Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây diệp hạ châu (phyllanthus urinaria l ) bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC MSMS)

TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG PHYLLANTHIN, HYPOPHYLLANTHIN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus urinaria L.) BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) Đồn Mạnh Dũng1, Nguyễn Hữu Tùng2, Nguyễn Đình Luyện3 Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia H| Nội Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế Email: doanmanhdung151090@gmail.com Ngày nhận bài: 25/10/2018; ngày hoàn thành phản biện: 7/12/2018; ngày duyệt đăng: 10/12/2018 TÓM TẮT Bằng c{c phương ph{p sắc ký, ph}n lập hợp chất phyllanthin v| hypophyllanthin từ c}y Diệp hạ ch}u (Phyllanthus urinaria L.) Cấu trúc hợp chất n|y x{c định c{c phương ph{p phổ 1H-NMR, 13C-NMR ESI-MS) Hợp chất n|y tinh (độ tinh khiết > 99,8%) hệ thống sắc ký lỏng điều chế, sử dụng để l|m chất chuẩn ph}n tích h|m lượng phyllanthin v| hypophyllanthin c}y Diệp hạ ch}u sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LCMS/MS) Chúng tơi x}y dựng chương trình sắc ký sử dụng hệ thống LCMS/MS sau: pha tĩnh cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm), pha động: MeOH (A) – hỗn hợp dung dịch chứa 10 mM ammonium acetate 0,1% HCOOH (B) theo tỉ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dịng: 0,3 ml/phút thể tích tiêm mẫu: μl; nhiệt độ buồng cột: 35 oC; thời gian ph}n tích 10 phút, dung mơi pha mẫu: MeOH-H2O = 60:40 (v/v) Điều kiện khối phổ bao gồm nguồn ion hóa ESI, loại ion dương, nhiệt độ nguồn ion hóa l| 300 oC, chế độ chạy MRM phyllanthin với ion sơ cấp m/z 436,0 v| ion thứ cấp m/z 151,0, hypophyllanthin với ion sơ cấp m/z 261,0 v| ion thứ cấp m/z 231,0 Phương ph{p ph}n tích chúng tơi sử dụng tối ưu hóa cho qu{ trình ph}n tích hợp chất hypophyllanthin v| phyllanthin c}y Diệp hạ ch}u với độ tuyến tính, độ v| độ x{c cao Từ khóa: Phyllanthus urinaria, phyllanthin, hypophyllanthin, LC-MS/MS MỞ ĐẦU Diệp hạ ch}u thuộc chi Phyllanthus phổ biến Việt Nam với số lượng phong phú Cho đến người ta ph{t chi Phyllanthus L (Euphorbiaceae) có 13 Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) < 700 lo|i, gồm từ c}y th}n thảo đến c}y th}n bụi hay gỗ nhỏ, ph}n bố chủ yếu vùng nhiệt đới v| cận nhiệt đới *1-3+ Th|nh phần hóa học v| t{c dụng chi n|y phong phú v| đa dạng, l| nguồn dược liệu đầy tiềm C{c nghiên cứu cho thấy chất phyllanthin v| hypophyllanthin l| th|nh phần c}y Phyllanthus urinaria L *1+, *4+ C{c chất n|y có t{c dụng l|m gia tăng lượng glutathione có vai trị bảo vệ v| phục hồi tế b|o gan, l|m giảm men gan ức chế men ADN polymerase virus viêm gan B *4+ Vì vậy, Diệp hạ ch}u có t{c dụng tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc men gan uống rượu, bia Chính nghiên cứu x{c định h|m lượng hypophyllanthin v| phyllanthin c}y Diệp hạ ch}u có ý nghĩa quan trọng việc x{c định chất lượng dược liệu Diệp hạ ch}u v| c{c chế phẩm thuốc từ Diệp hạ ch}u THỰC NGHIỆM 2.1 Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao LC-MS/MS Agilent Technologies 6420 Triple Quad, hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC-DAD) Agilent 1290, cột sắc ký EC-C18 (100 × 2,1 mm, 2,7 