CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHOA SINH HỌC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ Lớp: sinh học thực nghiệm Khoá học: 2012 – 2014 MỞ ĐẦU Chẩn đoán phân tử giúp phát hiện sự có mặt của virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng, protein và các phân tử nhỏ đặc biệt trong người, ĐV, TV, nước, đất. Có hai loại kỹ thuật chẩn đoán phân tử: - Dựa trên tính đặc hiệu của một kháng thể đối với kháng nguyên. - Lai axit nucleic hoặc PCR → trình tự axit nucleic đặc hiệu. 1. Các quy trình chẩn đoán miễn dịch Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)  Kháng thể đơn dòng 2. Các hệ thống chuẩn đoán DNA - Mẫu dò lai - Chẩn đoán bệnh sốt rét - Phát hiện Trypanosoma cruzi - Quy trình lai không phóng xạ - Đèn hiệu phân tử - Xác định dấu vân tay DNA - Nhân bội ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình - Thể cảm biến sinh học vi khuẩn 3. Chẩn đoán phân tử các bệnh di truyền - Sàng lọc bệnh xơ nang - Thiếu máu tế bào hình liềm - Quy trình PCR/OLA - Mẫu dò khóa - Xác định kiểu gen bằng các mồi PCR đánh dấu huỳnh quang NỘI DUNG 1. Các quy trình chuẩn đoán miễn dịch Nhiều hệ thống phát hiện miễn dịch có độ nhạy, đặc hiệu, đơn giản. Trước đây, các quy trình chẩn đoán dựa trên các đặc điểm của nhân tố gây bệnh. → Xác định phân tử chỉ thị bằng các thử nghiệm hóa sinh. → Phát hiện phân tử chỉ thị mà không phụ thuộc bản chất hoá học của nó, dựa trên việc phát hiện phức kháng nguyên - kháng thể. Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) là một PP phổ biến dùng KT để xác định KN đích. Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) Nguyên lý: Dùng kháng thể có đánh dấu enzyme để định lượng kháng nguyên trong phản ứng hấp phụ miễn dịch giữa kháng thể - kháng nguyên. Quy trình ELISA tổng quát để phát hiện kháng nguyên đích. - Kháng thể sơ cấp thường được tách ra từ thỏ đã được gây miễn dịch với kháng nguyên đích. - Kháng thể thứ cấp được tách ra từ dê được gây miễn dịch với kháng thể của thỏ - Enzyme (E) được kết hợp với kháng thể thứ cấp Sơ đồ kháng nguyên đích Kháng thể đa dòng  Bề mặt kháng nguyên có các yếu tố quyết định kháng nguyên (epitop) khác nhau. Khi kháng nguyên này được dùng để gây đáp ứng miễn dịch ở một loại động vật, mỗi yếu tố quyết định kháng nguyên gây tổng hợp một kháng thể khác nhau. Tập hợp các kháng thể cùng phản ứng với một kháng nguyên cấu thành một kháng thể đa dòng.  Kháng thể đơn dòng: Chỉ nhận biết một epitop trên một KN cho sẵn.  Mục tiêu cơ bản khi dùng KT làm nhân tố chẩn đoán hoặc điều trị là tìm cách để tạo một dòng tế bào có thể nuôi cấy được và sản sinh ra các kháng thể đơn dòng có ái lực cao với KN đích đặc hiệu. Dòng tế bào như vậy là nguồn cung cấp ổn định, liên tục các phân tử KT giống hệt nhau. 2. Kháng thể đơn dòng Sản xuất kháng thể đơn dòng  Nguyên lý: + Tế bào lympho B: là tế bào sản xuất ra kháng thể khi có đáp ứng miễn dịch, nhưng lại không có khả năng tái sinh trong nuôi cấy. + Tế bào ung thư là những tế bào có khả năng phân chia vô hạn. + Người ta cho rằng tế bào lai được tạo ra khi dung hợp tế bào ung thư (u tủy xương) với tế bào B, sẽ có thành phần di truyền của tế bào B để sinh KT, và có chức năng phân chia của tế bào ung thư để phát triển trong môi trường nuôi cấy.  Ý tưởng này được thực hiện vào những năm 1970 [...]... Lai mẫu dò đèn hiệu phân tử với DNA đích Thể đột biến đồng hợp tử Kiểu dại đồng hợp tử Dị hợp tử Dùng hai mẫu dò đèn hiệu phân tử khác nhau để phân biệt các kiểu gen khác nhau 3.6 Xác định dấu vân tay DNA Phân biệt các cá thể bằng sự khác nhau của các trình tự lặp lại Phổ DNA của các trình tự lặp lại → dấu vân tay DNA Ứng dụng: Xác định mối quan hệ huyết thống Nhận dạng nạn nhân các thảm họa… Nhận... hiện mẫu dò chỉ trong vài giờ  Phương pháp hóa phát quang nhạy hơn nhiều so với nhuộm màu Xét nghiệm dựa vào PCR Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang gắn vào mồi để phát hiện sản phẩm được nhân bội bằng PCR Các mồi được ký hiệu P1, P2 3.5 Đèn hiệu phân tử Xanh lục Xanh lam Đỏ Đỏ Mẫu dò đèn hiệu phân