Sản xuất axit acetic từ tinh bột sắn bằng phương pháp lên men vi sinh vật

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Phần I đặt vấn đề Một số vi khuẩn có khả trao đổi chất đặc biệt, thể tổng hợp, chuyển hoá, phân huỷ chất, đ-ợc ng-ời sử dụng để sản xuất thực phẩm, đồ uống số sản phẩm khác, hình thành công nghiệp vi sinh vật, vi sinh vật đ-ợc sử dụng lĩnh vực khác kỹ thuật vi sinh vật đ-ợc xem tác nhân bản, trực tiếp chuyển hoá hoá học chất hay chất khác để thu nhận đ-ợc sản phẩm quan trọng có giá trị thực tế đ-ờng lên men chuyển hoá Trong năm gần đây, công nghệ vi sinh vật ng-ời ta đà ý đến việc sản xuất axit hữu đ-ờng chuyển hoá hợp chất gluxit d-ới tác dụng vi sinh vật Những axit hữu đ-ợc ý axit dùng thực phẩm (nh- axit xitric, axit lactic, axit malic, axit itaconic) vµ axit có ý nghĩa công nghiệp nh- axit gluconic (tạo nguyên liệu hoá học mới) (Phan Cự Nhân (chủ biên) 2004) Đặc biệt axit acetic hoá chất công nghiệp quan trọng, với sản l-ợng chừng 3,0 triệu tấn/năm, đ-ợc sản xuất tiêu thụ giới Đối với axit axetic loại axit hữu không gây độc hại nồng độ 1,7-2% có khả ức chế thối rữa vi khn ë nång ®é - 6% nã diƯt đ-ợc vi khuẩn không sinh bào tử Axit acetic đ-ợc ng-ời sản xuất sử dụng nhiều ngành công nghiệp hoá chất, công nghiệp thực phẩm nh- sản xuất tinh dầu chuối, dứa công nghệ muối rau Axit acetic đ-ợc sử dụng nhiều y d-ợc, đ-ợc dùng làm dung môi công nghiệp sơn Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Hàng năm giới có l-ợng axit acetic khổng lồ đ-ợc sản xuất Năm 1980 tổng sản l-ợng axit acetic thu đ-ợc ph-ơng pháp vi sinh vật toàn giới( trừ Nga Trung Quốc) 160.000 Sản l-ợng axit acetic Châu Âu (năm 2004) 876.000 tấn/năm (876kt/a) Nhật Bản sản xuất 589 kt/a Tổng sản l-ợng axit acetic toàn giới đ-ợc -ớc tính khoảng 2mt/a (http://www.google.com.vn) Trong sản xuất axit acetic công nghệ sinh học ng-ời ta từ r-ợu từ nguyên liệu phụ phẩm sản xuất nông nghiệp Đây nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tận dụng sản phẩm d- thừa sẵn có sản xuất nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, lại cho suất hiệu cao Sản xuất axit acetic ph-ơng pháp tổng hợp hoá học ch-ng cất gỗ tốn tiền của, công sức, trang thiết bị nguồn nguyên liệu Vì thế, nhờ có công nghệ sinh học đại, công nghệ sản xuất axit acetic ph-ơng pháp vi sinh học ngày đ-ợc quan tâm sử dụng phổ biến đem lại giá trị kinh tế cao Nên việc sản xuất axit acetic ph-ơng pháp vi sinh học trở nên cần thiết có ý nghĩa thực tiễn lớn Từ đà chọn đề tài "Sản xuất axit acetic từ tinh bột sắn ph-ơng pháp lên men vi sinh vật" Mục tiêu: Sản xuất axit acetic ph-ơng pháp lên men vấn đề mà công nghệ sinh học (CNSH) công nghệ vi sinh (CNVS) tập trung khai thác, song thời gian sở vật chất, khả hạn chế nên đề tài nhằm giải vấn đề sau: 1- Tìm hiểu phân lập vi khuẩn acetic từ môi tr-ờng tự nhiên Từ tìm chủng vi khuẩn acetic có hoạt tính mạnh 2- Nghiên cứu số tiêu liên quan đến khả tổng hợp axit acetic từ nguồn chất - bột sắn chủng vi khuẩn acetic có hoạt tính mạnh 3- Sản xuất axit acetic điều kiện tối -u hoá Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di trun - Vi sinh 4- Lµm quen vµ hoµn thiƯn dần ph-ơng pháp nghiên cứu khoa học khả thực hành thí nghiệm Đề tài đ-ợc làm phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa sinh học Đại học Vinh ngày 22/08/2005 đến 30/04/2006 Với giúp đỡ tận tình quý báu thầy giáo Nguyễn D-ơng Tuệ, cán phòng thí nghiệm Di truyền - vi sinh - ph-ơng pháp, thầy, cô tổ Di truyền - vi sinh - ph-ơng pháp, thầy cô giáo khoa sinh bạn bè đồng nghiệp Do b-ớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu nên không tránh khỏi khiếm khuyết Rất mong nhận đ-ợc góp ý thầy cô bạn bè đồng nghiệp Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu thầy giáo Nguyễn D-ơng Tuệ, cảm ơn cán phòng thí nghiệm Di truyền - vi sinh, thầy cô giáo khoa đà giúp đỡ, tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài này, cảm ơn quan tâm, giúp đỡ, động viên bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian qua Vinh, ngày 20 tháng 04 năm 2006 Sinh viên thực Phạm Thị Hải Thu Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Phần II Tổng quan tài liệu I - Sơ l-ợc vi khuẩn lên men acetic Ngày ng-ời ta đà biết tới 20 loài vi khuẩn có khả lên men acetic, chúng đ-ợc gọi tên chung vi khuẩn acetic Những vi khuẩn dễ tìm thấy không khí, đất n-ớc Vì vậy, dịch n-ớc hoa quả, bia, r-ợu có nồng độ thấp, dịch đ-ờng, rau, d-a để hở tiếp xúc với không khí dễ bị vẩn đục nhẹ, bề mặt tạo thành lớp màng mỏng mịn màu trắng vàng xám Đó vi khuẩn acetic phát triển Tr-ớc đây, Lui Pasteur cho trình lên men giấm loại vi sinh vật gây đ-ợc gọi Mycoderma aceti Sau ng-ời ta đà biết nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm Acetobacter Bacterium Vi khuẩn acetic là: Những trùc khn h×nh que KÝch th-íc 0,5 x 80 m Không sinh bào tử Hiếu khí bắt buộc (chúng phát triển thành váng môi tr-ờng dịch thể) Vi khuẩn acetic vi khuẩn Gram âm Chúng th-ờng xếp thành chuỗi dài đứng thành cặp Các vi khuẩn có loài không chuyển động có loài chuyển động với tiên mao cực vòng quanh thể Vi khuẩn acetic có đặc điểm dễ thay đổi hình dáng tế bào Trong điều kiện sinh tr-ởng không thuận lợi tế bào chúng có hình dạng không bình th-ờng: tế bào kéo dài, phân nhánh, phình tr-ơng lên tế bào có hình dạng kì lạ (tế bào dị hình) Vì ng-ời ta th-ờng Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di trun - Vi sinh gäi vi khn acetic lµ bän đa hình tế bào từ hình elip, tới hình que thẳng cong, tới hình thù quái gở Nhiệt độ tối thích sinh tr-ởng vi khuÈn acetic n»m kho¶ng 20 - 350C Vi khuẩn acetic có tính chịu axit cao, vi khuẩn trao đổi chất thực pH môi tr-ờng thấp, số loài phát triển tốt pH 3,2 Điều phân biệt chúng với vi khuẩn khác Các vi khuẩn acetic th-ờng gặp có hình sợi dài, kết thành màng bề mặt chất khả tạo nhầy với vỏ tế bào A.pasteurianum tạo thành màng có bề mặt khô nhăn nheo A xylium có hình hạt thô dày Một số loại vi khuẩn acetic lại không tạo màng dày đặc, mà tạo thành màng mỏng bề mặt dịch, tạo thành vòng thành bình nuôi cấy Một số loài bao nhầy tạo thành sắc tố, số loài bao nhầy tạo thành xelluloza nh- vi khuẩn Acetobacter xylium bao nhầy đ-ợc cấu tạo xelluloza Ng-ời ta dùng loại bao nhầy để ăn, nuôi cấy A.xylium n-ớc dừa Loại sản phẩm có h-ơng vị cùi vải, cùi nhÃn có tên "Natodecoco" Hiện ng-ời ta mô tả đ-ợc tới 20 loài vi khuẩn acetic thuộc giống Acetobacter, loài quan trọng là: A.aceti, A.pasteurianum, A.orleanens, A.xylium, A.schutzenbachii Những tế bào vi khuẩn khác kích th-ớc tế bào, tính chịu đựng cồn, khả tạo axit acetic môi tr-ờng nhiều đặc tính khác A.aceti tích tơ m«i tr-êng tíi 60% axit acetic A.orleanens tÝch tơ m«i tr-êng tíi 9,5% A.schutzenbachii tÝch tơ m«i tr-êng tíi 11,5% A.xylium tÝch tơ m«i tr-êng tới 4,5% Khả chịu cồn loài vi khuẩn khác nhau: A.aceti, A.schutzenbachii nuôi môi tr-êng cã nång ®é cån tíi 11%, nh-ng A.xylium - 7% Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Một số loài có khả sinh tổng hợp