μm), hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System), cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x 21,2 mm, 5,0 μm), m{y đo điểm nóng chảy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản) Phổ cộng hưởng từ hạt nh}n đo m{y JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản), cột sắc ký c{c loại, c}n ph}n tích OHAUS PA214 độ x{c 0,0001g, bể siêu }m, m{y ly t}m Vortex, m|ng lọc 13 mm, 0,22 μm (PTFE) 2.2 Hóa chất C{c dung môi dùng chiết xuất, ph}n lập methanol (MeOH), chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) đạt tiêu chuẩn công nghiệp v| chưng cất lại trước dùng Dung mơi dùng cho ph}n tích methanol (Merck, Đức), acetonitrile (Merck, Đức), nước cất, acid formic (Merck) Sắc ký cột (CC) sử dụng silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh 20-400 mesh, Merck), Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng mỏng nhôm tr{ng sẵn silica gel 60 F254 (1,05554; Merck) Ph{t chất đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm v| 365 nm dùng thuốc thử I2 2.3 Nguyên liệu thực vật Diệp hạ ch}u (Phyllanthus urinaria L.) thu h{i Nghệ An, Việt Nam v|o th{ng 10 năm 2017 C{c mẫu n|y TS Đỗ Ngọc Đ|i – Trường Đại học Kinh tế kĩ thuật Nghệ An định danh tên khoa học v| tiêu lưu trữ Viện Hóa học C{c hợp chất thiên nhiên, Viện H|n l}m Khoa học v| Cơng nghệ Việt Nam 14 TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) 2.4 Chiết xuất phân lập Phần mặt đất c}y Diệp hạ ch}u (2,0 kg), phơi khô, xay nhỏ v| ng}m chiết siêu }m với methanol 500C (lặp lại lần) Dịch chiết cất thu hồi dung môi thu cao methanol (502 gam) Ph}n bố cao methanol nước, sau chiết lỏng/lỏng với cloroform v| n-butanol Cất thu hồi dung môi thu c{c cặn dịch chiết l| 255g v| 95g Cao chloroform ph}n t{ch sắc ký cột nhồi silicagel, dung môi rửa giải l| chloroform/methanol (99/1; 40/1; 30/1; 20/1) thu 10 ph}n đoạn Ph}n đoạn (12 g) tiến h|nh sắc ký cột nhồi silicagel, chloroform:methanol (10:1) thu chất hypophyllanthin 450 mg Ph}n đoạn (22,3 g) tiến h|nh sắc ký cột nhồi silicagel, chloroform:methanol (8:1) thu phyllanthin 302 mg Hai hợp chất n|y tinh (độ tinh khiết > 99,8%) hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System) pha tĩnh cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x 21,2 mm, 5,0 μm), pha động: MeOH–H2O thời gian phút với tỉ lệ 70:30 (v/v), tốc độ dòng 15,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 100,0 μL; dung mơi pha mẫu: MeOH-H2O (70:30, v/v) Hypophyllanthin: Tinh thể hình kim, m|u trắng, nhiệt độ nóng chảy 128-130oC; ESIMS m/z: 431 [M+H]+ (tương ứng với công thức ph}n tử C24H30O7); 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ 6,45 (1H, s, H-2), 2,78 (2H, dd, 16,0, 4,5Hz, H-7), 2,61 (1H, dd, J = 15,5, 11,0, H7), 1,85 (1H, m, H-8), 3,18 (1H, dd, J = 9,5, 6,2, H-9), 3,27 (1H, dd, J = 9,5, 4,2, H-9), 6,63 (1H, d, J = 2,0, H-2’), 6,80 (1H, d, J = 8,0, H-5’), 6,65 (1H, dd, J = 8,5, 2,0, H-6’), 3,95 (1H, d, J = 7,5, H-7’), 1,77 (1H, m, H-8’), 3,16 (1H, dd, J = 9,5, 3,5, H-9’), 3,29 (1H, dd, J = 9,5, 1,0, H-9’), 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 3,25 (3H, s, 9-OCH3), 3,67 (3H, s, 3’-OCH3), 3,70 (3H, s, 4’OCH3), 3,21 (3H, s, 9’-OCH3), 5,69 (1H, d, J = 1,4, O-CH2-O), 5,71 (1H, d, J = 1,4, O-CH2O); 13C-NMR (100 Hz, CD3O