Nghiên cứu tái cơ cấu sử dụng đất tại huyện tây hòa, tỉnh phú yên

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu, số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Hoàng Thị Thùy Nhung ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đinh Thị Bích Lân, Ngun Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, kinh phí để giúp tơi thực hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Bộ môn Miễn dịch học Vắc xin - Viện Công nghệ sinh học đặc biệt Th.S Đặng Thanh Long, Th.S Lê Quốc Việt, bảo, giúp đỡ tận tình cho tơi q trình thực nghiệm chia kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc chuyên ngành Thú Y – Khoa Chăn nuôi Thú y, thầy giáo Phịng đào tạo sau đại học, Trường Đại học Nông Lâm Huế với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Đại học Huế bảo tạo điều kiện giúp đỡ học tập hồn thành đề tài nghiên cứu Cơng trình hồn thành với kinh phí từ đề tài cấp Đại học Huế BSTY Lê Công Thịnh – Bộ môn Miễn dịch học Vắc xin - Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế làm chủ nhiệm: “Nghiên cứu tạo dòng biểu gen độc tố không chịu nhiệt độc tố chịu nhiệt, tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh E coli lợn” Mã số: DHH2016-15-05 Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Tác giả luận văn Hồng Thị Thùy Nhung iii TĨM TẮT Tiêu chảy bệnh gây thiệt hại kinh tế không nhỏ cho ngành chăn nuôi, đặc biệt chăn nuôi lợn Trong nguyên nhân gây nên tiêu chảy lợn, vi khuẩn E coli với yếu tố độc lực đóng vai trị vơ lớn Độc tố LTa độc tố đường ruột E coli tiết ra, có tác dụng kích thích lớp niêm mạc bên biểu mô ruột tiết ion Cl vượt mức bình thường ngăn cản hấp thu NaCl, kéo theo di chuyển thụ động nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy Nghiên cứu phân lập gen eltA , tạo dòng, biểu khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp LTa, sở cho việc sản xuất ứng dụng việc phòng trừ bệnh tiêu chảy E coli gây lợn sau cai sữa Trong nghiên cứu này, đoạn gen eltA mã hóa cho kháng nguyên LTa tạo dịng vào plasmid pGEM®-T easy biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli TOP10 Thể biến nạp sàng lọc thạch đĩa LB+Ampicilin+IPTG+Xgal Những khuẩn lạc có màu trắng chứng tỏ phản ứng gắn tạo dịng thành cơng, đoạn gene mong muốn chèn vào vector tạo dòng, khuẩn lạc màu xanh âm tính Tách chiết plasmid từ dịng khuẩn lạc dương tính, chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu gene eltA cặp mồi M13 (được thiết kế sẵn vector pGEM®-T easy) Tiến hành giải trình tự nucleotid trình tự amino acid, so sánh với trình tự công bố ngân hàng Gene Tinh ADN từ gel agarose 1% (từ sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gene eltA) ADN tinh gắn vào vector biểu pET200/D-TOPO biến nạp vào vi khuẩn E coli BL21(DE3) Tìm điều kiện tối ưu môi trường nuôi cấy, mật độ tế bào ban đầu, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG, thời gian biểu biểu etlA Sản phẩm biểu kiểm chứng điện di biến tính gel polyacrylamid (SDS - PAGE) Kết quả: tạo dịng thành cơng gene eltA vi khuẩn E coli TOP10, chứng minh biểu gen eltA phương pháp SDS - PAGE; Tìm điều kiện tối ưu biểu eltA: môi trường nuôi cấy YJ; mật độ tế bào ban đầu OD600 0,8; nhiệt độ nuôi cấy 250C; nồng độ IPTG 0,8 mM; thời gian nuôi cấy iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG .ix DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1) Ý nghĩa khoa học: .2 2) Ý nghĩa thực tiễn: CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI 1.1.1 Hình thái 1.1.2 Đặc tính ni cấy 1.1.3 Đặc tính sinh hóa 1.1.4 Phân loại 1.1.5 Sức đề kháng 1.1.6 Các yếu tố độc lực E coli 1.1.7 Vai trò vi khuẩn E coli hội chứng tiêu chảy lợn 17 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ GENE ĐỘC TỐ LT CỦA VI KHUẨN E COLI 17 1.2.1 Những nghiên cứu nước 17 1.2.2 Những nghiên cứu giới 18 1.