tử với các chất phát huỳnh quang khác nhau DNA đích Đầu dò đèn hiệu phân tử lai Chất có màu phát huỳnh quang... conductance regulator – CFTR) → Xét nghiệm riêng biệt/loại đột biến → Sàng lọc các cá thể có thể mắc bệnh xơ nang với > 500 loại đb ≠ nhau là 1 công việc nặng nề Thực tế, có 4 đb phổ biến của gen CFTR, chiếm ~ 81% ∑ các đb làm tăng nguy cơ mắc bệnh xơ nang  Hiện nay, người ta đang ↑ các phương pháp chẩn đoán có thể sàng lọc số lượng lớn các loại đb cho một gen đơn trong một xét nghiệm 4.2 Thiếu máu tế bào... tối) → Chủng VK cải biến không có khả năng phát quang → Chọn các TB phát quang mạnh, tốc độ ↑ như chủng dạng tự nhiên Xét nghiệm sự có mặt của chất ô nhiễm bằng P fluorescens biến đổi gen 4 Chuẩn đoán phân tử các bệnh di truyền Phân tích DNA có thể dùng để phát hiện nguy cơ bị bệnh của bản thân hoặc của con cháu Trước đây, kiểm tra di truyền = các xét nghiệm hóa sinh dựa vào sự có hoặc không có mặt sản... tạo ra các gen khiếm khuyết ảnh hưởng đến sự tồn tại của vị trí nhận biết RE → Cần có PP để phát hiện các biến đổi đơn nucleotide → PCR/OLA (oligonucleotide ligation assay – OLA) là pp kết hợp PCR với việc gắn các oligonucleotide, tức là PCR/OLA được thiết kế để phân biệt 2 khả năng: gắn nối hoặc không gắn nối 2 mẫu dò đưa vào Tổng hợp một cặp các mẫu dò oligonucleotide Lai các mâu dò với các DNA... đoán bệnh sốt rét  Ký sinh trùng sốt rét: Plasmodium falciparum  Chẩn đoán bệnh sốt rét bằng DNA: sự có mặt của KST sốt rét được phát triển bằng cách sử dụng DNA có độ lặp lại cao (DNA có nhiều bản sao) của P falciparum  Đầu tiên, 1 thư viện DNA của KST này được sàng lọc với DNA của toàn bộ bộ gen của KST đó  Các khuẩn lạc lai đánh dấu mạnh nhất được chọn sẽ được kiểm tra khả năng lai với DNA các. .. dòng TB u tuỷ lai Kiểm tra miễn dịch Dương tính Âm tính 3 Các hệ thống chuẩn đoán DNA  Lai acid nucleic dựa trên cơ sở sự bắt cặp của các bazơ Đó là liên kết hiđro giữa chuỗi nucleotide này với chuỗi nucleotide bổ sung  Quy trình tổng quát của lai acid nucleic: + Gắn DNA sợi đơn (đích) lên màng đỡ + Bổ sung các DNA sợi đơn đã được đánh dấu dưới các điều kiện thích hợp để thúc đẩy sợi đơn gắn với DNA... Các đoạn DNA ĐD trên gel agarose Biến tính Màng lai Mẫu dò (1)* Ảnh tự chụp bằng phóng xạ Loại mẫu dò (1)* Màng được lai với mẫu dò (2)* Loại mẫu dò (2)* Ảnh tự chụp bằng phóng xạ : Thấm tách Southern của một mẫu DNA pháp y Sơ đồ biểu diễn DNA tiểu vệ tinh người 3.8 Thể cảm biến sinh học vi khuẩn  Vi khuẩn có khả năng phát quang sinh học là các ứng viên tốt nhất để phát hiện chất ô nhiễm (KLoại, các. .. để khắc phục các nhược điểm trên  Ở quy trình lai không phóng xạ, tín hiệu lai được khuếch đại bằng chuyển hóa enzyme hợp chất có màu hoặc hóa phát quang cơ chất khi cơ chất bị chuyển thành các sản phẩm đặc hiệu bởi enzyme thích hợp Phát hiện DNA đích bằng hoá phát quang biotin Mẫu dò A Mẫu dò gắn biotin được liên kết DNA đích với DNA đích streptavidin B Streptavidine được gắn vào phân tử biotin C... lớn các loại đb cho một gen đơn trong một xét nghiệm 4.2 Thiếu máu tế bào hình liềm Hồng cầu bình thường hình đĩa (trái) di chuyển dễ dàng qua các mạch máu Hồng cầu hình liềm (phải) khó di chuyển qua các mạch máu, chúng cứng và có xu thế đóng cục lại, kẹt vào các mạch máu Phát hiện gen thiếu máu tế bào hình liềm ở mức DNA Mồi Trình tự gây thiếu máu tb hình liềm Trình tự bình thường Mồi Mồi Mồi Trình . HỌC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ Lớp: sinh học thực nghiệm Khoá học: 2012 – 2014 MỞ ĐẦU Chẩn đoán phân tử giúp phát hiện sự có mặt của virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng, protein và các phân. lai không phóng xạ - Đèn hiệu phân tử - Xác định dấu vân tay DNA - Nhân bội ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình - Thể cảm biến sinh học vi khuẩn 3. Chẩn đoán phân tử các bệnh di truyền - Sàng lọc. nucleic đặc hiệu. 1. Các quy trình chẩn đoán miễn dịch Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)  Kháng thể đơn dòng 2. Các hệ thống chuẩn đoán DNA - Mẫu dò lai - Chẩn đoán bệnh sốt rét -