D): δ 131,7 (C-1), 106,7 (C-2), 141,7 (C-3), 132,8 (C-4), 146,5 (C-5), 114,5 (C-6), 32,7 (C-7), 36,6 (C-8), 74,7 (C-9), 137,9 (C-1’), 112,1 (C-2’), 148,3 (C-3’), 147,0 (C-4’), 111,6 (C-5’), 119,9 (C-6’), 41,1 (C-7’), 44,7 (C-8’), 71,6 (C-9’), 56,1 (3-OCH3), 58,3 (9-OCH3), 55,4 (3’-OCH3), 55,5 (4’- OCH3), 58,4 (9’- OCH3), 100,6 (O-CH2-O) Phyllanthin: tinh thể hình kim m|u trắng; nhiệt độ nóng chảy 94-96oC; ESI-MS m/z 421 [M+H]+ (tương ứng với công thức ph}n tử C24H36O6) 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ 6,63 (1H, br s, H-2), 6,76 (1H, d, J = 8,0, H-5), 6,65 (1H, br d, J = 8,0, H-6), 2,64 (1H, m, H7), 2,05 (1H, m, H-8), 3,31 (1H, m, H-9), 6,63 (1H, br s, H-2’), 6,76 (1H, d, J = 8,0, H-5’), 6,65 (1H, br d, J = 8,0, H-6’), 2,64 (1H, m, H-7’), 2,05 (1H, m, H-8’), 3,31 (1H, m, H-9’), 3,82 (3H, s, 3-OCH3), 3,87 (3H, s, 4-OCH3), 3,31 (3H, s, 9-OCH3), 3,82 (3H, s, 3’-OCH3), 3,87 (3H, s, 4’-OCH3), 3,31 (3H, s, 9’-OCH3) 13C-NMR (100 Hz, CD3OD): δ 133,7 (C-1), 112,3 (C-2), 148,8 (C-3), 147,3 (C-4), 111,2 (C-5), 121,3 (C-6), 34,7 (C-7), 40,9 (C-8), 72,7 (C-9), 133,7 (C-1’), 112,3 (C-2’), 148,8 (C-3’), 147,3 (C-4’), 111,2 (C-5’), 121,3 (C-6’), 34,7 (C-7’), 40,9 (C-8’), 72,7 (C-9’), 55,8 (3-OCH3), 55,7 (C-4’), 58,9 (9-OCH3), 55,8 (3’-OCH3), 55,7 (4’OCH3), 58,9 (9’- OCH3) 15 Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) < 2.5 Điều kiện, thơng số tối ưu cho phân tích Trên sở ph}n tích t|i liệu tham khảo *5+, *7+ v| khảo s{t th|nh phần pha động, tỷ lệ dung mơi, tốc độ dịng, chúng tơi x}y dựng chương trình sắc ký sử dụng hệ thống UPLC Agilent 1290 Infinity sau: pha tĩnh cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm), pha động: MeOH (A) – dung dịch chứa 10 mM ammonium acetate 0,1% HCOOH (B) theo tỉ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dòng: 0,3 ml/phút thể tích tiêm mẫu: μl; nhiệt độ buồng cột: 35 oC; thời gian ph}n tích 10 phút, dung môi pha mẫu: MeOH-H2O = 60:40 (v/v) Điều kiện khối phổ bao gồm nguồn ion hóa ESI, loại ion dương, nhiệt độ nguồn ion hóa l| 300 oC, chế độ chạy MRM, phyllanthin với ion sơ cấp m/z 436,0 ion thứ cấp m/z 151,0, hypophyllanthin với ion sơ cấp m/z 261,0 v| ion thứ cấp m/z 231,0 Hình Sắc ký đồ chuẩn hypophyllanthin v| phyllanthin 2.6 Chuẩn bị mẫu phân tích C}n x{c lượng c}y Diệp hạ ch}u sau nghiền nhỏ (từ 0,03-0,04 g), thêm 20 ml dung dịch MeOH-H2O = 70:30 (v/v) tiến h|nh chiết siêu }m 40oC giờ, thu dịch chiết (lặp lại lần) Cô quay thu hồi dung môi {p suất thấp thu cao chiết sau định mức dung mơi MeOH-H2O 60:40 (v/v) bình định mức 100 ml Sau đó, lọc qua m|ng 0,22 μm, cuối bơm v|o hệ thống LC-MS/MS [6], [7] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định cấu trúc Hypophyllanthin: Tinh thể hình kim, m|u trắng, nhiệt độ nóng chảy 128-130oC Phổ khối lượng ESI hợp chất cho peak ion m/z 431 [M+H]+ tương ứng với công thức ph}n tử C24H30O7 Dữ liệu phổ 1H-NMR cho thấy hợp chất có nhóm metylen gắn với hai oxygen (-OCH2O-), ba nhóm metylen, nhóm metin v| năm nhóm metoxyl 16 TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) Phổ 13C-NMR, DEPT cho c{c tín hiệu tương ứng với 24 carbon bao gồm nhóm – OCH3, nhóm –CH2, nhóm –CH, nhóm carbon bậc bốn Từ c{c số liệu kết hợp so s{nh với t|i liệu tham khảo cho ta hợp