CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA SINH HỌC

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

Lớp: sinh học thực nghiệm

Khoá học: 2012 – 2014

MỞ ĐẦU

Chẩn đoán phân tử giúp phát hiện sự có mặt của virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng, protein và các phân tử nhỏ đặc biệt trong người, ĐV, TV, nước, đất

Có hai loại kỹ thuật chẩn đoán phân tử:

- Dựa trên tính đặc hiệu của một kháng thể đối với kháng nguyên

- Lai axit nucleic hoặc PCR → trình tự axit nucleic đặc hiệu

1 Các quy trình chẩn đoán miễn dịch

Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)

 Kháng thể đơn dòng

2 Các hệ thống chuẩn đoán DNA

- Mẫu dò lai

- Chẩn đoán bệnh sốt rét

- Phát hiện Trypanosoma cruzi

- Quy trình lai không phóng xạ

- Đèn hiệu phân tử

- Xác định dấu vân tay DNA

- Nhân bội ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình

- Thể cảm biến sinh học vi khuẩn

3 Chẩn đoán phân tử các bệnh di truyền

1 Các quy trình chuẩn đoán miễn dịch

Nhiều hệ thống phát hiện miễn dịch có độ nhạy, đặc hiệu, đơn giản.

Trước đây, các quy trình chẩn đoán dựa trên các đặc điểm của nhân tố gây bệnh.

→ Xác định phân tử chỉ thị bằng các thử nghiệm hóa sinh.

→ Phát hiện phân tử chỉ thị mà không phụ thuộc bản chất hoá học của nó, dựa trên việc phát hiện phức kháng nguyên - kháng thể.

Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) là một PP phổ biến dùng KT để xác định KN đích.

Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)

Nguyên lý:

Dùng kháng thể có đánh dấu enzyme để định lượng kháng nguyên trong phản ứng hấp phụ miễn dịch giữa kháng thể - kháng nguyên.

Quy trình ELISA tổng quát để phát hiện kháng nguyên đích.

- Kháng thể sơ cấp thường được tách ra từ thỏ đã được gây miễn dịch với kháng nguyên đích

Sơ đồ kháng nguyên đích

Kháng thể đa dòng

 Bề mặt kháng nguyên có các yếu tố quyết định kháng nguyên (epitop) khác nhau Khi kháng nguyên này được dùng để gây đáp ứng miễn dịch ở một loại động vật, mỗi yếu tố quyết định kháng nguyên gây tổng hợp một kháng thể khác nhau Tập hợp các kháng thể cùng phản ứng với một kháng nguyên cấu thành một kháng thể

đa dòng

 Kháng thể đơn dòng: Chỉ nhận biết một epitop trên một KN cho sẵn.

 Mục tiêu cơ bản khi dùng KT làm nhân tố chẩn đoán hoặc điều trị là tìm cách để tạo một dòng tế bào có thể nuôi cấy được và sản sinh ra các kháng thể đơn dòng có ái lực cao với KN đích đặc hiệu Dòng tế bào như vậy là nguồn cung cấp ổn định, liên tục các phân tử KT giống hệt nhau

2 Kháng thể đơn dòng

Sản xuất kháng thể đơn dòng

Nguyên lý:

+ Tế bào lympho B: là tế bào sản xuất ra kháng thể khi có đáp ứng miễn dịch, nhưng lại không có khả năng tái sinh trong nuôi cấy

+ Tế bào ung thư là những tế bào có khả năng phân chia vô hạn

+ Người ta cho rằng tế bào lai được tạo ra khi dung hợp tế bào ung thư (u tủy xương) với tế bào B, sẽ có thành phần

di truyền của tế bào B để sinh KT, và có chức năng phân chia của tế bào ung thư để phát triển trong môi trường nuôi cấy

Ý tưởng này được thực hiện vào những năm 1970

a Tạo và chọn lọc tế bào lai

Quy trình HAT chọn lọc tế bào u tuỷ - lá lách lai

Tế bào lách Tế bào u tuỷ

Dung hợp

Sinh trưởng trên môi trường HAT

Kiểm tra miễn dịch

b Xác định dòng tế bào

lai sinh kháng thể đặc

hiệu

3 Các hệ thống chuẩn đoán DNA

 Lai acid nucleic dựa trên cơ sở sự bắt cặp của các bazơ Đó là liên kết hiđro giữa chuỗi nucleotide này với chuỗi nucleotide bổ sung

 Quy trình tổng quát của lai acid nucleic:

+ Gắn DNA sợi đơn (đích) lên màng đỡ

+ Bổ sung các DNA sợi đơn đã được đánh dấu dưới các điều kiện thích hợp để thúc đẩy sợi đơn gắn với DNA đích

+ Rửa giá đỡ để loại mẫu dò thừa không gắn

+ Xác định trình tự lai tạo thành giữa mẫu dò và DNA đích

3.1 mẫu dò lai

Khái quát về sự phát triển và sử dụng mẫu dò lai

3.2 chuẩn đoán bệnh sốt rét

 Ký sinh trùng sốt rét: Plasmodium falciparum

 Chẩn đoán bệnh sốt rét bằng DNA: sự có mặt của KST sốt rét được phát triển bằng cách sử dụng DNA có độ lặp lại

cao (DNA có nhiều bản sao) của P falciparum.