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E COLI 19 1.3.1 Chủng E coli TOP10 22 1.3.2 Chủng E coli BL21 (DE3) 22 v 1.3.3 Hệ thống vector tạo dịng pGEM®-T easy 23 1.3.4 Hệ thống vector biểu pET 25 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GENE TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VẬT CHỦ 27 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 29 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.3.1 Thu thập mẫu phân lợn tiêu chảy 29 2.3.2 Tách chiết ADN tổng số 30 2.3.3 Phân lập gene eltA phản ứng PCR 30 2.3.4 Phương pháp tách dòng lưu giữ nguồn gene 32 2.3.5 Biểu gen vector pET200/D-TOPO .34 2.3.6 Điện di SDS- PAGE 35 2.3.7 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp 36 2.3.8 Nghiên cứu Ảnh hưởng số yếu tố lên khả sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp 36 2.3.9 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố lên khả biểu kháng nguyên LTa 38 2.3.10 Phương pháp sắc ký lọc gel cột Ni-NTA 39 2.3.11 Xử lí thống kê 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ VI KHUẨN E COLI 40 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE eltA BẰNG PHẢN ỨNG PCR 40 3.3 KẾT QUẢ TẠO DỊNG GENE eltA VÀO VECTOR PGEM®-T EASY VÀ BIẾN NẠP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ E COLI TOP10 41 3.4 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE eltA 43 vi 3.5 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GENE eltA MÃ HÓA TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E COLI BL21 (DE3) 45 3.6 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP 47 3.7 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP 48 3.7.1 Ảnh hưởng môi trường khác 48 3.7.2 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống khác 49 3.7.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc khác 49 3.8 KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG CHỦNG E COLI BL21(DE3) 51 3.8.1 Kết thăm dò thời gian cảm ứng tối ưu 51 3.8.2 Kết thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu 51 3.8.3 Kết thăm dị thành phần mơi trường tối ưu 52 3.8.4 Kết thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu 53 3.8.5 Kết thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl Microliter 6xHis Homooligohistidine APS Ammonium persulphate Bp Cặp bazơ (Base pair) BSA Bovine serum albumin Cs Cộng DAEC E coli bám dính phân tán (Diffusely adherent Escherichia coli) AND Deoxyribonucleic acid Dntp Deoxyribonucleotid EAEC E coli đường ruột (Enteroaggregative Escherichia coli) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid EHEC E coli gây xuất huyết ruột (Enterohaemorrhagic Escherichia coli) EIEC E coli xâm nhập ruột (Enteroinvasive Escherichia coli) EPEC E coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli) ETEC E coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic Escherichia coli) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid kDa Kilo Dalton LB Luria-Broth LT Độc tố không chịu nhiệt (Labile toxin) MAEC E coli gây viêm màng não (Meningitidis-associated Escherichia coli) Ml Milliliter mM Millimol nm Nanometer OD Mật độ quang (Optical density) PCR Chuỗi phản ứng trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SOB Super Optimal Broth viii SOC Super Optimal broth ST Độc tố chịu nhiệt (Stabile toxin) TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus TB Terrific Broth TE Tris EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine TNE Tris HCL-NaCl-EDTA UPEC E coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu (Uropathogenic Escherichia coli) VT Độc tố gây độc tế bào Vero (Verocytocin) YJ Yang Jijian ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh hệ thống tế bào vật chủ sản xuất protein tái tổ hợp .20 Bảng 1.2 Thành phần plasmid pGEM®-T easy 25 Bảng 2.1 Trình tự nucleotid cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA 31 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR phân lập gene eltA E coli 31 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng gắn .33 Bảng 2.4 Công thức gel polyacrylamide 15% 35 Bảng 3.1 Sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng ngun LTa mơi trường khác 48 Bảng 3.2 Sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa tỷ lệ tiếp giống khác 49 Bảng 3.3 Sinh trưởng chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa tốc độ lắc khác 50 x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 E coli Hình 1.2 Cấu trúc độc tố LT Hình 1.3 Cơ chế gây tiêu chảy độc tố LT Hình 1.4 Cấu trúc bậc độc tố ST Hình 1.5 Cơ chế gây tiêu chảy độc tố STa Hình 1.6 Cơ chế gây tiêu chảy độc tố STb 10 Hình 1.7 Cấu trúc bậc độc tố EAST1 11 Hình 1.8 Cơ chế tác động độc tố VT .13 Hình 