luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Huỳnh Hoàng Như Khánh Hà Nội – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Huỳnh Hoàng Như Khánh tham khảo thêm tài liệu cơng bố trước có nguồn gốc rõ ràng Kết nghiên cứu thực tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật biển có khả sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng dụng nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21 Các số liệu nêu luận văn kết làm việc suốt trình thực nghiệm Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Huỳnh Hoàng Như Khánh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình hồn thành luận văn, tơi xin chân thành cảm ơn TS Châu Minh Khánh - Phịng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang, người giúp tơi hồn thành tốt phần thực nghiệm mình, tơi xin chân thành cám ơn TS Huỳnh Hoàng Như Khánh – Chủ nhiệm đề tài VAST 02.05/20-21 cho phép sử dụng nội dung cơng trình nghiên cứu vào mục đích nghiên cứu, viết bảo vệ luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đào Tấn Học ThS Lê Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam hỗ trợ định danh mẫu tôm cá biển sử dụng làm nguồn phân lập vi sinh vật biển luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ, Phịng Đào tạo, Khoa Cơng nghệ Sinh học Quý Thầy Cô giáo dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi giúp thực luận văn hoàn thành thủ tục cần thiết Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang anh, chị phịng Cơng nghệ sinh học biển giúp đỡ tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến lãnh đạo trường THPT Nguyễn Chí Thanh, Sở Giáo dục Đạo tạo Khánh Hịa ln quan tâm, động viên giúp đỡ suốt trình học tập hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AHPND Bac+ BLIS GDP LPMA NTTS PCR PTN rRNA TCBS TSA TSB VK VKB VSV VSVCT Thông tin đầy đủ Acute HepatoPancreatic Necrosis Disease (Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính) Vi khuẩn biển biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp Bacteriocin-like inhitory subtance (Hợp chất có đặc điểm giống bacteriocin) Gross Domestic Product (Tổng sản phẩm quốc nội) Lab-Prepared Marine Agar (Môi trường thạch biển chuẩn bị phịng thí nghiệm) Nuôi trồng thủy sản Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen) Phịng thí nghiệm Ribosome Ribonucleic Acid Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar Tryptic Soy Agar Tryptic Soy Broth Vi khuẩn Vi khuẩn biển Vi sinh vật Vi sinh vật thị DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự khác vi khuẩn Gram dương Gram âm 10 Bảng 1.2 Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản 13 Bảng 1.3 Tác động kinh tế – xã hội tác động khác bệnh liên quan đến Vibrio ngành nuôi trồng thủy sản 15 Bảng 1.4 Một số bacteriocin vi khuẩn Gram âm 19 Bảng 1.5 Một số bacteriocin vi khuẩn Gram dương 20 Bảng 1.6 Một số khác biệt bacteriocin kháng sinh 22 Bảng 1.7 Độ bền nhiệt, pH enzyme thủy phân số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn lactic 24 Bảng 1.8 Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển 25 Bảng 2.1 Danh sách chủng thị sử dụng thí nghiệm sàng lọc hoạt tính 36 Bảng 3.1 Thông tin số lượng chủng VKB phân lập tương ứng với mẫu môi trường 46 Bảng 3.2 Kết sàng lọc chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp 47 Bảng 3.3 Tổng hợp hình thái khuẩn lạc 30 chủng biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp ghi nhận môi trường thạch Mueller Hinton 51 Bảng 3.4 Kết xác định phổ kháng khuẩn 30 chủng vi khuẩn biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp xác định phương pháp cấy dọc 54 Bảng 3.5 Tổng hợp khả kháng khuẩn 30 chủng vi khuẩn biển biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio spp xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch 57 Bảng 3.6 Hoạt tính đối kháng V parahaemolyticus 15 chủng vi khuẩn biển sau ủ với proteinase E 61 Bảng 3.7 Sự biến động mật độ tế bào hoạt tính đối kháng với vi sinh vật thị chủng Bacillus spp 2002NTBD1 theo thời gian 68 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản đánh bắt cá toàn cầu giai đoạn từ 1950 – 2017 11 Hình 1.2 Số lượng ấn phẩm khoa học 20 năm qua liên quan đến từ khóa “marine bacteria” “antimicrobial activity” phân phối theo mười quốc gia hàng đầu 17 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 21 Hình 2.1 Quy trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển rong 39 Hình 2.2 Hình ảnh số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển 40 Hình 2.3 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 44 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn biển làm 45 Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng VKB chủng Vibrio spp xác định phương pháp cấy dọc 50 Hình 3.3 Hình thái số đại diện bac+ môi trường Mueller Hinton agar 53 Hình 3.4 Phổ kháng khuẩn VKB chủng VSVCT xác định phương pháp cấy dọc 56 Hình 3.5 Khả sinh chất kháng khuẩn canh trường phương pháp khuếch tán đĩa thạch 59 Hình 3.6 Ảnh hưởng enzyme lên hoạt tính kháng Vibrio spp dịch lên men chủng 2002NTBD1 62 Hình 3.7 Cây phân loại thể mối liên quan chủng có hoạt tính mạnh lồi có trình tự gen 16S rRNA tương đồng 63 Hình 3.8 Khảo sát độ bền nhiệt hợp chất kháng Vibrio spp sinh chủng vi khuẩn biển 67 Hình 3.9 Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật thị dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp 2002NTBD1 thời điểm sinh trưởng khác 69 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn 1.1.2 Tác động vi khuẩn 10 1.1.3 Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản 11 1.1.4 Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học 16 1.2 TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 17 1.2.1 Định nghĩa bacteriocin 17 1.2.2 Phân loại bacteriocin 18 1.2.