 Đầu tiên, 1 thư viện DNA của KST này được sàng lọc với DNA của toàn bộ bộ gen của KST đó.

 Các khuẩn lạc lai đánh dấu mạnh nhất được chọn sẽ được kiểm tra khả năng lai với DNA các loài Plasmodium không sốt rét

 Đoạn DNA chọn làm mẫu dò đặc hiệu được lai với Plasmodium falciparum nhưng không lai với P vivax, P

cynomolgi hoặc DNA người.

3.3 Phát hiện Trypanosoma cruzi

 Trypanosoma cruzi là KST thuộc động vật nguyên sinh gây bệnh trùng mũi khoan

 Hiện nay, chẩn đoán bằng PCR được dùng bổ trợ cho các xét nghiệm truyền thống đang được sử dụng rộng rãi

+ Trình tự đích là đoạn DNA 188 bp có mặt trong nhiều bản sao của genome Trypanosoma cruzi nhưng lại

không có mặt trong genome của KST liên quan khác Mồi được thiết kế dựa trên trình tự đích này

+ Sau phản ứng PCR, sự có mặt của đoạn DNA 188 bp được phát hiện bằng điện di trên polyacrylamide gel

 Lai phóng xạ thường được dùng cho độ đặc hiệu cao Tuy nhiên P32 có thời gian tồn tại ngắn, nguy hiểm, quy trình lại đòi hỏi thiết bị an toàn cao

 Quy trình lai DNA không phóng xạ được phát triển để khắc phục các nhược điểm trên

 Ở quy trình lai không phóng xạ, tín hiệu lai được khuếch đại bằng chuyển hóa enzyme hợp chất có màu

hoặc hóa phát quang cơ chất khi cơ chất bị chuyển thành các sản phẩm đặc hiệu bởi enzyme thích hợp

3.4 Quy trình lai không phóng xạ

Phát hiện DNA đích bằng hoá phát quang

C Phosphatase kiềm đánh dấu biotin

liên kết với Streptavidine

D Phosphatase kiềm chuyển cơ chất

thành sản phẩm phát sáng

 Ưu điểm của quy trình lai không phóng xạ:

+ DNA đánh dấu biotin bền

+ Thiết bị phát hiện quang hóa học nhạy

+ Thời gian phát hiện mẫu dò chỉ trong vài giờ.

 Phương pháp hóa phát quang nhạy hơn nhiều so với nhuộm màu.

Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang gắn vào mồi để phát hiện sản phẩm được nhân bội bằng PCR Các mồi được ký hiệu P1, P2

Xét nghiệm dựa vào PCR

Xanh lam Xanh lục

Đỏ Đỏ

3.5 Đèn hiệu phân tử

Mẫu dò đèn hiệu phân tử với các chất phát huỳnh quang khác nhau

DNA đích

Đầu dò đèn hiệu phân tử

lai

Chất dập tắt Chất có màu phát huỳnh quang

Thể lai DNA đích – mẫu dò

Lai mẫu dò đèn hiệu phân tử với DNA đích

Dùng hai mẫu dò đèn hiệu phân tử khác nhau để phân biệt các kiểu gen khác nhau.

Kiểu dại đồng hợp tử Thể đột biến đồng hợp tử

Dị hợp tử

3.6 Xác định dấu vân tay DNA

Phân biệt các cá thể bằng sự khác nhau của các trình tự lặp lại Phổ DNA của các trình tự lặp lại

→ dấu vân tay DNA.

Ứng dụng: Xác định mối quan hệ huyết thống

Nhận dạng nạn nhân các thảm họa…

Nhận dạng tội phạm trong khoa học hình sự

Áo của

bị cáo

Máu của bị cáo Chuẩn kích thước DNA,

kb

Sơ đồ biểu diễn DNA tiểu vệ tinh người

3.8 Thể cảm biến sinh học vi khuẩn

 Vi khuẩn có khả năng phát quang sinh học là các ứng viên tốt nhất để phát hiện chất ô nhiễm (KLoại, các HCHC…)

 Khi có mặt chất ô nhiễm → sự phát quang sinh học của VK sẽ giảm → chỉ thị về sự có mặt của chất ô nhiễm