1.9 Cấu trúc kháng nguyên O .14 Hình 1.10 Cơ chế biểu hệ thông pET tế bào E coli BL21 (DE3) .22 Hình 1.11 Trình tự cấu trúc vector pGEM®-T easy .24 Hình 1.12 Cấu trúc Vector pET200/D-TOPO 26 Hình 1.13 Tương tác protein dung hợp chứa 6xHis giá thể gắn Nikel 26 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 31 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm khả sinh trưởng E coli tái tổ hợp 37 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu biểu kháng nguyên LTa 38 Hình 2.4 Sơ đồ Tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis hệ thống cột sắc ký lực Ni-NTA 39 Hình 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn E coli .40 Hình 3.2 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA gel agarose 1% 40 Hình 3.3 Kết biến nạp môi trường chọn lọc 41 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ dịng dương tính kết PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA từ khuôn mẫu ADN plasmid tái tổ hợp thu gel agarose 1% 42 Hình 3.5 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 gel agarose 1% 43 Hình 3.6 Mức độ tương đồng gene eltA nhóm đề tài phân lập với gene eltA công bố (K01995.1 ) 44 52 IPTG chất cảm ứng T7 promoter promoter điều khiển trực tiếp trình sinh tổng hợp LTa Vì nghiên cứu ảnh hưởng dãy nồng độ IPTG khác điều cần thiết IPTG khảo sát dải nồng độ từ 0,2 đến mM Kết (Hình 3.12) cho thấy, sau cảm ứng IPTG dòng tái tổ hợp tổng hợp lượng lớn protein có kích thước khoảng 30 kDa, với kích thước dự đoán gene tái tổ hợp Hàm lượng protein tổng hợp phụ thuộc vào nồng độ IPTG cảm ứng kDa 25 LTA 15 10 M NC 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 mM Hình 3.12 Ảnh điện di thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG lên biểu kháng nguyên tái tổ hợp LTa gel 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) NC: E coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng 370C 0,2; 0,4; 0,6, 0,8; 1,0; 1,2; 1,5 2,0: nồng độ chất cảm ứng IPTG Dựa ảnh điện di thấy, mức độ biểu eltA thay đổi theo nồng độ chất cảm ứng IPTG, nuôi cấy chủng E coli BL21(DE3)/pET200/D-TOPO có cảm ứng IPTG có xuất vạch protein có kích thước khoảng 30 kDa, xác định protein dung hợp 6xHis-eltA Trường hợp khơng có vector tái tổ hợp (NC) khơng có biểu protein Khi tăng nồng độ chất cảm ứng IPTG từ 0,2 mM lên 0,8 mM mức độ biểu 6xHis-eltA tương ứng tăng lên Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ chất cảm ứng từ 0,8 mM đến mM mức độ biểu không thay đổi Điều kiện cảm ứng 0,8 mM chọn làm sở cho thí nghiệm nghiên cứu sau Kết phù hợp với kết nghiên cứu Lu cs (2015) tối ưu điều kiện biểu IFN-CSP tế bào E coli BL21 với vector biểu pET-21b 3.8.3 Kết thăm dò thành phần các môi trường tối ưu Thành phần môi trường yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả biểu protein tái tổ hợp Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy mơi trường thích hợp cho nhân giống sinh khối khơng thích hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp Chúng khảo sát khả biểu protein dung hợp 6xHis-eltA 53 loại môi trường với thành phần khác (LB, YJ, TB, HSG M9ZB cải tiến) Thí nghiệm tiến hành điều kiện (cảm ứng với 0,8 mM IPTG, lắc 200 vòng/phút, 37ºC thời gian giờ) gel SDS-PAGE môi trường YJ cho kết biểu kháng nguyên tái tổ hợp LTa tốt nhất, tiếp đến môi trường HSG M9ZB cải tiến, môi trường LB TB khơng thích hợp cho biểu sản xuất kháng ngun tái tổ hợp LTa quy mơ phịng thí nghiệm nên cho hàm lượng kháng nguyên thấp (hình 3.13) Thăm dị thành phần mơi trường biểu cho sản xuất protein tái tổ hợp nhiều tác giả nghiên cứu Chẳng hạn, Đinh Thị Bích Lân cs (2016) cho thấy kháng nguyên 31-E biểu mạnh môi trường LB so với môi trường TB, YJ, SOB SOC , Nguyễn Hoàng Lộc cs (2014) cho thấy mơi trường thích hợp cho biểu kháng nguyên bám dính K88-1NT M9ZB cải tiến kDa 35 LTA 25 15 M HSG NC1 NC2 LB TB M9ZB YJ Hình 3.13 Ảnh điện di thăm dị thành phần mơi trường tối ưu lên biểu kháng nguyên tái tổ hợp LTa gel 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) NC1: E coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng 370C NC2: E coli mang vector tái tổ hợp không bổ sung chất cảm ứng IPTG sinh trưởng 370C M9ZB; HSG; LB; YJ; TB: môi trường biểu có chứa thành phần khác 3.8.4 Kết thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu Mật độ ban đầu yếu tố có liên quan mật thiết đến sinh khối thời gian đạt mật độ cực đại Xác định mật độ ban đầu thích hợp có ý nghĩa sản xuất, giúp ta tiết kiệm thời gian giống Từ lý trên, thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tế bào ban đầu lên biểu kháng nguyên tái tổ hợp LTa đựợc tiến hành Để xác định thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu, tiến hành khảo sát mức khác mật độ tế bào đo lúc bắt đầu cảm ứng từ 0,2 đến Kết thu nhận trình bày hình 3.14 Qua hình ảnh chúng tơi nhận thấy mật độ tế bào thích hợp trước bổ sung chất cảm ứng IPTG (0,8 mM) 50 ml môi trường YJ để thu kháng nguyên tái tổ hợp cao OD600 = 0,8 54 kDa 35 LTA 25 15 10 M NC1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 2,0 3,0 Hình 3.14 Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu lên biểu kháng nguyên tái tổ hợp LTa gel SDS 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) NC: E coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng 370C 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 3,0: mật độ tế bào khác trước bổ sung chất cảm ứng 3.8.5 Kết thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu Trong thí nghiệm khảo sát khả sinh trưởng chủng E coli tái tổ hợp mức nhiệt độ khác 160C, 200C, 250C, 300C, 370C Kết thu hình 3.15 cho thấy 160C, lượng protein biểu cao 250C Vì chọn nhiệt độ 250C để biểu gene tế bào E coli BL21 (DE3) Kết phù hợp với kết Văn Thị Như Ngọc cs (2007) biểu gene HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Hamegglutinnin virus cúm A H5N1 tế bào vi khuẩn E coli BL21 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đưa mốc nhiệt độ tối ưu cho sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp tế bào E coli 300C Hoàng Hà cs (2008) biểu tiểu đơn vị p51 enzyme phiên mã ngược virus HIV, Tương tự, nghiên cứu Lee cs (2006) cho thấy nuôi nhân giống nuôi cảm ứng biểu L-threonine E coli MT201 quy mơ phịng thí nghiệm 300C cho lượng L-threonine cao 55 kDa 35 LTA 25 15 M NC 16ºC 20ºC 25ºC 30ºC 37ºC Hình 3.15 Ảnh điện di thăm dị nhiệt độ cảm ứng tối ưu lên biểu kháng nguyên tái tổ hợp LTa gel SDS 15% M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base) NC: E coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng 370C 160C, 200C, 250C, 300C, 350C 370C: nhiệt độ cảm ứng khác 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN - Tạo dòng xác định trình tự đoạn gene eltA mã hóa tiểu đơn vị A kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LT vi khuẩn E coli có chiều dài 798 bp - Biểu thành cơng gene mã hóa kháng nguyên độc tố LTa với vector pET200/D-TOPO E coli BL21 (DE3) Với môi trường nuôi cấy YJ, tỷ lệ tiếp giống 1%, tốc độ lắc 200 vòng/phút, nuôi cấy sau điều kiện tối ưu để thu sinh khối tế bào vi khuẩn E coli tái tổ hợp - Protein dung hợp 6xHis- LTa có khối lượng phân tử khoảng 30 kDa, biểu mạnh sau cảm ứng 250C với nồng độ IPTG 0,8 mM, môi trường nuôi cấy YJ, mật độ tế bào ban đầu OD600 = 0,8 4.2 ĐỀ NGHỊ - Nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất vắc xin kháng thể lòng đỏ, phục vụ cho việc phòng trị tiêu chảy E coli gây lợn 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hoàng Văn Quốc Chương (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, Huỳnh Văn Kháng (1996), Bệnh lợn nái lợn con, Nhà Xuất Bản Nơng nghiệp, Hà Nội Hồng Hà, Phan Trọng Hồng, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008), Biểu tái tổ hợp tinh tiểu đơn vị p51 enzyme phiên mã ngược virus HIV-1 E coli, Tạp chí cơng nghệ sinh học 6(1), tr 43-48 Nguyễn Xuân Hòa, Lê Văn Phước, Hồ Lê Quỳnh Châu, Lê Xuân Ánh (2010), Xác định gen sinh độc tố vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ lợn bị tiêu chảy, Tạp Chí Nơng Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn, Tập 10, tr 49-51 Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Nguyễn Hoàng Lộc, Giang Thanh Nhã, Nguyễn Quang Vinh, Trần Thúy Lan (2009), Nghiên cứu sản xuất que chẩn đoán nhanh bệnh Toxoplasma gondii gây người gia súc, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, (6), tr 56-61 Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Huỳnh Văn Chương, Đặng Thanh Long, Hoàng Tấn Quảng, Lê Đức Thạo, Lê Quốc Việt, Lê