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 20 1.2.4 Điểm khác biệt kháng sinh bacteriocin 22 1.2.5 Đặc tính bacteriocin 23 1.2.6 Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển 25 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN 27 1.3.1 Các nghiên cứu giới 27 1.3.2 Các nghiên cứu nước 29 1.4 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN 30 1.4.1 Ứng dụng bacteriocin bảo quản thực phẩm 30 1.4.2 Ứng dụng bacteriocin bảo vệ sức khỏe người động vật cạn 31 1.4.3 Ứng dụng bacteriocin nuôi trồng thủy sản 31 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 33 2.2 NGUYÊN LIỆU 33 2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 33 2.2.2 Môi trường nuôi cấy 33 2.2.3 Chủng vi sinh vật thị 36 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.3.1 Phương pháp thu mẫu phân lập vi khuẩn biển 37 2.3.2 Phương pháp khảo sát khả đối kháng với Vibrio spp chủng vi khuẩn biển phân lập 40 2.3.3 Xác định phổ kháng khuẩn chủng vi khuẩn biển tuyển chọn 41 2.3.4 Xác định khả sinh chất kháng khuẩn môi trường lỏng 41 2.3.5 Xác định chất hợp chất kháng khuẩn 42 2.3.6 Phân tích trình tự nucleotide gen mã hóa 16S rRNA 42 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính hợp chất kháng khuẩn 43 2.3.8 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh chất kháng khuẩn vi khuẩn biển 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN 45 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO SPP 47 3.3 PHỔ KHÁNG KHUẨN VI KHUẨN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH DINH DƯỠNG 53 3.4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG DỊCH MÔI TRƯỜNG LỎNG 57 3.5 XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT CỦA HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN 60 3.6 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN MÃ HÓA 16S RRNA 63 3.7 ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA CÁC HỢP CHẤT KHÁNG VIBRIO SPP 66 3.8 ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN BIỂN 67 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 KẾT LUẬN 70 4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC ATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGNTCT GTAACTGACGCTGACNAGCTAAAGCTGGTGGACGAACAGGATTGGATACN CTGTTAGTCCACGCCGTACAGCATGAGTGCTGCGTGTTATGGG-3’ CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Châu Minh Khánh, Phan Thị Hồi Trinh, Ngơ Thị Duy Ngọc, Đinh Thành Trung, Lê Thị Hoa, Lê Trọng Bằng, Huỳnh Hoàng Như Khánh, 2020, Phân lập tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp., Tạp chí Khoa học Cơng ngh Bin, 20(4B), tr 333344 viện hàn lâm khoa học công nghệ việt nam vietnam academy of science and technology issn 1859-3097 Tạp chí khoa học công nghƯ biĨn vietnam journal of marine science and technology Số đặc biệt trình bày báo cáo khoa học Hội nghị khoa học 45 năm thành lập Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Tiểu ban Khoa học Công nghệ biển Special issue introducing scientific papers of the scientific conference for 45th anniversary establishment of VAST, Subcommittee of Marine Science and Technology 4B (T.20) 2020 hµ néi Vietnam Journal of Marine Science and Technology; Vol 20, No 4B; 2020: 333–344 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/15957 http://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst Isolation and screening of the marine-associated bacteria possessing the capacity to produce bacteriocins that exhibit antimicrobial efficacy toward Vibrio sp Chau Minh Khanh1, Phan Thi Hoai Trinh1, Ngo Thi Duy Ngoc1, Dinh Thanh Trung1, Le Thi Hoa1, Le Trong Bang2, Huynh Hoang Nhu Khanh1,* Nha Trang Institute of Technology Research and Application, VAST, Vietnam Graduate University of Science and Technology, VAST, Vietnam * E-mail: hhnkhanh@gmail.com Received: September 2020; Accepted: 26 November 2020 ©2020 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Abstract Bacteriocins - a group of ribosomally-synthesized antimicrobial peptides have been well studied for broad application in the food industry and pharmaceuticals However, little is known about the marine-derived bacteriocins, particularly the bacteriocins with inhibitory capacity against the Vibrio sp (called vibriocins) The study’s overall aims were to evaluate the proportion of active marine bacteria against Vibrio sp in the Vietnam sea and select promising strains for further application In this study, marine bacteria were isolated