vitamin B1, B2, B12 Nh-ng nhiều loài cần có vitamin làm chất sinh tr-ởng có môi tr-ờng mà tr-ớc hết axit pantotenic Những vi khuẩn acetic oxy hoá đ-ợc r-ợu etylic thành axit acetic mà oxy hoá đ-ợc r-ợu propionic thành axit propionic, r-ợu butylic thành axit butylic, nh-ng chúng không oxy hoá đ-ợc r-ợu metylic r-ợu bậc cao Trong môi tr-ờng đủ r-ợu etylic (5 - 13%) sản phẩm chủ yếu axit acetic nồng độ r-ợu thấp vi khuẩn oxy hoá triệt để r-ợu thành CO2 H2O (L-ơng Đức Phẩm 2000) Các loại Acetobacter chứa đặc điểm: - Có mặt Catalaza - Oxy hoá etanol qua axit axetic tíi CO2 vµ H2O - Oxy hoá lactat thành cacbonat - Oxy hoá glyxerol thành đihyđroxyaxeton photphat sản sinh axit gluconic từ glucoza Các vi khuẩn chi Acetobacter đ-ợc chia thành nhóm: - Oxy hoá mạnh - Oxy hoá - Oxy hoá trung bình - Oxy hoá yếu Trong trình lên men acetic hạn chế đ-ợc có mặt A.pasteurianum A.perooxidans Vì loài tích lũy axit acetic tạm thời (Nguyễn D-ơng Tuệ 2000) Vi khuẩn acetic rÊt hiÕu khÝ Tèc ®é sinh tr-ëng cđa chóng rÊt nhanh, tõ mét tÕ bµo sau 12 giê cã thể phát triển thành 17 triệu tế bào Trong trình sinh tr-ởng phát triển chúng tạo thành axit acetic nồng độ axit thấp lại kích thích sinh tr-ởng chúng Vì vậy, sản xuất giấm dùng r-ợu không cần trùng đ-ợc bổ sung mét Ýt axit acetic ®Ĩ kÝch thÝch sù sinh tr-ởng phát triển vi khuẩn acetic.(L-ơng Đức Phẩm- 2000) Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh II - Vai trò axit acetic tình hình sản xuất axit acetic - øng dơng cđa axit acetic Axit acetic cã nhiỊu øng dơng ®êi sèng ng-êi Axit acetic nguyên liệu để tổng hợp nhiều sản phẩm quan träng kh¸c nh-:  C¸c este, metylaxetat, etylaxetat, propylaxetat, butylaxetat,các loại axetyl Các loại este glyxerin, chất đ-ợc dùng làm dung môi nguyên liệu ban đầu cho trình sản xuất số chất khác nh- làm dung môi công nghệ sơn Alđehyd acetic đ-ợc dùng với số l-ợng lớn sản xuất axetat xellulôza từ hợp chất tổng hợp nên lụa nhân tạo, sơn nhân tạo ,tổng hợp hợp chất dẻo, tơ sợi phim không cháy, chất tạo hình thuỷ tinh không vỡ Axit acetic ®-ỵc dïng ®Ĩ ®iỊu chÕ mét sè mi axetats kim loại, dùng làm chất mầu công nghiệp nhuộm (nh- nhôm axetat, sắt axetat, crôm axetat), làm nguyên liệu sản xuất bột sơn (nh- đồng axetat, chì axetat) (Lê Xuân Trọng, Võ Văn Tòng 1999) Axit acetic đ-ợc dùng để tổng hợp indigo ( chất chàm) nhiều chất khác công nghệ hoá học tinh vi Axit acetic đ-ợc dùng để tổng hợp chất diệt cỏ (nh- 2, diclo phenoxy acetic), chất đ-ợc dùng rộng rÃi nông nghiệp, dùng sơ chế mủ cao su Axit acetic đ-ợc dùng để điều chế số este làm chất thơm( nh- acetat isoamyl) Đặc biệt axit axetic làm thuốc chữa bệnh, đ-ợc sử dụng công nghiệp d-ợc sản xuất aspirin, antiphibrin, fenaxetin nhiều chất khác Gần đây, ng-ời ta bắt đầu dùng axit acetic để hoà tan chitozan, vật thay việc hồ vải Việt Nam axit acetic đ-ợc dùng chủ yếu để chế biến mủ cao su thành cao su bán thành phẩm Trong công nghiệp thực phẩm: nguyên liệu thiếu giấm (axit acetic loÃng) đ-ợc sản xuất đ-ờng lên men Axit Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh acetic đ-ợc dùng chế biến đồ hộp, dùng với rau t-ơi bữa ăn Axit acetic với axit propyonic để điều chế chất bảo quản ngô t-ơi làm thức ăn cho gia súc (Nguyễn Thành Đạt 1999) Nh- axit acetic có giá trị ứng dụng lớn, axit acetic đ-ợc sử dụng nhiều công nghiệp hoá chất ,công nghiệp thực phẩm, y d-ợc công nghiệp sơn - Tình hình sản xuất axit acetic Từ thời th-ợng cổ ng-ời ta ®· biÕt chÕ t¹o axit acetic ë d¹ng giÊm Tuy nhiên khoảng 200 