Công Thịnh, Trần Thị Việt Luân (2015), Tạo dòng biểu gen mã hóa kháng nguyên 3-1E từ Eimeria phân lập Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XXIII, (2), tr 55-63 Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Huỳnh Văn Chương, Đặng Thanh Long, Hoàng Tấn Quảng, Lê Đức Thạo, Lê Quốc Việt, Lê Cơng Thịnh, Đặng Thị Hương, Hồng Thị Thùy Nhung (2016), Cải thiện mức độ biểu kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E Eimeria Escherichia coli BL21, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XXII, (7), tr 60-67 Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh, Hoàng Tấn Quảng, Trần Thúy Lan, Lê Mỹ Tiểu Ngọc, Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long (2014), Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu kháng nguyên bám dính K88 tái tổ hợp phân lập từ Escherichia coli mang độc tố đường ruột lợn cai sữa, Tạp chí sinh học, 36 (1se), tr 120-125 Văn Thị Như Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Phước Hải, Trương Văn Dung, Trương Nam Hải (2007), Biểu gen HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Haemaglutinin (HA) virus cúm A H5N1 Escherichia coli, Tạp chí cơng nghệ sinh học, Tập 5, (3), tr 313-320 10 Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Đỗ Ngọc Thúy, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Xuân Huyên, Văn Thị Hường, Đào Thị Hảo (2004), Lựa chọn chủng E coli để chế tạo Autovacxin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn theo mẹ Viện Thú Y 35 năm xây dựng phát triển (1969 -2004) NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 110-111 58 11 Trương Quang (2005), Kết nghiên cứu vai trò gây bệnh E coli hội chứng tiêu chảy lợn 1-60 ngày tuổi, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XII, tr 27-32 12 Trần Thị Quế (2011), Thiết kế biểu protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC sản xuất kháng thể đa dòng kháng LT quy mơ phũng thí nghiệm, Luận văn thạc sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội 13 Hồ Sối, Đinh Thị Bích Lân (2005), Xác định nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tiêu chảy lợn xí nghiệp lợn giống Triệu Hải-Quảng Trị thử nghiệm phác đồ điều trị, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tr 26-34 14 Bạch Thị Như Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Lê Phương Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), Biểu protein GP41 virus HIV phân type CRF01_AE E coli ứng dụng để phát kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân Western blot Elisa, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, (1), tr 29-36 15 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh vật thú y NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 81 – 85 16 Nguyễn Thị Hoài Thu (2014), Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát nhanh độc tố SEB, Luận văn thạc sỹ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật 17 Nguyễn Thị Thanh Thủy (2012), Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội, Luận án tiến sĩ nông nghiệp Hà Nội 18 Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Văn Cường, Trương Văn Dung, JanChrister Janson, Trương Nam Hải (2006), Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Roi tái tổ hợp đặc hiệu cho Salmonella Typhimurium, Tạp chí công nghệ sinh học, (3), tr 309-318 19 Bùi Trung Trực, Nguyễn Việt Nga, Thái Quốc Hiếu, Lê Thanh Hiếu, Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân (2004), Phân lập định typ kháng nguyên vi khuẩn E coli phân lợn nái, lợn tỉnh Tiền Giang, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, (1), tr 12-19 20 Trần Hồng Vân, Nguyễn Trọng Tuệ, Lê Văn Phủng (2008), Nghiên cứu số điều kiện tối ưu biểu proinsulin người tái tổ hợp hệ E coli BL21 (DE3) với vector pET – 28a(+), Tạp chí nghiên cứu y học 53 (1) 21 Phạm Thị Thanh Yến (2008), Áp dụng phương pháp Elisa phát độc tố LT chủng Escherichia coli phân lập thực phẩm Tạp chí DD&TP/Journal of Food and Nutrition Sciences - Tập 4, (2) 59 Tài liệu tiếng Anh 22 Blanco J.E, M Blanco A Mora and J Blanco (1997), Production of toxins (enterotoxins, verotoxins and necrotoxins) and colicins byEscherichia coli strains isolated from septicemic and healthy chickens: Relationship with in vivo pathogenicity, J