from different marine samples on tryptic soya agar (TSA) and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS) Screening of bacteria that exhibit the antimicrobial activity against different Vibrio sp was conducted using cross streak method and well diffusion assay Bacterial identification was also carried out based on the 16S rRNA sequences The result showed that a total of 152 bacteria were isolated from 19 marine samples, including 04 fish guts, 02 shrimp guts, 01 seaweed samples, and 12 different marine sponges Among the isolates, thirty bacteria (19.7%) exhibited the antimicrobial activity against Vibrio sp., with a high proportion in gut samples The majority of antimicrobials produced by the marine strains were sensitive to proteolytic digestion, possibly indicating bacteriocin production Analysis of the 16S rRNA of five strong isolates (2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1, 2002NTR06) revealed that they all belong to Bacillus species Collectively, the Vietnam sea region contained a diversity of strains with the capability to depress the growth of pathogenic Vibrio sp They are suitable for further use to promote sustainable aquaculture in Vietnam Keywords: Marine bacteria, bacteriocins, Vibrio sp., marine sponge, fish gut, shrimp gut Citation: Chau Minh Khanh, Phan Thi Hoai Trinh, Ngo Thi Duy Ngoc, Dinh Thanh Trung, Le Thi Hoa, Le Trong Bang, Huynh Hoang Nhu Khanh, 2020 Isolation and screening of the marine-associated bacteria possessing the capacity to produce bacteriocins that exhibit antimicrobial efficacy toward Vibrio sp Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 20(4B), 333–344 333 Tạp chí Khoa học Công nghệ Biển, Tập 20, Số 4B; 2020: 333–344 DOI: https://doi.org/10.15625/1859-3097/15957 http://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst Phân lập tuyển chọn vi khuẩn biển sinh bacteriocin có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp Châu Minh Khánh1, Phan Thị Hoài Trinh1, Ngô Thị Duy Ngọc1, Đinh Thành Trung1, Lê Thị Hoa1, Lê Trọng Bằng2, Huỳnh Hoàng Như Khánh1,* Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện HLKH&CN Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Viện HLKH&CN Việt Nam * E-mail: hhnkhanh@gmail.com Nhận bài: 3-9-2020; Chấp nhận đăng: 26-11-2020 Tóm tắt Bacteriocin- nhóm peptide biểu hoạt tính kháng khuẩn- nghiên cứu ứng dụng rộng rãi thực phẩm, y dược Tuy nhiên, nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn biển cịn hạn chế, đặc biệt nhóm bacteriocin ức chế sinh trưởng vi khuẩn Vibrio sp (được gọi tắt vibriocin) Nghiên cứu thực nhằm phân lập, đánh giá tiềm tuyển chọn chủng vi khuẩn biển có khả sinh vibriocin Vi khuẩn biển phân lập từ nhiều nguồn mẫu khác có nguồn gốc từ biển bao gồm 04 mẫu ruột cá, 02 mẫu tôm 01 mẫu rong biển thu thập vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) 12 mẫu bọt biển thu vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) Các chủng biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp sàng lọc phương pháp cấy dọc khuếch tán đĩa thạch, sử dụng vi khuẩn Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae làm vi khuẩn thị Kết nghiên cứu phân lập thu nhận 152 chủng vi khuẩn biển; có 30 chủng (chiếm 19,7%) có biểu hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn Vibrio sp Các chủng có khả ức chế mạnh với chủng Vibrio sp canh trường môi trường rắn tuyển chọn cho nghiên cứu tiếp theo, bao gồm chủng 2002STB23.3, 2002STB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1, 2002NTR06 Kết phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy 05 chủng vi khuẩn biển nêu thuộc chi Bacillus với đa dạng loài Đây nguồn vi khuẩn quan trọng để phát triển sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng ni trồng thủy sản, góp phần phát triển ngành thủy sản bền vững Việt Nam Từ khóa: Vi khuẩn biển; Bacteriocin, Vibrio sp; Bọt biển; Ruột tơm; Ruột cá GIỚI THIỆU Bacteriocin nhóm peptide (đa số nhỏ 10 kDa) có nguồn gốc từ vi khuẩn biểu hoạt tính kháng khuẩn Phổ kháng khuẩn bacteriocin thường hẹp, tiêu diệt vi khuẩn có quan hệ di truyền gần với lồi sinh bacteriocin [1] Gần đây, bacteriocin có nguồn gốc từ vi khuẩn biển xác định sở hữu phổ kháng khuẩn rộng, tiêu diệt nhóm vi khuẩn gây bệnh Gram âm Gram dương [2, 3] Do cấu trúc phân tử thường tích điện 334 dương, mang phần kỵ nước ưu nước, bacteriocin tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu cách bám chuyên biệt lên màng tế bào thông qua liên kết với thụ thể điện tích âm màng, khởi q trình biến đổi cấu trúc màng gây tính tồn vẹn cấu trúc màng, cuối gây chết tế bào mục tiêu [4] So với chất kháng sinh phổ rộng nay, bacteriocin có tác động chọn lọc vi khuẩn mục tiêu tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh kháng với bacteriocin thấp Do đó, liều lượng ức chế tối thiểu Isolation and screening of the marine-associated bacteriocin vi khuẩn mục tiêu thường thấp, mức nồng độ nanogram thay microgram loại kháng sinh thơng thường Ngồi ra, bacteriocin tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu không gây ảnh hưởng đến hệ vi