năm gần ng-ời ta biết điều chế đ-ợc axit acetic đậm đặc Axit acetic có khoảng 3% giấm Thời x-a ng-ời ta để chua r-ợu vang để tạo thành giấm Giấm đ-ợc tạo thành từ dung dịch r-ợu vang để tĩnh ,ng-ời ta cho biến đổi trình lên men gọi trình lên men acetic Về thực chất trình oxy hoá đ-ợc thùc hiƯn bëi nhãm vi khn acetic (Ngun L©n Dịng 2000) Những năm 50 kỷ XX axit acetic chủ yếu đ-ợc sản xuất ph-ơng pháp tổng hợp hoá học ch-ng khô gỗ.Sau năm 60 với tăng nhịp độ phát triển công nghiệp dầu mỏ giới, việc tận dụng sản phẩm dầu mỏ công nghiệp sản xuất axit acetic làm tăng đáng kể l-ợng axit Mỹ Tây Đức sản l-ợng axit acetic năm 1973 tăng ba lần so với năm 1960, Nhật Bản tăng lần Nhiều n-ớc đà tìm đến giải pháp thu nhận axit acetic ph-ơng pháp vi sinh với sản l-ợng đáng kể Tính riêng năm 1980 tổng sản l-ợng axit acetic thu đ-ợc ph-ơng pháp vi sinh giới( trừ Nga Trung Quốc) 160.000 Riêng Việt Nam nhu cầu giấm axit acetic lớn Nhu cầu tổng cộng axit acetic lên 3.000 tấn/năm Việc cung cấp axit acetic hoàn toàn đ-ờng nhập Tr-ớc tình hình đó, việc tìm kiếm biện pháp khả thi sản xuất giấm suất cao axit acetic đ-ợc quan tâm (Đinh Thị Kim Nhung 1996) Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Ngày có nhiều hình thức sản xuất axit acetic với quy mô vừa, nhỏ, quy mô gia đình quy mô công nghiệp Hàng năm nhân loại tiêu thụ l-ợng giấm t-ơng đ-ơng với 160.000 tÊn axit acetic tinh khiÕt (hay 3,2 tû lÝt giấm chứa 5% axit acetic) Còn có khối l-ợng lớn axit acetic đậm đặc đ-ợc sản xuất quy mô công nghiệp để sử dụng ngành công nghiệp (sản xuất loại este, loại axetyl, axetaldehyl, axetat, xenlulôza, tổng hợp indigo, tổng hợp chất diệt cỏ, tổng hợp aspirin nhiều d-ợc phẩm khác, chế biến mủ cao su thành cao su bán thành phẩm) (Nguyễn Lân Dũng 2000) Từ giấm ph-ơng pháp ch-ng cất ng-ời ta thu đ-ợc axit axetic, năm giới sản xuất đ-ợc khoảng triệu (riêng ph-ơng pháp vi sinh vật : 250.000 tấn) (Nguyễn Thành Đạt 2000) Sản l-ợng sản xuất axit acetic Châu Âu (năm 2004) 876.000 tấn/năm (876kt/a) Nhật Bản sản xuất 589kt/a Tổng sản l-ợng toàn giới đ-ợc -ớc tính khoảng 2mt/a.(www://google.com.vn) III - Quá trình lên men acetic - Bản chất trình lên men acetic Lên men acetic hay lên men giấm thực chất trình oxy hoá hiếu khí r-ợu etylic thành axit acetic d-ới tác vi khuẩn lên men (vi khuẩn acetic) gồm số loài thuộc chi Acetobacter Ph-ơng trình tổng quát trình lên men: CH3CH2OH + O2  CH3COOH + H2O + 117kcal Thực chất trình phức tạp gồm giai đoạn với enzym vi khuẩn acetic tham gia xúc tác Giai đoạn 1:R-ợu etylic đ-ợc chuyển thành axetaldehyl Giai đoạn 2: Axetaldehyl đ-ợc hydrat hoá thành axit axetic Phạm Thị Hải Thu Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Phản ứng: CH3CH2OH + CH3CHO O2  CH3CHO + H2O + H2O  CH3CH(OH)2 CH3CH(OH)2 + O2  CH3COOH + H2O R-ợu etylic nhờ xúc tác enzym oxy hoá khử bị oxy hoá thành axetaldehyl Hợp chất đ-ợc tiếp tục biến đổi thành axit acetic nhờ ¶nh h-ëng cđa hƯ alhydrogenaza oxy ho¸ Trong giai đoạn oxy hoá electron đ-ợc giải phóng đ-ợc chuyển đến coenzym enzym t-ơng ứng, khư NADP+ thµnh NADPH vµ H+ Cã ý kiÕn cho có mặt NADPH đà ngăn cản oxy hoá tiếp tục axit acetic đến CO H2O (Nguyễn Thành Đạt -2000) Nh- điện tử NADP nhận qua xitocrom chuỗi hô hấp đ-ợc chuyển ®Õn O2 lµ chÊt nhËn ®iƯn tư ci cïng Tõ tr-ớc đến xếp trình lên men acetic thuộc lên men hiếu khí nh-ng thực chất trình chuyển hoá.Vi sinh vật sử dụng chất etanol chuyển thành axit acetic NADPH2 xuất trình đ-ợc chuyển hoá qua chuỗi hô hấp để thu nhận