Clin Microbiol, (35), pp 2953-2957 23 Bloch K (2006), Infectious Diarrhea, Chapter Infectious Diseases, Pathophysiology of Disease, Lange, 5th edition, McGraw-Hill Medical, United States of America, pp 80-83 24 Byun S G., Kim M D., Lee W H., Lee K.J., Han N S., Seo J H (2007), Production of GDP-L-fucose, L-fucose donor for fucosyloligosaccharide synthesis in recombinant Escherichia coli, Applied Microbiology and Biotechnology, (74), pp 768-775 25 Cheng E, Cardenas-Freytag L and Clements J.D (1999), The role of cAMP in mucosal adjuvanticity of Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT), Vaccine, 18, pp 38–49 26 Cryan B (1990), Comparison of three assay systems for detection of enterotoxigenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin, Journal of clinical microbiology, 28(4), pp 792-794 27 De Mattos Areas A.P., Sarno de Oliveira M.L., Ramos C.R., Sbrogio-Almeida, M.E., Raw I and Ho P.L (2002), Synthesis of cholera toxin B subunit gene: cloning and expression of a functional 6xHis-tagged protein in Escherichia coli, Protein Expression and Purification, 25, pp 481–487 28 Dreyfus L.A., Harville B., Howard D.E., Shaban R., Beatty D.M and Morris S.J (1993), Calcium influx mediated by the Escherichia coli heat-stable enterotoxin B (STb), Proc Natl Acad Sci USA, 90, pp 3202-3206 29 Dubreuil J Danie (1997), Escherichia coli STb enterotoxin, Microbiology 143(6), pp 1783-1795 30 Forte L.R., Thorne P.K, Eber S.L, Krause W.J, Freeman R.H, Francis S.H, and Corbin J.D (1992), Stimulation of intestinal Cl- transport by heat-stable enterotoxin: activation of cAMP-dependent protein kinase by cGMP, Am J Physol., 263, pp 607-615 31 Fujii Y, Kondo Y, and Okamoto K, (1995), Involvement of prostaglandin E2 synthesis in the intestinal secretory action of Escherichia coli heat-stable enterotoxin II, FEMS Microbiol Lett, 130, pp 259-265 32 Giannella R A., K W Drake and M Luttrell (1981), Development of a radioimmunoassay for Escherichia coli heat-stable enterotoxin, Infect Immun, (33), pp 186–192 60 33 Guidry J.J., L Cardenas, E Cheng and J.D Clements (1997), Role of receptor binding in toxicity, immunogenicity and adjuvanticity of E coli heat-labile enterotoxin Infect Immun, (65), pp 4943-4950 34 Guinee P.A.M, and Jansen W.H (1979), Behavior of Escherichia coli K antigen K88ab, K88ac and K88ad in immunoelectroporesis, double diffution and haemaglutination, Infect Immune., 23, pp 700-705 35 Guler L, K Gunduz and U Ok (2008), Virulence factors and antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from calves in Turkey, Zoonoses Public Health, 55, pp 249-257 36 Gyles C.L (1994), Escherichia coli enterotoxin In: E coli in domestic animals and human, Editor: Gyles, C.L CBA international, Wallingford, Oxon, UK, pp 337-364 37 Gyles C.L and Faibrother J.M, (2010), Escherichia coli in Gyles, C.L., Prescott, J.F, Songer G., Thoen C.O (eds) Pathogensis of bacterial infections in animals (4th) Iowa State University Press, Ames, Iowa 643 pp 38 Hitotsubashi S, Fujii Y, Yamanaka H and Okamoto K (1992), Some properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II, Infect Immun., 60, pp 4468-4474 39 Jacek Osek (2001), Multiplex polymerase chain reaction assay for identification of enterotoxigenic Escherichia coli strains, J Vet Diagn Invest 13:308–311 40 Kaper J B., Nataro J P & Mobley H L (2004) Pathogenic Escherichia coli Nat Rev Microbiol, 2, 123–140 41 Kim I S., Shin S Y., Kim Y.S, Kim H Y, Yoon H.S (2009), Expression of a glutathione reductase from Brassica rapa subsp pekinensis enhanced cellular redox homeostasis by modulating antioxidant proteins in Escherichia coli, Molecular and Cells, 28, pp 479 - 487 42 Konowalchuk J, Speirs, J I, & Stavric S (1977), Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli Infection and immunity, 18(3), pp 775-779 43 Lan D T B, Lan, T T, Van Quyet P, Quang H T, Loc N H, & Long P T (2014), Cloning and expression of gene encoding P23 protein from Cryptosporidium parvum Journal of BioScience & Biotechnology, 3(3) 44 Lang LA, Tsai YL, Mayer CL et al (1994), Multiplex PCR for detection of the heat-labile toxin gene and shiga-like toxin I and II genes in Escherichia coli isolated from natural