chất l| hypophyllanthin Hợp chất n|y ph}n lập từ c}y Phyllanthus niruri Phyllanthus urinaria *5+, có hoạt tính kh{ng virut viêm gan B mạnh *1+, [5] Phyllanthin: tinh thể hình kim m|u trắng, nhiệt độ nóng chảy 94-96oC Phổ 1H-NMR cho tín hiệu 17 proton nhóm metin, hai nhóm metylen nhóm metoxyl Phổ 13C-NMR, DEPT cho tín hiệu tương ứng với 12 carbon bao gồm nhóm – OCH3, nhóm –CH2, nhóm –CH, cịn lại carbon bậc bốn Nó l| ligan gồm mảnh giống ghép lại v| công thức ph}n tử l| C24H34O6 So s{nh với t|i liệu tham khảo ta khẳng định hợp chất n|y l| phyllanthin Hợp chất n|y phân lập từ Phyllanthus niruri Phyllanthus urinaria [5], có hoạt tính kháng virut viêm gan B mạnh [1], [5] Hypophyllanthin Phyllanthin Hình Cấu trúc hóa học hợp chất c}y Diệp hạ ch}u 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích a Kiểm tra độ tinh khiết Sử dụng phương ph{p tổng diện tích peak tính to{n độ tinh khiết mẫu ph}n tích Tiến h|nh sắc ký theo chương trình trên, ph}n tích c{c peak phụ (tạp chất) sắc ký đồ v| tính độ tinh khiết hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (UPLCDAD) Agilent 1290, pha tĩnh: cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm), pha động: MeOH (A) – dung dịch chứa 10 nM ammonium acetate v| 0,1% HCOOH (B) theo tỉ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dịng: 0,3 ml/min; thể tích tiêm mẫu: 10 μl; nhiệt độ buồng cột: 30 oC; bước sóng ph{t hiện: 230 nm; thời gian ph}n tích 10 phút; dung môi pha mẫu: MeOH:H2O - 60:40 (v/v) Kết cho thấy phyllanthin v| hypophyllanthin tinh chế có độ tinh khiết cao (>99,8%) phù hợp l|m chất chuẩn ph}n tích, chất chuẩn đối chiếu C{c peak phụ (tạp chất) t{ch rõ r|ng khỏi peak chất ph}n tích b Tính đặc hiệu Tiến h|nh sắc ký c{c loại mẫu trắng v| mẫu ph}n tích hypophyllanthin v| phyllanthin theo chương trình khảo s{t trên, ghi lại sắc ký đồ, x{c định thời gian lưu v| phổ UV peak hypophyllanthin v| phyllanthin sắc ký đồ Kết cho thấy sắc ký đồ dung môi pha mẫu không xuất peak khoảng thời gian 17 Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) < lưu tương ứng với thời gian lưu hypophyllanthin (tR = 7,042 phút) phyllanthin (tR = 8,088 phút (Hình 1) Vậy phương ph{p ph}n tích hypophyllanthin phyllanthin x}y dựng có độ đặc hiệu cao c Tính thích hợp hệ thống Tiến h|nh bơm lần dung dịch chuẩn phyllanthin (nồng độ 10 ppm) v| hypophyllanthin (nồng độ 15 ppm) ghi lại c{c sắc ký đồ v| x{c định gi{ trị thời gian lưu, diện tích peak Kết cho thấy độ lệch chuẩn tương đối c{c thông số thấp % Điều cho thấy c{c điều kiện sắc ký lựa chọn v| hệ thống sắc ký LC-MS/MS sử dụng l| ổn định, phù hợp cho phép ph}n tích định tính, định lượng phyllanthin, hypophyllanthin mẫu Diệp hạ ch}u Thí nghiệm Bảng Kết khảo s{t tính thích hợp hệ thống sắc ký Hypophyllanthin Phyllanthin Thời gian Diện tích Hệ số đối Thời gian Diện tích lưu peak xứng lưu peak 7,042 262,6327 0,98 8,088 300,7612 7,997 6,889 263,1130 1,01 301,1024 6,903 262,3435 1,02 6,887 261,9856 6,901 260,9899 6,890 TB RSD (%) Hệ số đối xứng 1,01 0,99 300,5615 0,99 1,01 7,976 8,003 301,2019 1,02 0,98 7,999 302,0199 0,98 264,1241 0,99 7,989 299,9845 1,03 6,918 262,5315 0,99 8,008 300,9386 1,00 0,8 0,3 1,8 0,19 1,64 0,5 d Độ tuyến tính Chuẩn bị c{c dung dịch chuẩn có nồng độ 0,05-30 μg/ml (ppm) c{ch pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với c{c hệ số pha loãng kh{c Tiến h|nh sắc ký c{c dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm lần), ghi lại sắc ký đồ v| x{c định diện tích peak tương ứng X{c định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính nồng độ chất ph}n tích v| diện tích peak tương ứng sắc ký đồ phương ph{p bình phương tối thiểu Kết phương trình hồi quy tuyến tính thu với hypophyllanthin v| phyllanthin có hệ số x{c định v| hệ số tương quan cao, độ tuyến tính chặt, khoảng tuyến tính rộng 18 TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) Hình Đồ thị biểu diễn đường chuẩn Phyllanthin Hình Đồ thị biểu diễn đường chuẩn Hypophyllanthin e Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn ph{t hiện: tiến h|nh pha loãng mẫu ph}n tích phyllanthin hypophyllanthin đến tín hiệu chất ph}n tích sắc ký đồ thu có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3 Nồng độ x{c định l| giới hạn ph{t (LOD) phương ph{p ứng với chất Giới hạn định lượng (LOQ) phương ph{p x{c định dựa giới hạn ph{t hiện: LOQ = 3,3 x LOD Kết ph}n tích cho thấy phương ph{p có giới hạn ph{t với phyllanthin hypophyllanthin l| 0,10 ppb 0,15 ppb, tương ứng có giới hạn định lượng l| 0,33 ppb 0,50 ppb g Độ Độ phương ph{p ph}n tích phyllanthin, hypophyllanthin x{c định thơng qua độ thu hồi (Recovery) theo công thức: Re v(%)  C2  C1 100 Co Trong đó, C0 l| nồng độ chất ph}n tích thêm v|o mẫu thật; C1 l| nồng độ chất ph}n tích mẫu thật; C2 l| nồng độ chất ph}n tích mẫu thật thêm chuẩn Độ 19 Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) < thu hồi phương ph{p x{c định c{ch tiến h|nh xử lý c{c mẫu ph}n tích (lặp lại lần) theo quy trình mục 2.6 thêm lượng x{c định chất chuẩn sau tiến h|nh ph}n tích ba lần lặp lại, tính kết trung bình Kết độ thu hồi phương ph{p nêu Bảng 1, Bảng Kết đ{nh gi{ độ phương ph{p x{c định phyllanthin mẫu nghiên Mẫu Nồng độ phyllanthin mẫu (mg) Lá 0,0439 cứu Nồng độ phyllanthin thêm v|o mẫu (mg) 0,01 Thân 0,0050 0,005 0,0102 104,0 Rễ 0,0039 0,005 0,0087 96,0 Nồng độ phyllanthin sau thêm v|o mẫu (mg) 0,0537 Độ thu hồi, % (Rev, %) 98,0 Bảng Kết đ{nh gi{ độ phương ph{p x{c định hypophyllanthin mẫu Mẫu Nồng độ hypophyllanthin mẫu (mg) nghiên cứu Nồng độ hypophyllanthin thêm v|o mẫu (mg) Lá 0,2748 Thân Rễ Độ thu hồi, % (Rev, %) 0,01 Nồng độ hypophyllanthin sau thêm v|o mẫu (mg) 0,2847 0,0166 0,01 0,0268 102,0 0,0029 0,005 0,0077 96,0 99,0 Từ kết tính to{n bảng 1, cho thấy, phương ph{p x{c định h|m lượng phyllanthin hypophyllanthin có độ thu hồi đạt từ 96,0 đến 104,0%, phù hợp yêu cầu AOAC Vậy, phương ph{p LC-MS/MS đạt độ tốt, nên {p dụng để ph}n tích phyllanthin hypophyllanthin mẫu c}y Diệp hạ ch}u 3.3 Phân tích phyllanthin, hypophyllanthin mẫu Diệp hạ châu H|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin c{c mẫu Diệp hạ ch}u x{c định với c{c điều kiện tối ưu v| theo phương ph{p đường chuẩn x}y dựng mục 2.5 v| 2.6 [p dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính x}y dựng v| phương ph{p nội suy để ph}n tích h|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin c{c mẫu dược liệu, kết nghiên cứu trình b|y bảng 3, Từ c{c kết bảng 3, cho thấy, phương ph{p LC-MS/MS ph}n tích c{c mẫu c}y Diệp hạ ch}u đạt độ lặp lại