l-ợng, song chất bị phân huỷ không hoàn toàn, oxy chất nhận điện tử Do trình đ-ợc gọi oxy hoá không hoàn toàn Loại chuyển hoá trải qua nhiều b-ớc axit acetic sản phẩm chuyển hoá (Nguyễn D-ơng Tuệ -2000) - Vai trò vi khuẩn acetic lên men acetic Lên men acetic thực chất trình oxy hoá r-ợu thành axit acetic nhê mét nhãm vi khuÈn gäi lµ vi khuÈn acetic (thc chi Acetobacter) Nhê cã c¸c enzym cđa vi khn acetic xúc tác cho phản ứng chuyển hoá Hiện giới có ph-ơng pháp lên men acetic Ph-ơng pháp1: Lên men chậm Ph-ơng pháp đ-ợc gọi ph-ơng pháp chum hở, ph-ơng pháp Orleans hay ph-ơng pháp Pháp Quá trình đ-ợc thực Pháp Phạm Thị Hải Thu 10 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Sau 96 giê: CT1 cã pH gi¶m vỊ CT2, CT3 cã pH giảm dần pH=3 Để thấy rõ kết đ-ợc biểu diễn đồ thị: pH CT1 CT2 CT3 24h 48h 72h t(gi) 96h Đồ thị 1: Sự giảm pH dịch lên men Từ đồ thị cho ta thấy: CT1: pH giảm dần với tốc độ chậm CT2: Có độ biến thiên pH lớn CT1 CT3: Có độ biến thiên lớn sau 96 ổn định pH =3 Sau xác định có mặt axit acetic định tính theo dõi tích luỹ axit cách chuẩn độ NaOH 0,1 N đánh giá độ Ternèr (0T) Kết thu đ-ợc nh- sau(Bảng 5b): Bảng 5b - Sự tích luỹ axit acetic công thức thí nghiÖm CT1 CT2 CT3 - + + T 2,19 2,45 Hàm l-ợng axit acetic 13,14 14,70 Phản ứng định tính với FeCl3 (mg/100 ml) Phạm Thị Hải Thu 38 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Tõ b¶ng 5b cho thÊy: Khi kiĨm tra b»ng phản ứng với FeCl3 CT1 không rõ màu đặc tr-ng không xác định axit acetic CT2, CT3 tiến hành chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1 N đánh giá 0T từ xác định hàm l-ợng axit acetic Sau ph©n tÝch cho thÊy: CT2 thu ®-ỵc: T : 2,19 Axit acetic:13,14 (mg/ 100 ml) CT3 thu đ-ợc : T :2,45 Axit acetic :14,70 (mg/ 100 ml) Nh- CT3 cho kết tốt : 0T : 2,45 Axit acetic: 14,70 (mg/ 100 ml) Do theo nên áp dụng công thức CT3 ảnh h-ởng thời gian đến tích luỹ axit acetic Tiến hành thí nghiệm: Với nồng độ chất (30% dung dịch bột sắn) đ-ợc kết tốt tiến hành thí nghiệm nh- sau: Các công thức thí nghiệm Ngày 21-09-2006 Các tiêu CT1 CT2 CT3 CT4 Nồng độ chất(%) 30 30 30 30 pH ban đầu 7 7 NhiƯt ®é ( C) 30 30 30 30 Thêi gian(giê) 48 72 96 >96 Vi khuÈn A.aceti 1 1 (ml) (Để có l-ợng vi sinh vật công thức thí nghiệm dung dịch đ-ợc kiểm tra lại đo độ đục máy ®o mµu quang ®iƯn ë b-íc sãng trung tÝnh 660 nm) Phạm Thị Hải Thu 39 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Từ công thức trên, với điều kiện nồng độ chất giống nhau, chóng t«i theo dâi tÝch l axit acetic b»ng đo pH dung dịch lên men.Kết thu đ-ợc bảng 6a: Bảng 6a - Sự biến thiên pH dịch lên men Các công thức Thời gian (giờ) CT1 48 43 CT2 72 CT3 CT4 96 >96 Qua bảng cho thấy tất công thức pH giảm dần: CT1: 48h pH pH=  CT2: ë 72h pH vÒ pH =3 CT3, CT4: pH ổn định pH =3 Nh- pH giảm dần xuống pH=3 ngừng lại, có nghĩa thời điểm tích luỹ đ-ợc axit acetic nhiều nhÊt (sau 72 giê pH= vµ 96 giê pH 3) CT2 đạt kết nhanh (pH giảm xuống nhanh nhất) Và pH ổn định, xem thời điểm thu nhận axit acetic có hiệu Chúng theo dâi sù tÝch luü axit acetic b»ng ph¶n øng định tính định l-ợng công thức ứng với thời gian nghiên cứu chúng Kết thu đ-ợc nh- sau: (bảng 6b) Bảng 6b - Sự tÝch luü axit acetic ë c«ng thøc thêi gian thí nghiệm Thời gian Các công Phản ứng định Axit acetic T (giê) thøc tÝnh víi FeCl3 48 CT1 + 1,89 11,34 72 CT2 + 2,37 14,22 96 CT3 + 2,37 14,22 >96 CT4 + 2,37 14,22 Phạm Thị Hải Thu (mg/100ml) 40 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di trun - Vi sinh Tõ b¶ng 6b ta