waters Appl Environ Microbiol, 60, pp 3145–3149 45 Lee H.W., Yoon S.J, Kim H.K, Park K.M, Oh T.K, Jung J.K (2000), Overexpression of an alkaline lipase gene from Proteus vulgaris K80 in Escherichia coli BL21/pKLE, Biotechnology Letters, 22, pp 1543-1547 46 Lencer W.I, Moe S., Rufo P.A, Madara J.L (1995), Transcytosis of cholera toxin 61 subunits across model human intestinal epithelia, Proc Natl Acad Sci U S A., 92(22), pp 10094-10098 47 Li J G, Jiang Z Q, Xu L P, Sun F F., Guo J H (2007), Characterization of chitinase secreted by Bacillus cereus strain CH2 and evaluation of its efficacy against verticillium wilt of eggplant, International Organization for Biological Control, 10, pp 1007-1021 48 Lillehoj H.S, Choi K.D (1998), Recombinant chicken interferon-gamma mediated inhibition of Eimeria tenella development in vitro and reduction of oocyst production and body weight loss following Eimeria acervulina challenge infection, Avian Dis, 42, pp 307-314 49 Ling O.S, Kiong A.L.P, Hussein S (2008), Establishment and optimisation of growth parameters for cell suspension cultures of Ficus deltoidea, AmericanEurasian Journal of Sustainable Agriculture, 2(1), pp 38-49 50 Lior H (1996), Classification of Escherichia coli, In: Gyles C L (ed.) Escherichia coli in domestic animals and humans, CAB International, Wallingford, p 31 – 72 51 Loc N.H, Ngoc L.M.T, Lan T.T, Viet L.Q, Thao L.D, Quang H.T, Lan D.T.B, Long P.T (2013), Cloning and expression of genes encoding F107-C and K881NT fimbrial proteins of enterotoxigenic Escherichia coli from piglets, Online First Publication, Indian Journal of Microbiology, Doi 101007/s12088-1201310386-z 52 Manderson D, Dempster R., Chisti Y (2006), A recombinant vaccine against hydatidosis: production of the antigen in Escherichia coli, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 33, pp 173-182 53 Matsui T, Sato H, Yamamuro H, Misawa S, Shinzato N, Matsuda H, Takahashi T., Sato S (2007), High cell density cultivation of recombinant E coli for hirudin variant production, Journal of Biotechnology, 134, pp 88-92 54 Michael Field (2003), Intestinal ion transport and the pathophysiology of diarrhea, The Journal of Clinical Investigation, 111, (7) 55 Mierendorf R C, Morris B B, Hammer B, Novy R E (2000) Expression and purification of recombinant proteins using the pET system The Nucleic Acid Protocol Handbook, NJ: Humana Press Inc, Totowa, pp 947 – 977 56 Miksch G, Ryu S, Risse J.M (2008), Factors that influence the extracellular expression of streptavidin in Escherichia coli using a bacteriocin release protein, Application of gene molecular biotechnology, 10, pp 124-129 62 57 Mills KW and KL Tietze (1984), Monoclonal antibody enzyme-linked immunosorbent assay for identification of K99-positive Escherichia coli isolates from calves, J Clin Microbiol, 19, pp 498-501 58 Muhammad Ayaz Anwar and Sangdun Choi (2014), Gram-Negative Marine Bacteria: Structural Features of Lipopolysaccharides and Their Relevance for Economically Important Diseases, Mar Drugs, 12(5), pp 2485-2514 59 Narayanaswany S (1994), Plant cell and tissue culture, McGraw-Hill, Publishing Company, New Dehli 60 Nataro J.P, and Kaper J.B (1998), Diarrheagenic Escherichia coli, Clin Microbiol, Rev, 11(1), pp 142-201 61 Neil M.A., P.I Tarr D.N Taylor and A.F Trofa, 1994 Escherichia coli In: Foodborne Disease Handbook, Hui, Y.H., J.R Gorham, K.D Murell and D.O Cliver (Eds.) Marcel Decker, Inc., New York, pp: 169-213 62 Ngeleka M, Pritchard J, Appleyard G, Middleton D.M, Fairbrother J.M (2003), Isolation and association of Escherichia coli AIDA-I/STb, rather than EAST1 pathotype, with diarrhea in piglets and antibiotic sensitivity of isolates, J Vet Diagn Invest., 15(3), pp 242-252 63 O’Bien A.D, and Holmes R.K (1996), Protein toxin of Escherichia coli and Salmonella, In: Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology., Washinton DC., pp 2788-2802 64 O'Meara D , O'Shaughnessy E , Cryan B , Fanning S (1995), Colorimetric detection of heat-labile toxin-encoding gene of enterotoxigenic Escherichia coli by PCR, J Clin Microbiol, 33(7), pp 1957-60 65 Orskov I, Orskov F, Sojka W.J, Leach J.M (1961), Simultaneous occurrence of E coli B and