân đoạn PCR dài 2 kb được đề xuất là 1 phút. Khi khuếch đại các phân đoạn PCR dài hơn, thời gian tổng hợp được tăng lên 1 phút cho mỗi kb.
2.1.4. Quy trình
Để pha chế hỗn dịch mix, tính số lượng mẫu cần xét nghiệm và tính toán lượng Mix cần thiết với các thành phần tương ứng.
Xử lý bệnh phẩm
- Bước 1:
• Dịch : Ly tâm lấy cặn trong ống Eppendorf, 12000 v/ phút x10 phút
• Đờm : Khử nhiễm bằng 1 thể tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + 1 thể tích Natri Citrat 0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC) (15mg/100ml), lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm tách cặn như đối với dịch
• Mảnh sinh thiết và mủ: Ly giải bằng Protease K qua đêm ở 560C
- Bước 2: Xử lý bệnh phẩm có máu bằng TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris-HCl pH 8.3, 1m EDTA): cho 1 ml dung dịch TTE vào mẫu đã tách cặn, lắc kỹ cho tan máu, ly tâm loại bỏ nước nổi.
- Bước 3: Bất hoạt 100OC trong 10 phút
Tách ADN của vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (Phương pháp BOOM)
- Bước 1: Phá tế bào giải phóng ADN
• Cho 0,9ml dung dịch ly giải tế bào L6 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH 8.0 và 2.6 ml Triton X 100) và 20ml diatom 20% vào mỗi bệnh phẩm
• Lắc kỹ bằng máy lắc trong ít nhất 10phút
• Ly tâm, lấy cặn - Bước 2: Tinh sạch ADN
• Rửa 2 lần bằng dung dịch L2 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris- HCl pH 6.4)
• Rửa 2 lần bằng Ethanol 70%
• Rửa 1 lần bằng acetone
• Phơi khô trong bể nước 56oC (10-15 phút ) - Bước 3: Thu hồi ADN
• Cho 70ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) vào mỗi mẫu, ủ 56 0 C, 10 phút
• Lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng / 2 phút
• Tách nước nổi chứa ADN và sử dụng để chạy PCR
Cho mẫu vào ống phản ứng PCR
Dung dịch có chứa ADN sau khi được tách từ bệnh phẩm được cho vào ống phản ứng đã chứa sẵn 35 ul hỗn dịch mix. Mỗi bệnh phẩm cần có hai ống phản ứng (ống a và ống b). ống a sử dụng để chạy phản ứng với bệnh phẩm, ống b dùng để kiểm tra chất ức chế nếu có trong bệnh phẩm. ống b ngoài ADN tách từ bệnh phẩm còn được cho thêm ADN của M.smegmatis đã được biễn đổi bằng gắn thêm một đoạn trình tự IS6110. Cặp mồi Pt18 và INS2 có khả năng khuyếch đại trình tự 249 đôi bazỏ trên IS 6110 của M. tuberculosis, và khuyếch đại cả trình tự 305 đôi bazơ trên IS6110của M. smegmatis.
- ống a: 10ml d2 ADN đã tách từ bệnh phẩm
- ống b: 5ml d2 ADN đã tách từ bệnh phẩm + 5ml d2 ADN M. smegmatis 10-11g/ml
- ống chứng dương : 10 ml ADN của M. tuberculosis 10-12g/ml (hay 10 femtogram trong một ống phản ứng tương đương lượng ADN tách từ 2-3 vi khuẩn)
- ống chứng âm : 10 ml d2 TE
Chương trình chạy PCR
Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% (2 gr agarose/100 ml đệm TBE pH 8,3 với 0,89M Tris, 0,89M axit boric và 0,02 EDTA): 20ul/giếng, ở hiệu điện thế 110V, dòng điện 40 mA, từ 30 đến 45 phút. Gel được lấy ra và nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 0.2mg/ml (20 phút)
Chụp ảnh và đọc kết quả
- Soi gel dưới đèn UV, chụp ảnh bằng phim Polaroid
- Phân tích kết quả: Bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính nếu cả 2 ống phản ứng a và b cùng dương tính, ống thứ nhất cho vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài phân tử là 249 đôi bazơ và ống thứ hai cho vạch đặc hiệu ứng với các phân tử có độ dài 305 đôi bazơ, PCR cho kết quả âm tính nếu ống thứ nhất âm tính (không có vạch) và ống thứ hai dương tính, nếu cả hai ống cùng cho kết quả âm tính thì bệnh phẩm có chất ức chế phản ứng