thÊy: (+: d-ơng tính, -: âm tính) 48h tích luỹ đ-ợc 11,34(mg/ 100 ml) axit acetic 72h tích luỹ đ-ợc 14,22(mg/ 100 ml) axit acetic Sau hàm l-ợng axit acetic không tăng lên Axit acetic (mg/100ml) Để thấy rõ kết đ-ợc biểu diễn đồ thị sau: 16 14 12 10 48h 72h 96h t(gi) Đồ thị 2: Sự tích lũy axit acetic Qua đồ thị rút nhận xét: Sau 72h 96h có hàm l-ợng axit acetic cao thời điểm thu đ-ợc nhiều axit acetic Nếu tiếp tục cho lên men l-ợng axit acetic bị oxi hoá hàm l-ợng giảm xuống Nh- thời gian lên men yếu tố ảnh h-ởng tới trình lên men Thời gian dài không đem lại hiệu kinh tế l-ợng axit acetic bị tổn thất tiếp tục ôxy hoá Nếu thời gian ngắn không đủ cho tế bào vi khuẩn sinh tr-ởng phát triển trình lên men không kịp diễn ra, l-ợng axit acetic tạo thấp ¶nh h-ëng cđa nhiƯt ®é NhiƯt ®é cã ¶nh h-ëng quan trọng đến trình lên men vi sinh vật (Lê Ngọc Tú, La Văn Trứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng 1982) Phạm Thị Hải Thu 41 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Tốc độ phản ứng enzym xúc tác tăng theo nhiệt độ giới hạn định mà enzym ch-a biến tính Đại l-ợng đặc tr-ng cho ảnh h-ởng đến tốc độ phản ứng hoá học nh- phản ứng Enzym hệ số nhiệt ®é Q10: Q10  Kt  10 Kt Trong ®ã: Phản ứng hoá học Q10=2-3 Phản ứng Enzim Q10=1-2 Tiến hành thí nghiệm: Với nồng độ chất, thời gian lên men đ-ợc kết tốt trên, tiến hành công thức thí nghiệm nh- sau: Ngày Các tiêu CT1 CT2 CT3 Nồng độ 30 30 30 NhiƯt ®é(oC) 20 30 40 Thêi gian (h) 96 96 96 Vi khuÈn 1 7 chất(%) 28-09-2006 A.aceti pH ban đầu Chúng theo dâi sù biÕn thiÕn pH lªn men KÕt thu đ-ợc bảng sau: (bảng 7a) Bảng 7a - Sự biến thiên pH dịch lên men Thời gian (giê) CT1 CT2 CT3 24 5 48 43 72 3 96 3 43 Để thấy rõ kết thu đ-ợc biểu diễn đồ thị3: Phạm Thị Hải Thu 42 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh pH CT1 CT2 CT3 24h 48h 72h 96h t(gi) Đồ thị 3: Sự biến thiên pH dung dịch lên men Từ bảng đồ thị cho thấy: CT1, CT2: 96h pH gi¶m nhanh vỊ pH=3 CT3 : 96h pH gi¶m chËm nhÊt vÒ pH = 43 Theo dâi tÝch luü axit acetic phản ứng định tính định l-ợng chuẩn độ với NaOH 0,1 N Kết thu đ-ợc nh- sau ( bảng 7b) Bảng 7b - Sự tích luỹ axit acetic dung dịch lên men Công thøc thÝ nghiÖm CT1 CT2 CT3 + + - T 2,07 2,10 Hàm l-ợng axit acetic 12,42 12,60 Phản ứng ®Þnh tÝnh víi FeCl3 (mg/ 100 ml) Tõ kÕt qu¶ b¶ng 7b cho thÊy: Khi kiĨm tra b»ng ph¶n ứng định tính CT1,CT2 cho màu đặc tr-ng ( tạo thành sắt axetat có màu đỏ thẫm) CT3 cho màu nhạt so với CT1, CT2 tiến hành chuẩn độ CT1,CT2 Khi phân tích cho thấy: Phạm Thị Hải Thu 43 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh CT1 thu ®-ỵc T :2,07 Axit acetic: 12,42 (mg/ 100 ml) CT2 thu đ-ợc T :2,10 Axit acetic:12,60 (mg/ 100 ml) Nh- CT2 cho kết tốt T : 2,10 Axit acetic:12,60 Do theo nên ¸p dông CT2 Vi khuÈn Acetobacter thuéc nhãm -a Êm, nhiệt độ thích hợp với chúng từ 20-300C nh-ng chúng sinh tr-ởng phát triển tốt 300 C nhiệt độ cao ức chế hoạt động đến mức đình sinh sản tế bào làm tăng tổn thất cho vi khuẩn hiệu suất trình lên men giảm bay axit acetic Nếu nhiệt độ thấp, trình lên men xảy chậm, kết l-ợng axit acetic tạo thành thấp ảnh h-ởng mật độ vi sinh vật lên men acetic Tốc độ phản ứng enzym kiểm soát phụ thuộc vào nồng độ [E] [S] (xem 1) phụ thuộc tốc độ phản ứng V vµo [E] lµ hµm bËc nhÊt V  k.