Lantigens in strains from diseased swine Influence of cultivation temperature Two new E coli Kantigens: K87 and K88, Acta Pathol Microbiol Scand., 53, pp 404-422 66 Robert J Salmond, Jeffrey A Luross and Neil A Williams, The crystal structure of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, Expert Reviews in Molecular Medicine, Cambridge University Press, pp 1462-3994 67 Sambrook J., Fritsch E, Maniatis, T (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, USA 68 Savarino S.J, Fasano A, Robertson D.C, and Levine M.M (1991), Enteroaggregative Escherichia coli elaborate a heat-stable enterotoxin demonstrable in an in vitro rabbit intestinal model, J Clin Invest, 87, pp 1450-1455 69 Schmidt H., Beutin L and Karch H (1995), Molecular analysis of the plasmidencoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933, Infection and Immunity, 63 (3), p 1055 – 1061 70 Shin S.L, Chang Y.F, Timour M, Lauderdale T.L, and Lein D.H (1994), 63 71 72 73 74 75 76 77 78 Hybridiziation of clinical Escherichia coli isolates from calves and piglets in New York state with the gene probes for enterotoxins (STa, STb, LT), shigalike toxins (SLT-1, SLT-2) and adhesion factors (K88, K99, F41, 987P), Vet Microbiol., 38, pp 217-225 Smith H.W, Halls S (1967), Studies on Escherichia coli Enterotoxin, J Pathol Bacterial, pp 93:531 Stein P.E, Boodhoo A, Tyrrell G.J, Brunton, J.L Read, R.J (1992), Crystal structure of the cell binding B oligomer of Verotoxin-1 from Escherichia coli Nature, 355, pp 748–750 Stirm S, Orskov I, Orskov F (1966), K88 a n episome-determined protein antigen of Escherichia coli, Nature, 209, pp 507-508 Sukumar M, Rizo J, Wall M, Dreyfus L.A, Kupersztoch Y.M, Gierasch L.M (1995), The structure of Escherichia coli heat-stable enterotoxin b by nuclear magnetic resonance and circular dichroism, Protein Sci, 4(9), pp 1718-1729 Tauschek M, Gorrell R.J, Strugnell R.A, Robins-Browne R.M (2002), Identification of a protein secretory pathway for the secretion of heat-labile enterotoxin by an enterotoxigenic strain of Escherichia coli, Proc Natl Acad Sci U S A, 99(10), pp 7066-7071 Lu X, Wang J, Jin X, & Zhu J (2015), High-level expression of a novel livertargeting fusion interferon with preferred Escherichia coli codon preference and its anti-hepatitis B virus activity in vivo, BMC biotechnology, 15(1), pp 54 Yang B, Ya Li Z, Jian F.J, Ji De W, Zhao S Z, Dian Y Z (2003), Recombinant helicobacter pylori catalase, World Journal Gastroenterol 9(5), pp 1119-1122 Yang J, Yang C, Jiang H, Qiao C (2008), Overexpression of methyl parathion hydrolase and its application in detoxification of organophosphates, Biodegradation, 19, pp 831-839 79 Yingping Z, Wenfeng M A, Meijin G, Mansheng D, Ju C, Siliang Z (2006), High cell density and high expression of recombinant human ApoA-IMILANO in Escherichia coli by twice temperature shifted induction, Frontiers of Biology in China, 4, pp 345-348 80 Yolken R H, H B Greenberg, M H Merson, R B Sack, and A, Z Kapikian (1977), Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, J Clin Microbiol 5, pp 439–444 81 Zhinan X, Zhixia Z, Lei H, Li P, Fang W, Peilin C (2006), High level production of bioactive human beta-defens in-4 in Escherichia coli by soluble fusion expression, Appl Microbiol Biotechnol 72, pp 471-479 82 Ziv M (2000), Bioreactor technology for plant micropropagation, Horticultural Reviews, 24, pp 14-23 64 Trang web 83 http://www.promega.com Pgem-Teasy Vector Systems Technical Manual No 042 Instruction for use of products A1360, A1380, A3600 and A3610 65 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC TẬP 66 ... kháng nguyên tái tổ hợp nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ứng dụng số nước giới, Việt Nam có nghiên cứu thực Kết nghiên cứu giúp chủ động sản xuất lượng lớn protein kháng nguyên tái tổ hợp... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn E coli mang gene eltA gây tiêu chảy lợn sau cai sữa 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu thực phịng... 1000C Xác định kháng nguyên K tiến hành phản ứng ngưng kết phiến kính ống nghiệm Nhưng nay, kháng nguyên K sử dụng, mà thường sử dụng kháng nguyên O: H Một số nhà nghiên cứu cho kháng ngun K khơng