khuẩn có lợi kháng sinh thơng thường Phân tử bacteriocin đa dạng cấu trúc, phổ diệt khuẩn, độ bền nhiệt trọng lượng phân tử Bacteriocin sinh vi khuẩn Gram âm (như E coli, Pseudomonas sp, Vibrio sp.) [5-7] vi khuẩn Gram dương Tuy nhiên, bacteriocin tìm thấy phổ biến nhóm vi khuẩn sinh lactic Bacillales (thuộc vi khuẩn Gram dương) [8, 9] Bacteriocin từ lâu nghiên cứu ứng dụng thực phẩm chất bảo quản thực phẩm an toàn sử dụng nhóm kháng sinh phổ hẹp dược phẩm, đặc biệt điều trị nhiễm khuẩn kháng thuốc [10] Tuy nhiên, bacteriocin chưa ứng dụng nhiều nuôi trồng thủy sản Sự hạn chế ứng dụng bacteriocin ni trồng thủy sản có lẽ hầu hết bacteriocin sử dụng thu từ vi khuẩn cạn, khơng có hoạt tính hoạt tính kháng khuẩn yếu vi khuẩn đặc trưng biển V parahaemolyticus, V cholerae, V vulnificus Aeromonas sp (đây nhóm vi khuẩn gây bệnh nghiêm trọng phổ biến nhuyễn thể, cá tôm nuôi trồng thủy sản) [11] Gần đây, số công bố Thế giới việc thu nhận bacteriocin, đặc biệt vibriocin từ vi khuẩn biển khẳng định khả khai thác ứng dụng nhóm vi sinh vật [3, 12] Bên cạnh đó, biện pháp phịng ngừa kiểm sốt Vibrio sp hữu hiệu, thân thiện với môi trường cần thiết để phát triển ngành nuôi trồng thủy hải sản bền vững Việc sử dụng vi khuẩn biển có lợi đối kháng với vi khuẩn biển gây bệnh ni trồng thủy sản xem phương thức hiệu vi khuẩn biển đảm bảo sinh trưởng tốt môi trường ao nuôi, chất kháng khuẩn tiết từ vi khuẩn biển ổn định điều kiện nuôi trồng so với chất có nguồn gốc từ vi khuẩn cạn Và vậy, vài vi khuẩn biển sinh vibriocin bắt đầu sử dụng nuôi trồng thủy sản Gibson cộng (2018) sử dụng chủng Aeromonas sp A19 ni hàu Crassostrea gigas nhằm kiểm sốt vi khuẩn Vibrio tubiashii gây bệnh hàu chủng Alteromonas macleodii 0444 sử dụng để kiểm soát vi khuẩn V coralliilyticus, Vibrio pectenicida [13] Trong đó, Việt Nam số nghiên cứu công bố kết phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật biển đánh giá sơ hiệu diệt Vibrio ao nuôi tôm [14, 15] Nguyễn Văn Duy cộng (2013) nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa ni trồng thủy sản Nhóm nghiên cứu tuyển chọn sưu tập 30 chủng sinh bacteriocin thuộc nhiều chi vi khuẩn khác Bacillus, Enterococcus, Proteus, Cronobacter, Enterobacter, Klebsiella [16] Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập đánh giá tỷ lệ chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng với Vibrio sp thu từ mẫu biển thuộc vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) Việc nghiên cứu phân lập vi khuẩn có khả sinh vibriocin sử dụng làm nguyên liệu phát triển sản phẩm probiotic ứng dụng cho ngành ni trồng thủy sản có ý nghĩa khoa học mang tính ứng dụng cao, đặt sở cho phát triển ngành thủy sản bền vững mang lại nhiều giá trị kinh tế VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu phương pháp phân lập vi khuẩn biển Nguyên liệu: Các mẫu bọt biển thu vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) độ sâu từ 3-5m; mẫu tôm, cá biển mẫu rong thu cảng Nha Trang (Khánh Hòa) vào tháng 02/2020 Các mẫu bảo quản lạnh, vận chuyển Phịng thí nghiệm tiến hành phân lập vi khuẩn Tất mẫu rửa 03 lần nước biển vô trùng sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển, riêng mẫu tôm cá: dùng dao mổ vô trùng rạch phần bụng cá phần sóng lưng tơm để thu nhận ruột cho vào ống nghiệm sử dụng làm nguồn phân lập vi khuẩn biển Phương pháp phân lập: Vi khuẩn biển (VKB) phân lập từ mẫu theo phương pháp pha loãng bậc 10 Cứ 5g bọt biển 5g rong cho vào cối tiệt trùng chứa 45mL nước 335 Chau Minh Khanh et al muối sinh lý (NaCl 0,85%) nghiền mẫu mẫu trở thành dạng dịch huyền phù Đối với mẫu ruột tôm cá, 1g mẫu ruột cho vào mL nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), lắc 150 vòng/phút 15 phút Đặt mẫu yên tĩnh cối ống nghiệm 10 phút, hút mL dịch huyền phù cho vào mL nước muối sinh lý, vortex để trộn mẫu tiếp tục thực pha lỗng đến 103 lần Hút 100 µl dịch nồng độ pha lỗng vào mơi trường Tryptic soya agar (TSA) Thiosulfatecitrate bile-sucrose agar (TCBS) trước bổ sung 50% nước biển tự nhiên, ủ nhiệt độ 30oC ba ngày Khuẩn lạc quan sát thu nhận ngày, làm giữ -80oC Hình Hình ảnh số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển 02 mẫu tôm biển 04 mẫu cá, bao gồm: (A) Tơm Tít Harpiosquilla sp., (B) Tơm He Penaeus latisulcatus, (C) Cá Bò da Aluterus sp., (D) Cá Trác Priacanthus sp., (E) Cá Lượng Nhật Bản Nemipterus japonicus (Bloch, 1791), (F) Cá Lạc Congresox sp (J) Rong nâu Sargassum sp thu nhận vùng biển Nha Trang (Khánh Hòa) (G, H, I) hình ảnh đại diện 03 mẫu bọt biển (trong tổng số 12 mẫu bọt biển) thu nhận vùng biển Phú Quý (Bình Thuận) Các mẫu bọt biển q trình định danh đến lồi 336 Isolation and screening of the marine-associated Sàng lọc chủng biểu hoạt tính đối kháng Vibrio sp Chủng biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp phát từ tổng số chủng phân lập phương pháp cấy dọc [17] Theo đó, sinh khối VKB cấy đường dọc đĩa thạch LPMA (2,5 g/L cao nấm men, 5,0 g/L peptone, 1,0 g/L glucose, 0,2 g/L K2HPO4, 0,05g/L MgSO4.7H2O, 500 mL/L nước biển tự nhiên, 500 mL/L nước cất, pH 7,5), ủ 30oC qua đêm để VKB hình thành