[E ] (Lê Ngọc Tú, La Văn Trứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng 1982) Khi nồng độ chất [S] nhỏ tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [S] [S] lớn tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzym [E] đây, để theo dõi mật độ vi sinh vật đ-ợc biểu thị b»ng sè ml dÞch hun phï cã vi sinh vËt Kết thu đ-ợc nh- sau: (bảng 8) Phạm Thị Hải Thu 44 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di trun - Vi sinh B¶ng - Sù tÝch l axit axetic dung dich lên men Các yếu tố C«ng thøc thÝ nghiƯm CT1 CT2 CT3 30 30 30 Nhiệt độ (oC) 30 30 30 pH ban đầu 7 Thêi gian(giê) 96 96 96 Vi khuÈn A.aceti T 2.12 2.52 2.01 Axit acetic 12.72 15.12 12.06 Nồng độ chất (%) (ml) (mg/ 100 ml) Tõ kÕt qu¶ ë b¶ng cho thÊy: CT1 thu đ-ợc: 0T : 2.12 Axit acetic: 12.72 (mg/ 100 ml) CT2 thu đ-ợc: 0T : 2.52 Axit acetic: 15.12 (mg/ 100 ml) CT3 thu đ-ợc: 0T : 2.01 Axit acetic: 12.06 (mg/ 100 ml) Nh- vËy, CT2 thu đ-ợc kết tốt Do áp dụng công thức CT2 So sánh sai khác đồ thị 4: 16 Axit acetic (mg/100ml) 14 12 10 Các công thức TN CT1 Phạm Thị Hải Thu CT2 CT3 45 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Đồ thÞ 4: Sù tÝch luü axit acetic Nh- vËy qua đồ thị ta thấy rõ sai khác công thức CT1, CT2, CT3 Nếu số tế bào vi khuẩn lớn, mật độ dày dẫn đến pha suy vong làm số l-ợng tế bào quần thể giảm Vì l-ợng axit acetic tạo thành thấp, mật độ vi khuẩn acetic vừa phải tạo l-ợng axit cao Phạm Thị Hải Thu 46 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Ch-ơng IV Tối -u hoá sản xuất axit acetic từ tinh bột sắn Tối -u hoá trình tổ hợp lai tất yếu tố có ảnh h-ởng tốt phản ứng lên men tạo axit acetic, cho có nhiều sản phẩm Qua kết bảng trên, thấy lên men acetic tốt điều kiện sau: Nồng độ chất : 30% dung dịch bột sắn Nhiệt ®é (0C) : 300C pH ban ®Çu :7 MËt ®é vi khuÈn A.aceti : 2ml Thêi gian lªn men : 72h 96h Từ theo chúng tôi, quy trình sản xuất acetic từ bột sắn nh- sau: Phạm Thị Hải Thu 47 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Bột sắn (khô, sạch) Pha loÃng có nồng độ 30% ( pha 30g bột sắn/ 1000ml n-ớc) Phân phối vào bình tam giác có nót b«ng v« trïng V« trïng ë atm, 30 phút Dịch vô trùng (pH ban đầu =7) Vi sinh vật (mật độ vi khuẩn A.aceti: 2ml) Lên=Lên men (pH ban đầu 7) men (ở 300C) Theo dõi thay đổi pH (24h/lần) (24h /lần) pH không thay đổi sau 72 giê Sù tÝch luü axit acetic b»ng chuÈn độ Kiểm tra: - Xác định 0T - Hàm l-ợng axit acetic (mg/ 100 ml) Tiến hành lên men điều kiện tối -u hoá theo dõi tích luỹ axit acetic chuẩn độ NaOH 0,1N đánh giá 0T Kết thu đ-ợc nh- sau: Hàm l-ợng axit acetic T : 2,53 : 15,18 (mg/ 100 ml) Nh- vËy ®iỊu kiƯn tèi -u hoá, l-ợng axit acetic tích luỹ đ-ợc nhiều (hàm l-ợng axit acetic 15,18 mg/ 100 ml) Phạm Thị Hải Thu 48 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Phần V Kết luận đề nghị I.KÕt ln Vi khn acetic ph¸t triĨn rÊt tèt môi tr-ờng n-ớc bia, r-ợu Từ nguồn vật liệu n-ớc bia r-ợu đà phân lập chủng vi khuẩn khiết Acetobacter aceti Chủng có khả lên men hiệu Tìm hiểu số yếu tố ảnh h-ởng đến trình lên men acetic Bột sắn: Là nguyên liệu rẻ tiền dễ kiếm lại có hàm l-ợng tinh bột cao (67,6%) bột sắn nguyên liệu tốt sản xuất axit acetic.30% dung dịch bột sắn nồng độ thích hợp cho lên men acetic Thời gian cần thiết là: 72h- 96h pH =3 ngừng lại thời điểm tích luỹ axit acetic nhiều Đây thời ®iĨm thu nhËn axit acetic cã hiƯu qu¶ nhÊt NhiƯt độ : Nhiệt độ lên men có vai trò quan trọng trình lên men vi khuẩn Acetobacter vi khuẩn -a ấm Nhiệt độ thích hợp cho sinh tr-ởng phát triển A.aceti 300C Mật độ vi sinh vật: Dịch(huyền phù) vi khuẩn lên men tốt điều kiện 2ml Điều kiện tối -u hoá cho trình lên men acetic cần có: Nồng độ chất : 30% NhiƯt ®é :300C Thêi gian : 72h- 96h