 VK phát quang sinh học dạng tự nhiên: Vibrio fischeri, sống trong đk mặn, pH xđ → không thể dùng cho thử

nghiệm nước ngầm

 Gen (luxCDABE) mã hóa cho enzyme→ phát quang sh có thể gắn vào vtrí bất kỳ trên DNA nst của VK đất (Pseudomonas fluorescens) (k ảnh hưởng) Gen này không chứa P phiên mã nên:

→ Chủng VK cải biến có khả năng phát quang (Bóng tối)

→ Chủng VK cải biến không có khả năng phát quang

→ Chọn các TB phát quang mạnh, tốc độ ↑ như chủng dạng tự nhiên

Xét nghiệm sự có mặt của chất ô nhiễm bằng

P fluorescens biến đổi gen

Phân tích DNA có thể dùng để phát hiện nguy cơ bị bệnh của bản thân hoặc của con cháu.

Trước đây, kiểm tra di truyền = các xét nghiệm hóa sinh dựa vào sự có hoặc không có mặt sản phẩm của 1gen

Hiện nay, kiểm tra dựa vào DNA không đòi hỏi sự biểu hiện của gen đột biến → sàng lọc mọi bệnh do đơn gen gây

4 Sàng lọc bệnh xơ nang

 Bệnh di truyền có thể là:

+ Hậu quả của một đột biến đơn DNA dạng tự nhiên như bệnh thiếu máu TB hình liềm…

+ Do một lượng lớn các biến đổi di truyền trong DNA bình thường của gen đó như bệnh xơ nang gây chết phổ biến người châu Âu (tần suất mang gen ~ 1/25)

 Bệnh xơ nang gây ra bởi > 500 đột biến gen điều hòa vận chuyển qua màng gây xơ nang (cystic fibrosis transmembrance conductance regulator – CFTR)

→ Xét nghiệm riêng biệt/loại đột biến

→ Sàng lọc các cá thể có thể mắc bệnh xơ nang với > 500 loại đb ≠ nhau là 1 công việc nặng nề Thực tế, có 4 đb phổ biến của gen CFTR, chiếm ~ 81% ∑ các đb làm tăng nguy cơ mắc bệnh xơ nang

 Hiện nay, người ta đang ↑ các phương pháp chẩn đoán có thể sàng lọc số lượng lớn các loại đb cho một gen đơn trong một xét nghiệm

4.2 Thiếu máu tế bào hình liềm

Hồng cầu bình thường hình đĩa (trái) di chuyển dễ dàng qua các mạch máu Hồng cầu hình liềm (phải) khó di chuyển qua các mạch máu, chúng cứng và có xu thế đóng cục lại, kẹt vào các mạch máu

Mồi Trình tự bình thường Mồi Trình tự gây thiếu máu tb hình liềm

Mồi Mồi

Trình tự bình thường được nhân bội

Trình tự gây thiếu máu tb hình liềm được nhân bội

Kích thước bp

Kiểu gen

Phát hiện gen thiếu máu tế bào hình liềm ở mức DNA

4.3 Quy trình PCR/OLA

Không phải mọi biến đổi di truyền đều tạo ra các gen khiếm khuyết ảnh hưởng đến sự tồn tại của vị trí nhận biết RE

→ Cần có PP để phát hiện các biến đổi đơn nucleotide

→ PCR/OLA (oligonucleotide ligation assay – OLA) là pp kết hợp PCR với việc gắn các oligonucleotide, tức là

PCR/OLA được thiết kế để phân biệt 2 khả năng: gắn nối hoặc không gắn nối 2 mẫu dò đưa vào

Tổng hợp một cặp các mẫu dò oligonucleotide

Lai các mâu dò với các DNA đã nhân bội bằng PCR

Ghép sai

Bổ sung ligase vào DNA lai

Liên kết streptavidin với DNA lai, rửa

Bổ sung tiếp hợp kháng thể kháng bigoxigenin – phosphataza kiềm, rửa, bổ sung cơ chất

Sơ đồ biểu diễn sự

hoạt động của mẫu dò

khoá

4.5 Xác định kiểu gen bằng các mồi PCR đánh dấu huỳnh quang

Mồi P1 và P2 nhân bội DNA tự nhiên (+) P1: đánh dấu bằng rhodamin

Mồi P3 và P2 nhân bội DNA đột biến (-) P3: đánh dấu bằng fluoresxein

Sau PCR và loại bỏ mồi không tương thích, kết quả:

+ Cá thể đồng hợp tử (DNA dạng dại) → hỗn hợp phản ứng phát huỳnh quang màu đỏ

+ Cá thể đồng hợp tử (DNA đột biến) → hỗn hợp phản ứng phát huỳnh quang màu xanh lá cây + Cá thể dị hợp tử → hỗn hợp phản ứng phát huỳnh quang màu vàng

Cảm ơn thầy

và các bạn lắng nghe