sinh khối Ba vi khuẩn thị Vibrio sp (bao gồm Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae) cấy ngang từ mép đĩa chạm vào sinh khối vi khuẩn biển Đĩa ủ 37°C qua đêm cho chủng vi khuẩn thị hình thành sinh khối Vi khuẩn biển cho có khả ức chế Vibrio sp hình thành đoạn vô khuẩn sinh khối vi khuẩn biển vi khuẩn thị Xác định phổ kháng khuẩn vi khuẩn kháng Vibrio sp môi trường thạch rắn Các VKB biểu đối kháng với Vibrio sp xác định bước sử dụng để xác định phổ kháng khuẩn phương pháp cấy dọc [17] Thí nghiệm sử dụng chủng vi sinh vật thị (VSVCT) bao gồm vi khuẩn Gram âm (Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli), vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) vi nấm (Candida albicans) Khả sinh chất kháng Vibrio sp môi trường nuôi cấy lỏng Khả sinh chất kháng khuẩn VKB canh trường xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch [18] Theo đó, khuẩn lạc đơn vi khuẩn cấy vào mL mơi trường lỏng LPMA, lắc tốc độ 200 vịng/phút nhiệt độ 30oC vịng 24 Dịch mơi trường ly tâm loại bỏ sinh khối vi khuẩn, lọc qua màng polyether sulfones (PES) 0,45µm để thu nhận phần dịch không chứa tế bào vi khuẩn Phần dịch thu nhận để xác định hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch Theo đó, đĩa mơi trường Muller Hilton qt với 0.5McFarland dịch huyền phù sinh khối vi khuẩn thị (0,85% NaCl), đĩa đục lỗ thành giếng có kích thước 6mm Khoảng 80µL dịch cho vào giếng đục sẵn đĩa thạch Muller Hilton Sử dụng 04 07 vi khuẩn thị trên, bao gồm Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus Candida albicans Vi khuẩn cho có khả sinh chất kháng khuẩn môi trường nuôi cấy lỏng vịng vơ khuẩn xuất quanh giếng tương ứng với dịch vi khuẩn Xác định chất hợp chất kháng khuẩn Phần dịch biểu hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus sử dụng đại diện xác định chất chất kháng khuẩn diện Khoảng 200µL dịch ủ với pronase E (Sigma Aldrich) nồng độ cuối mg/ mL 37oC 60 phút Khoảng 80 µL dịch ủ enzyme dịch không ủ enzyme làm đối chứng cho vào hai giếng (D=6mm) phương pháp khuếch tán đĩa thạch Chất kháng khuẩn phần dịch xem có chất protein bacteriocin hoạt tính tiêu diệt Vibrio bị sau trình xử lý enzyme Phân tích trình tự nucleotide gen mã hóa 16S rRNA DNA tổng số vi khuẩn biển tách chiết theo phương pháp bead beating [19] Đoạn gen 16S rRNA khuếch đại PCR từ DNA tổng số, sử dụng với cặp mồi 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTAG 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT Thành phần hỗn hợp cho PCR bao gồm 25 µl đệm mastermix PCR, µl mồi xuôi, µl mồi ngược, 1-2 µl DNA khn bổ sung H2O đến thể tích tổng 50 µl Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1%, tinh sạch, giải trình tự phương pháp Sanger Sản phẩm đoạn gen 16S rRNA so sánh với trình tự Ngân hàng Gen quốc tế chương trình BLAST [20] Cây phân loại xây dựng sử dụng phần mềm MEGAX phiên 10.1.8 với phương pháp Neighbor Joining sử dụng bootstrap 1000 [21] Phương pháp xử lý thống kê Phương pháp kiểm t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances sử dụng để đánh giá sai khác có ý nghĩa tỷ lệ phân 337 Chau Minh Khanh et al lập vi khuẩn đối kháng với Vibrio sp từ nguồn mẫu biển khác Dữ liệu xử lý Microsoft Excel với 5% độ sai khác có ý nghĩa KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập vi khuẩn biển Quá trình thu mẫu thu nhận 19 mẫu biển phục vụ cho phân lập VKB bao gồm 02 mẫu ruột tôm, 04 mẫu ruột cá, 01 mẫu rong biển 12 mẫu bọt biển Hình ảnh tên mẫu mô tả chi tiết Hình Dựa màu sắc, kích thước hình thái bề mặt khuẩn lạc VKB, thí nghiệm phân lập thu nhận 152 chủng VKB bao gồm 128 chủng môi trường TSA 24 chủng môi trường TCBS Hình thái khuẩn lạc số đại diện vi khuẩn biển hiển thị Hình với đa dạng màu sắc, kích thước VKB mọc môi trường TCBS phân lập mẫu ruột (cá, tôm biển) nồng độ không pha loãng pha loãng 10 lần VKB thu nhận TSA thường phân lập độ pha loãng 100 lần 1000 lần Hình Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn biển làm (A) đĩa môi trường TCBS phân lập cho chủng Vibrio, (B) Đĩa môi trường TSA phân lập vi khuẩn khác Các hình xung quanh mơ tả hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn thu nhận môi trường Các vi khuẩn biển có khuẩn lạc đa dạng hình thái, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Bảng Thông tin số lượng chủng VKB phân lập từ mẫu biển số lượng VKB biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp tương ứng với mẫu môi trường phân lập Các nội dung thông tin Địa điểm thu mẫu Số lượng mẫu thu nhận cho phân lập VKB Số chủng VKB thu nhận môi trường TSA Số chủng VKB thu nhận môi trường TCBS Tổng số chủng VKB thu nhận hai môi trường Số bac+ phân lập môi trường TSA Số bac+ phân lập môi trường TCBS Tổng số bac+phân lập trên môi trường Tỷ lệ số bac+ so với tổng VKB phân lập Bọt biển Biển Phú Quý 12 65 65 9 13,8% Ghi chú: bac+: chủng VKB biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp 338 Ruột tôm Ruột cá Rong Biển Nha Trang 18 35 10 17 25 52 10 10 10 13 28,0% 25,0% 10,0% Isolation and screening of the marine-associated Tuyển chọn chủng biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp Hình Phương pháp cấy dọc nhằm xác định hoạt tính đối kháng VKB vi sinh vật thị Hình A B: Thí nghiệm sàng lọc sơ chủng có biểu đối kháng với Vibrio sp., sử dụng VSVCT gồm (1) V harveyi, (2) V parahaemolyticus, (3) V cholerae Hình C D: Thí nghiệm xác định phổ kháng khuẩn VKB biểu kháng Vibrio sp., sử dụng VSVCT bao gồm (1) S aureus, (2) B cereus, (3) C albicans, (4) sinh khối VKB làm chứng âm, (5) V harveyi, (6) V parahaemolyticus, (7)V cholerae (8) E coli Trong đó, hình C hiển thị chủng biểu tính đối kháng mạnh với VSVCT; hình D biểu thị chủng khơng biểu tính đối kháng với VSVCT VKB biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp (gọi tắt bac+) xác định phương pháp cấy dọc sử dụng 03 vi khuẩn thị chủng Vibrio sp khác Quá trình sàng lọc thu nhận 30 chủng bac+ từ tổng 152 chủng VKB phân lập hai môi trường, chiếm tỷ lệ 19,7% Số lượng chủng VKB số lượng chủng bac+ tương ứng với nguồn mẫu đề cập chi tiết Bảng Theo đó, tổng số 128 VKB phân lập mơi trường TSA có 27 chủng xác định biểu hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Vibrio sp., chiếm tỷ lệ 21,09 % Trong đó, tổng số 24 VKB phân lập mơi trường TCBS có 03 chủng biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp., chiếm tỷ lệ 8,5% Xét tổng VKB thu nhận từ hai môi trường, tỷ lệ phân lập chủng bac+ phát theo thứ tự sau: ruột tôm (28,0%) > ruột cá (25,0%) > bọt biển (13,8%) > rong (10,0%) (bảng 1) Kết phân tích thống kê cho thấy chênh lệch tỷ lệ phân lập bac+ "mẫu ruột tơm mẫu ruột cá” khơng có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, sai khác “mẫu ruột tôm bọt biển”, “mẫu ruột cá bọt biển” có ý nghĩa thống kê mức độ tin cậy 95% Điều chứng tỏ ruột tôm cá biển hai nguồn phân lập quan trọng để thu nhận tỷ lệ cao chủng VKB biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio sp Kết tương đồng với số nghiên cứu giới Chẳng hạn Sugita cộng phân lập nhiều VKB đối kháng với Vibrio sp từ 07 loài cá sống vùng biển Nhật Bản [22] Nhóm tác giả ghi nhận hoạt tính đối kháng Vibrio sp VKB phân lập từ ruột cá bơn lưỡi ngựa [23] Ngoài nguồn ruột cá, vi khuẩn bac+ phân lập bọt biển, trầm tích, mẫu đất thu rừng ngập mặn, nhiên tỷ lệ phân lập khơng đa dạng loài [2, 6] Phổ kháng khuẩn vi khuẩn môi trường thạch dinh dưỡng Phổ kháng khuẩn 30 bac+ thu nhận thí nghiệm xác định phương pháp cấy dọc Thí nghiệm sử dụng chủng VSVCT bao gồm vi khuẩn Gram âm (3 Vibrio sp., E coli), vi khuẩn Gram dương (S aureus, B cereus) vi nấm (C albicans) Kết cho thấy, bac+ thu nhận môi trường TSA sở hữu phổ kháng khuẩn rộng mạnh bac+ phân lập mơi trường TCBS (Hình 3) Trong tổng 27 chủng bac+ thu nhận môi trường TSA, tỷ lệ chủng biểu tính đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus cao (chiếm 96,29%, 26/27 chủng), theo sau B cereus (chiếm tỷ lệ 92,6%, 25/27 chủng), Vibrio harveyi (chiếm tỷ lệ 88,89%, 24/27 chủng) Vibrio cholerae (chiếm tỷ lệ 88,89%, 24/27 chủng) Trong đó, tỷ lệ chủng ức chế S 339 Chau Minh Khanh et al aureus C albicans hơn, chiếm 62,9% (17/27 chủng), 44,44% (12/27 chủng) Kết cho thấy, chủng vi khuẩn biển thu TSA đa số có phổ kháng rộng, 8,5% (5/27) chủng tiêu diệt tất vi sinh vật thị (VSVCT), 29,6% (8/27) vi khuẩn biểu hoạt tính đối kháng với VSVCT, 18,5% (5/27) chủng tiêu diệt VSVCT, 14,8% (4/27) chủng tiêu diệt VSVCT Tỷ lệ chủng biểu hoạt tính đối kháng VSV cao mẫu ruột (66,6%, 20/30) > bọt biển (30,0%, 9/30) > rong (3,3%, 1/30) Kết cho thấy tầm quan trọng việc chọn lọc nguồn mẫu cho phân lập VKB biểu hoạt tính đối kháng Vibrio sp Bảng Kết xác định phổ kháng diệt khuẩn 30 vi khuẩn biểu hoạt tính đối kháng với Vibrio, xác định phương pháp cấy dọc STT Mã vi khuẩn biển Vibrio harveyi 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2002STB2.1 2002STB5.3 2002STB19.3 2002STB21.6 2002STB23.1 2002STB23.2 2002STB23.3 2002STB29.1 2002STB41.1 2002NTCL2 2002NTCL3 2002NTCL8 2002NTBD1 2002NTBD4 2002NTBD6 2002NTST1 2002NTST2 2002NTST5 2002NTCD2 2002NTTB1 2002NTTB2 2002NTTT3 2002NTTT4 2002NTTT6 2002NTTT7 2002NTTT1 2002NTR06 +++ + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ + ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 28 29 30 2002NTBD8 2002NTBD9 2002NTCD10 Vibrio parahaemolyticus Vi khuẩn thị Vibrio E cholerae coli Vi khuẩn phân lập môi trường TSA ++ ++ +++ ++ + + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ ++ + + ++ ++ + +++ ++ ++ +++ +++ + + ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ Vi khuẩn phân lập TCBS + + + + + + + + B cereus S aureus C albicans + + ++ + + + + + + + + + ++ + + + + + ++ + + + + ++ + + + + + + + + + + + +++ + + ++ + + + ++ + + + + + + + + ++ + + + + + + + ++ + ++ ++ - - - - Ghi chú: - : khơng hoạt tính (HT); (+):HT yếu; tăng dần + biểu thị hoạt tính kháng khuẩn tăng dần Xác định khả sinh chất kháng khuẩn dịch môi trường lỏng Khả sinh chất kháng khuẩn 30 VKB canh trường xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch, sử dụng VSVCT bao gồm V harveyi, V 340 parahaemolyticus, B cereus, C albicans Trên tổng 27 chủng phân lập TSA, B cereus bị ức chế dịch nuôi 17 chủng (chiếm 62,9%), V harveyi bị ức chế 18 