MËt ®é vi sinh vËt: 2ml dÞch (hun phï) vi khn A.aceti Từ xây dựng quy trình sản xuất axit acetic II Đề nghị Axit acetic ngày đ-ợc ứng dụng nhiều đời sống, đặc biệt axit acetic dùng nhiều xây dựng Hàng năm ng-ời ta sử dụng hàng tỉ axit acetic dung môi pha sơn Vì việc tìm kiếm, nghiên cứu biện pháp khả thi sản xuất axit acetic suất cao cần đ-ợc quan tâm đầu t- nhiều Phạm Thị Hải Thu 49 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Ngoài nguyên liệu bột sắn, có điều kiện nghiên cứu sản xuất axit acetic từ nguyên liệu nông nghiệp nh- ngô, khoai lang , từ phụ phẩm công nghịêp thực phẩm, từ dầu mỏ Có điều kiện nghiên cứu thêm chủng vi khn A.subooxydans - chđng cã enzym dehydrogenaza ho¹t tÝnh cao ôxy hoá mạnh axetaldehyt tạo axit acetic Phạm Thị Hải Thu 50 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Tài liệu tham khảo Kiều Hữu ảnh - Vi Sinh Học Công Nghiệp - NXBGD 1998 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức - Một số ph-ơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học 1978 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty - Vi sinh vật học NXBGD2000 Nguyễn Thành Đạt - C¬ së sinh häc Vi sinh vËt - NXBGD-1999 Nguyễn Thành Đạt - H-ớng dẫn thực hành vi sinh häc - NXBGD 1980 sinh vËt,TËp II - NXBGD1975 Nguyễn Văn Đức (chủ biên) -Ph-ơng pháp kiểm tra thống kê sinh học NXBKHKT-2003 Trịnh Xuân Hoạt - Tổng hợp axit citric Asp.Niger dung dịch rỉ đ-ờng (Luận văn tốt nghiệp 2002) E.N.Misuchin, V.T.Emxev - Vi sinh häc - Matxc¬va, 1974 (Nga) Phan Cù Nhân(chủ biên) - Sinh học đại c-ơng - Tập I - NXBĐHSP 2004 10 Đinh Thị Kim Nhung - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acetic theo ph-ơng pháp chìm 1996 11 L-ơng Đức Phẩm - Vi sinh vËt häc vµ an toµn vƯ sinh thùc phÈm NXBNN - HN2000 12 Trần Linh Th-ớc - Ph-ơng pháp phân tích vi sinh vật n-ớc thực phẩm mỹ phẩm NXBGD 2000 13 Nguyễn Đình Th-ởng, Nguyễn Thanh Hằng - Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn etylic - NXBKHKT2005 14 Lê Xuân Trọng,Võ Văn Tòng - Hoá học 12- NXBGD 1999 15 Nguyễn D-ơng Tuệ - Công nghệ sinh học - Đại Học Vinh 16 Ngun D-¬ng T - Thùc tËp lín vi sinh häc 2003 Phạm Thị Hải Thu 51 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh mục lục Nội dung Trang Phần I Đặt vấn đề Phần II Tổng quan tài liệu I Sơ l-ợc vi khuẩn lên men acetic II Vai trò axit acetic tình hình sản xuất axit acetic III Quá trình lên men acetic IV Sắn - nguyên liệu sản xuất axit acetic lên men 15 V Cơ sở lý luận thực tiển đề tài 17 Phần III Đối t-ợng ph-ơgn pháp nghiên cứu 19 I Đối t-ợng nghiên cứu 19 II Ph-ơng pháp nghiên cứu 21 Phần IV Kết nghiên cứu 25 Ch-ơng I Phân lập chủng vi khuẩn acetic 25 Ch-ơng II Phát triển vi khuẩn acetic 34 Ch-ơng III Các yếu tố ảnh h-ởng đến lên men acetic 35 Ch-ơng IV Tối -u hóa sản xuất axit acetic từ tinh bột sắn 37 Phần V Kết luận đề nghị 49 Tài liệu tham khảo 51 Phạm Thị H¶i Thu 52 ... lớn Từ đà chọn đề tài "Sản xuất axit acetic từ tinh bột sắn ph-ơng pháp lên men vi sinh vật" Mục tiêu: Sản xuất axit acetic ph-ơng pháp lên men vấn đề mà công nghệ sinh học (CNSH) công nghệ vi sinh. .. di truyền - Vi sinh Ph-ơng pháp lên men truyền thống, từ nguyên liệu lên men r-ợu, ch-ng cất r-ợu dung dịch r-ợu đ-ợc dùng làm nguyên liệu để sản xuất axit acetic, vi? ??c sản xuất axit acetic trực... Acetobacter ứng dụng sản xuất axit acetic Vi? ??t Nam đà bắt đầu nghiên cứu ứng dụng sản xuất axit acetic ph-ơng pháp vi sinh vật với quy mô công nghiệp nhà máy sản xuất axit hữu Vi? ??t Nam đà có công