tương đối tốt Như vậy, phương ph{p ph}n tích có độ lặp lại cao, phù hợp để x{c định phyllanthin, hypophyllanthin mẫu c}y Diệp hạ ch}u Bảng Kết ph}n tích h|m lượng phyllanthin H|m lượng phyllanthin đo được, mg/g Mẫu Lá Lần Lần Lần Trung bình ± SD RSD (%) 0,0439 0,0436 0,0443 0,0439±0,0004 0,8 20 1/2.RSDH (%) 4,5 TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Thân Rễ Mẫu Lá Thân Rễ 0,0050 0,0039 0,0048 0,0037 0,0054 0,0041 0,0051±0,0003 0,0039±0,0002 Lần 0,2748 0,0166 0,0029 Bảng Kết ph}n tích h|m lượng hypophyllanthin H|m lượng hypophyllanthin đo được, mg/g Lần Lần Trung bình ± SD RSD (%) 0,2744 0,2751 0,2748±0,0004 0,1 0,0163 0,0171 0,0167±0,0004 2,4 0,0030 0,0027 0,0029±0,0002 5,3 a Sắc ký đồ mẫu Diệp hạ châu b Sắc ký đồ mẫu thân Diệp hạ châu 21 6,0 5,1 Tập 13, Số (2018) 6,3 6,5 1/2.RSDH (%) 3,4 5,2 6,8 Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) < c Sắc ký đồ mẫu rễ Diệp hạ châu Hình Sắc ký đồ c{c mẫu ph}n tích KẾT LUẬN Bằng c{c phương ph{p sắc ký, ph}n lập hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin từ c}y Diệp hạ ch}u (Phyllanthus urinaria L.) Cấu trúc hợp chất n|y x{c định dựa sở c{c số liệu phổ công hưởng từ hạt nh}n 1H-NMR, 13C-NMR v| phổ khối lượng ESI-MS) Hợp chất n|y tinh (độ tinh khiết > 99,8%) hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System), sử dụng để l|m chất chuẩn ph}n tích h|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin mẫu c}y Diệp hạ ch}u phương ph{p sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS) Kết cho ta thấy h|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin tập trung chủ yếu l{, h|m lượng hypophyllanthin cao phyllanthin Cần tiếp tục nghiên cứu ph}n lập v| x{c định h|m lượng c{c hợp chất có hoạt tính sinh học kh{c từ c}y Diệp hạ châu để đ{nh gi{ đầy đủ cho Diệp hạ ch}u v| c{c chế phẩm thuốc có nguồn gốc từ Diệp hạ ch}u TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nh| xuất Khoa học v| Kỹ thuật, H| Nội [2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam (Bộ mới), Nhà xuất Y học, H| Nội [3] Phạm Ho|ng Hộ (1992), Cây cỏ Việt Nam, Nh| xuất Trẻ, H| Nội [4] Calixto J B., Santos A R., Cechinel F V., Yunes R A (1998), A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential, Med Res Rev., 18(4), 225-58 22 TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 13, Số (2018) [5] Vandana S., Manju S., Richa M., Karuna S., Ram K V., Madan M G., Anil K G., Suman P S K (2008), Separation and quantification of lignans in Phyllanthus species by a simple chiral densitometric method, J Sep Sci., 31, 47-55 [6] Tripathi A K., Verma R K., Gupta A K., Gupta M M., Khanuja S P.,(2006), Quantitative determination of phyllanthin and hypophyllanthin in phyllanthus species by highperformance thin layer chromatography, Phytochem Anal 17(6): 394–397 [7] Fan H., Zhang W., Wang J., Lv M., Zhang P., Zhang Z., Xu F (2015), HPLC–MS/MS method for the determination of four lignans from Phyllanthus urinaria L in rat plasma and its application, Bioanalysis, 7(6), 701–712 ISOLATION AND QUANTITY DETERMINATION OF PHYLLANTHIN, HYPOPHYLLANTHIN FROM Phyllanthus urinaria L BY LIQUID CHROMATOGRAPHY- MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS) Doan Manh Dung1, Nguyen Huu Tung2, Nguyen Dinh Luyen3 