chủng (chiếm 66,6%), V parahaemolyticus bị ức chế 15 chủng (chiếm 55,5%), không ghi Isolation and screening of the marine-associated nhận dịch ni ức chế C albicans (Hình 4) Hoạt tính ức chế V parahaemolyticus vi khuẩn biển mạnh hoạt tính ức chế vi khuẩn V harveyi, thấy rõ qua đường kính vịng vơ khuẩn Thêm vào đó, số lượng vi khuẩn biển biểu hoạt tính đối kháng xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch thấp so với phương pháp cấy dọc Trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch chất kháng khuẩn thường bị pha loãng, nồng độ chất nhỏ giá trị ức chế tối thiểu cần thiết để tiêu diệt VSVCT, gây âm tính giả Nhiều nghiên cứu khẳng định trình vi khuẩn sinh bacteriocin canh trường phụ thuộc nhiều yếu tố thời gian tăng trưởng, tốc độ lắc, mật độ vi khuẩn, thành phần môi trường, yếu tố cảm ứng trình sinh chất Do đó, nghiên cứu thu nhận bacteriocin, cần thiết có thí nghiệm tối ưu nhằm xác định điều kiện tăng trường vi khuẩn Kết chứng rằng, phương pháp sàng lọc chủng sinh chất kháng khuẩn phương pháp cấy dọc nhạy so với phương pháp khuếch tán đĩa thạch Hình Khả sinh chất kháng khuẩn canh trường phương pháp khuếch tán đĩa thạch VSVCT bao gồm (A): V harveyi, (B) V parahaemolyticus, (C) B cereus, (D) C albicans Xác định chất hợp chất kháng khuẩn Sử dụng 15 dịch 15 chủng biểu hoạt tính ức chế V parahaemolyticus làm đại diện để xác định chất chất kháng khuẩn hiện Kết cho thấy rằng, 15 dịch mơi trường hoạt tính sau ủ với enzyme pronase E Điều chứng tỏ chất kháng khuẩn có chất protein Kết tương tự với nghiên cứu gần liên quan đến phân lập vi khuẩn biển Vibrio mediterranei, Lactobacillus từ ruột động vật thủy sản [24, 25] Các nghiên cứu xác định chất kháng khuẩn nhạy với enzyme proteinase thường xác dịnh bacteriocin [24] Bên cạnh đó, 15 dịch mơi trường giữ hoạt tính đối kháng V parahaemolyticus sau ủ enzyme Lý giải việc có nhiều nguyên nhân; đó: i) cấu trúc đa dạng, số bacteriocin có cấu trúc bậc 4, ẩn amino acid điểm cắt chuyên biệt pronase E gây tượng âm tính giả; đó, việc xác định chất bacteriocin cần sử dụng kết hợp nhiều loại enzyme phân cắt protein khác proteinase K, trypsin; (ii) nhiều vi khuẩn đặc biệt Bacillus sinh bacteriocin, lipopeptide số acid hữu có hoạt tính ức chế Vibrio sp; vi khuẩn xem nguồn thu nhận dồi nhiều hợp chất kháng khuẩn, ứng dụng không cho thủy sản mà cịn nơng nghiệp kiểm soát nấm gây bệnh nguồn kháng sinh hữu hiệu y dược Phân tích trình tự nucleotide gen mã hóa 16S rRNA DNA VKB (2002STB23.3, 2002BTB41.1, 2002NTCL2 2002NTBD1, 2002NTR06) có hoạt tính kháng Vibrio sp mạnh dùng làm khuôn để khuếch đại gen 16s rRNA Kết PCR cho thấy sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, kích thước khoảng 1000 bp Dựa kết so sánh với trình tự ngân hàng gen phát sinh lồi (Hình 5), chủng 2002STB23.3 phân lập từ bọt biển có độ tương đồng 98,0% với Bacillus licheniformis MPF22 (MT48762.1) Một chủng khác phân lập từ bọt biển 2002STB41.1 có độ tương đồng trình tự 16S rRNA 98,3% với vi khuẩn Bacillus altitudinis NPB34B (MT598007.1) Hai chủng 2002NTBD1 2002NTCL2 phân lập từ ruột hai loài cá 341 Chau Minh Khanh et al khác xác định vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, trình tự 16S rRNA tương đồng 97,6% 99,0% với trình tự chủng Bacillus amyloliquefaciens FZB42 (MT598007.1) Cuối cùng, chủng 2002NTR6 phân lập từ rong Sargassum sp có độ tương đồng 96,4% với chủng Bacillus flexus strain K3.2 (MT299641.1) Kết chứng tỏ đa dạng loài vi khuẩn biển sinh vibriocins phân lập vùng biển Việt Nam Hình Cây phân loại thể mối liên quan chủng có hoạt tính mạnh lồi có trình tự gen 16S rRNA tương đồng Cây vẽ theo phương pháp Neighbor Joining, với bootstrap 1000 phép so sánh Kết cho thấy mối quan hệ chủng nghiên cứu với thành viên đại diện chi B flexus, B altitudinis, B licheniformis B amyloliquefaciens KẾT LUẬN Đã phân lập thành công chủng Bacillus biểu hiệu hoạt tính kháng Vibrio sp từ mẫu biển thuộc vùng biển Nha Trang (Khánh Hịa) Phú Qúy (Bình Thuận) Tỷ lệ phát chủng vi khuẩn biển sinh chất đối kháng với Vibrio sp cao ruột tôm, cá Trong số vi khuẩn biển biểu hoạt tính kháng Vibrio sp., chủng 2002STB23.3, 2002BTB41.1, 2002NTCL2, 2002NTBD1, 2002NTR06 có hoạt tính kháng Vibrio sp mạnh mơi trường rắn, lỏng chất kháng khuẩn có chất protein Kết phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy 05 chủng vi khuẩn biển nêu thuộc chi Bacillus có đa dạng loài Đây nguồn vi khuẩn quan trọng cho nghiên cứu tinh vibriocins, ứng dụng vibriocins vi khuẩn nguồn probiotic cho phát triển ngành thủy sản bền vững 342 Lời cảm ơn: Kết nghiên cứu thực tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật biển có khả sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng dụng nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21 Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn TS Đào Tấn Học ThS Lê Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học (Viện Hàn lâm KHCNVN) hỗ trợ định danh mẫu tôm cá biển sử dụng làm nguồn phân lập vi sinh vật biển nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Riley, M.A and J.E Wertz, Bacteriocins: evolution, ecology, and application Annual Review of Microbiology, 2002 56: p 117-37 Chopra, L., et al., Sonorensin: an antimicrobial peptide, belonging to the heterocycloanthracin subfamily of Isolation and screening of the marine-associated bacteriocins, from a new marine isolate, Bacillus sonorensis MT93 Applied and environmental microbiology, 2014 80: p 2981-2990 Ahmad, A., et al., Pseudomonas putida strain FStM2 isolated from shark skin: a potential source of bacteriocin Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2013 5: p 165-175 Cotter, P., C Hill, and R Ross, Bacteriocins: Developing Innate Immunity for food Nature reviews Microbiology, 2005 3: p 777-88 Flaherty, R.A., S.D Freed, and S.W Lee, The wide world of ribosomally encoded bacterial peptides PLoS Pathog, 2014 10: p e1004221 Balakrishnan, B., et al., Purification, characterization and production optimization of a vibriocin produced by mangrove associated Vibrio parahaemolyticus Asian Pacific journal of tropical biomedicine, 2014 4: p 253261 Ghequire, M.G.K and B Öztürk, A colicin M-type bacteriocin from Pseudomonas aeruginosa targeting the HxuC Heme receptor requires a novel immunity partner Applied and Environmental Microbiology, 2018 84: p e00716-18 Zacharof, M.P and R.W Lovitt, Bacteriocins produced by lactic acid bacteria- a review article APCBEE Procedia, 2012 2: p 50-56 Abriouel, H., et al., Diversity and applications of Bacillus bacteriocins FEMS Microbiology Reviews, 2011 35: p 201-232 10 Hansen, J.N., Nisin as a model food preservative Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1994 34: p 69-93 11 Lavilla-Pitogo, C.R., E.M Leaño, and M.G Paner, Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp, Penaeus monodon, associated with dominance of luminescent vibrios in the rearing environment Aquaculture, 1998 164: p 337-349 12 Bergh, Ø., Bacteria associated with early life stages of halibut, Hippoglossus 13 14 15 16 17 18 19 20 21 hippoglossus L., inhibit growth of a pathogenic Vibrio sp Journal of Fish Diseases, 1995 18: p 31-40 Gibson, L.F., J Woodworth, and A.M George, Probiotic activity of Aeromonas media on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii Aquaculture, 1998 169: p 111120 Ngan, P.T.T., H.D Tho, and T.N Suong, Comparing the ability on improving water quality and inhibiting Vibrio of selected Bacillus subtilis and Streptomyces parvulus in white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) Can Tho University Journal of Science, 2016 47: p 87-95 (in Vietnamese) Đào, N.T.B., et al., Isolation and selection Bacillus strains to inhibit Vibrio parahaemolyicus which is the cause of EMS on shrimp farming in Thua Thien Hue province Hue University Journal of Science: Agriculture and Rural Development, 2015 100: p 15-28 (in Vietnamese) Nguyen, V.D., et al., Screening of marine bacteria with bacteriocin-like activities and probiotic potential for ornate spiny lobster (Panulirus ornatus) juveniles Fish Shellfish Immunol, 2014 40: p 49-60 Lertcanawanichakul, M and S sawangnop, A comparison of two methods used for measuring the antagonistic activity of Bacillus species Walailak Journal of Science and Technology, 2008 5: p 161-171 Valgas, C., et al., Screening methods to determine antibacterial activity of natural products Brazilian Journal of Microbiology, 2007 38: p 369-380 Fujimoto, S., Y Nakagami, and F Kojima, Optimal bacterial DNA isolation method using bead-beating technique Memoirs of Kyushu University School of Health Sciences, 2004 3: p 33-38 Johnson, M., et al., NCBI BLAST: a better web interface Nucleic Acids Research, 2008 36: p W5-W9 Kumar, S., et al., MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across 343 Chau Minh Khanh et al Computing Platforms Molecular Biology and Evolution 2018 35: p 1547-1549 22 Sugita, H., et al., Production of the antibacterial substance by Bacillus sp strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish Aquaculture, 1998 165: p 269-280 23 Sugita, H., et al., Production of the antibacterial substance by Bacillus sp strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish Aquaculture, 1998 165: p 269-280 344 24 Abdulla, M.H., Gut associated lactic acid bacteria isolated from the estuarine fish Mugil cephalus: molecular diversity and antibacterial activities against pathogens International Journal of Aquaculture, 2014 1: p 1-11 25 Carraturo, A., et al., Inhibition of Vibrio parahaemolyticus by a bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) produced by Vibrio mediterranei Journal of Applied Microbiology, 2006 101: p 234-41 ... TẠO VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG... với Vibrio) ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn biển có khả sinh tổng hợp bacteriocin Phạm vi nghiên cứu: khả kháng vi sinh vật gây bệnh thủy, hải sản chủng vi. .. chủng VKB sinh bacteriocin Định danh vi khuẩn sinh học phân tử, nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài Khảo sát thời gian lên men đến khả sinh bacteriocin Kết luận Hình 2.3 Sơ đồ nội dung nghiên