Faculty of Chemistry, University of Sciences, Hue University School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University, Hanoi Faculty of Chemistry, University of Education, Hue University *Email: doanmanhdung151090@gmail.com ABSTRACT By using chromatography methods, we isolated principal compound of phyllanthin and hypophyllanthin from Phyllanthusurinaria L Its structure was determined on the basis of spectroscopic data ( 1H-NMR, C-NMR and ESI-MS 13 mass spectra) This compound is purified (purity > 99,8%) by Agilent 218 purification system, which was used as standard for analyzing phyllanthin, hypophyllanthin in samples The liquid chromatography (LC-MS/MS) with chromatography column: EC-C18 (100 x 2.1 mm, 2.7 μm), mobile phase: MeOH (A) –Slution (10mM ammonium acetate and 0,1% formic acid ) (B) (v/v = 60/40), flow: 0,3 ml/min, injection volume: 1μL,Quantifcation was performed using multiple reaction monitoring (MRM) at transitions of m/z 261→231 for hypophyllanthin and m/z 436→151 for phyllanthin We used the optimized analytical method for determining rapidly two active compounds hypophyllanthin and phyllanthinin Phyllanthusurinaria L with good linearity, precision and accuracy using LC-MS/MS technique Keywords: Phyllanthusurinaria, phyllanthin, hypophyllanthin, LC-MS/MS 23 Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) < Đoàn Mạnh Dũng sinh ng|y 15/10/1990 H| Tĩnh Năm 2008, ông tốt nghiệp cử nh}n ng|nh Sư phạm Hóa học trường Đại học Vinh Năm 2014, ông tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ng|nh Hóa Hữu Trường Đại học Vinh Từ năm 2015 đến nay, ông l| nghiên cứu sinh tiến sĩ chun ng|nh Hóa ph}n tích trường Đại học khoa học, Đại học Huế Lĩnh vực nghiên cứu: hóa ph}n tích, hóa hữu cơ, hóa học c{c hợp chất thiên nhiên Nguyễn Hữu Tùng sinh năm 1982 Bắc Ninh Ông tốt nghiệp Đại học B{ch khoa H| Nội năm 2005 v| đạt học vị Tiến sĩ Dược học năm 2010 Đại học Quốc gia Chungnam, H|n Quốc Từ 2010 đến 2015, ông l|m nghiên cứu sau tiến sĩ Đại học Quốc tế Nagasaki, Nhật Bản Ơng giảng viên thuộc Bộ mơn Hóa dược & Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược Đại học Quốc gia H| Nội từ 2015 Lĩnh vực nghiên cứu: ph{t triển dược liệu c}y thuốc, x{c định c{c hoạt chất từ đa dạng nguồn dược liệu Nguyễn Đình Luyện sinh ngày 22/01/1965 Quảng Bình Năm 1986, ơng tốt nghiệp cử nh}n sư phạm Hóa học trường Đại học Sư phạm Huế v| Trường giữ lại l|m CBGD từ đến Ơng bảo vệ luận {n Tiến sĩ năm 1999 v| nh| nước cơng nhận Phó gi{o sư năm 2009 Hiện l| Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế Lĩnh vực nghiên cứu: hóa phân tích 24 ... Sắc ký đồ mẫu Diệp hạ châu b Sắc ký đồ mẫu thân Diệp hạ châu 21 6,0 5,1 Tập 13, Số (201 8) 6,3 6,5 1/2.RSDH ( %) 3,4 5,2 6,8 Phân tích hàm l? ?ợng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus. .. ph{p LC-MS/MS đạt độ tốt, nên {p dụng để ph}n tích phyllanthin hypophyllanthin mẫu c}y Diệp hạ ch}u 3.3 Phân tích phyllanthin, hypophyllanthin mẫu Diệp hạ châu H|m l? ?ợng phyllanthin, hypophyllanthin. .. khoảng thời gian 17 Phân tích hàm l? ?ợng phyllanthin, hypophyllanthin Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L. ) < l? ?u tương ứng với thời gian l? ?u hypophyllanthin (tR = 7,042 phút) phyllanthin (tR = 8,088