Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ đến khả năng sinh tổng hợp protein của chủng vi khuẩn methylobacterium extorquens

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG NGUYỄN THỊ THANH HIỀN KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEIN CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hƣớng dẫn: TS Phạm Thị Mỹ Đà Nẵng - Năm 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi Các số liệu, kết khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả khóa luận Nguyễn Thị Thanh Hiền ii LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu khoa học tự lực mà tơi hồn thành nghiệp học tập nghiên cứu khoa học Chính q trình thực gặp khơng khó khăn Tuy nhiên, nhờ có quan tâm, giúp đỡ từ phía gia đình, thầy bạn bè mà tơi hồn thiện khóa luận Trước hết tơi xin cảm ơn ba mẹ người thân giúp đỡ động viên tinh thần vật chất để tơi có tập trung hồn thành tốt đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô – TS Phạm Thị Mỹ định hướng động viên tơi suốt q trình thực khóa luận, giúp bước đến gần với khoa học Cảm ơn cô theo sát, truyền đạt kiến thức kĩ vô bổ ích mặt chuyên ngành Chính kiến thức quý báu mà cô truyền đạt nguồn tư liệu vơ quan trọng để tơi hồn thành tốt khóa luận Một lần nữa, tơi xin chân thành cảm ơn cô! Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Sinh – Môi trường giúp trang bị kiến thức tạo điều kiện trang thiết bị, dụng cụ hóa chất để thực tốt đề tài nghiên cứu Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến người bạn bên cạnh, chia sẻ kiến thức hỗ trợ, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Hiền iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc vi khuẩn Methylobacterium extorquens 1.1.1 Lịch sử phát phân bố 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 1.1.3 Một số ứng dụng VK Methylobacterium extorquens 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp protein vi khuẩn M extorquens 1.2 Khái quát protein đơn bào 10 1.2.1 Quy trình sản xuất protein đơn bào [12] 12 1.2.2 Những vấn đề cần lưu ý sản xuất protein đơn bào 12 1.3 Một số nghiên cứu việc sản xuất protein đơn bào từ vi sinh vật 15 1.3.1 Một số nghiên cứu giới 15 1.3.2 Một số nghiên cứu Việt Nam 17 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 Thời gian địa điểm thực 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phƣơng pháp thực đề tài 20 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 20 iv 2.4.2 Hoạt hóa chủng vi khuẩn M extorquens 21 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn M extorquens 22 2.4.4 Xác định mật độ 22 2.4.5 Xác định hàm lượng sinh khối protein 23 2.4.6 Phương pháp xử lí số liệu 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Ảnh hƣởng nguồn Carbon lên khả sinh trƣởng sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens 27 3.1.1 Khả sinh trưởng VK Methylobacterium extorquens nguồn Carbon khác 27 3.1.2 Khả sinh tổng hợp protein chủng VK Methylobacterium extorquens nguồn Carbon khác 30 3.2 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ lên khả sinh trƣởng sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens 32 3.2.1 Khả sinh trưởng VK Methylobacterium extorquens nguồn Nitơ khác 32 3.2.2 Khả sinh tổng hợp protein chủng VK Methylobacterium extorquens nguồn Nitơ khác 36 3.3 Ảnh hƣởng kết hợp nguồn Carbon Nitơ lên khả sinh trƣởng sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens .38 3.4 Xác định hàm lƣợng protein tổng số chủng VK Methylobacterium extorquens môi trƣờng tối ƣu 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .43 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC .50 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CTAB: Cetyltrimethyl-ammonium bromide SCP Single-cell protein VSV: Vi sinh vật VK: Vi khuẩn PPFM Pinkpigmented facultatively methylotrophic CFU: Colony Forming Unit MMS: Methanol minerat salts NCBI National Center for Biotechnology Information PCR: Polymerase Chain Reaction PHB: Poly-β-hydroxybutyrate PTN Phịng thí nghiệm UV: Ultraviolet MOB: Aerobic MethaneOxidizing Bacteria EFP Eurolysine Fodder Protein ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ĐC Đối chứng vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học tế bào VSV (% theo khối lượng khô) [11] 11 Bảng 1.2 Hàm lượng acid amine không thay số nguồn protein [12] 12 Bảng 2.1 Lập đồ thị chuẩn nồng độ protein 25 Bảng 2.2 Kết OD đường chuẩn protein 25 Bảng 3.1 Mật độ tế bào vi khuẩn Methylobacterium extorquens nguồn Carbon khác (10 CFU/ml) 28 Bảng 3.2 Mật độ tế bào vi khuẩn Methylobacterium extorquens nguồn Nitơ khác (10 CFU/ml) 34 Bảng 3.3 Mật độ tế bào nồng độ protein thu VK M extorquens nuôi môi trường MMS có bổ sung tỉ lệ C/N khác 38 Bảng 3.4 Hàm lượng protein sinh khối số chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu sản xuất SCP 41 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn Methylobacterium extorquen [14] .4 Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa nguồn Carbon VK M extorquens [28] Hình 1.3 Chu trình chuyển hóa Glucose VK Methylobacterium extorquens [29] Hình 1.4 Sự khử nitrat đồng hóa VK Methylobacterium extorquens Hình 1.5 Con đường đồng hóa ammonia (Theo Prescott cs, 2005) Hình 1.6 Cố định ammonia nhờ glutamine synthetase glutamate synthase 10 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20 Hình 2.2 VK M extorquens cấy ria đĩa thạch sau ngày nuôi cấy .21 Hình 2.3 VK M.extorquens cấy ria ống nghiệm sau ngày ni cấy 21 Hình 2.4 Quy trình thực định lượng protein theo phương pháp Lowry 25 Hình 2.5 Mối quan hệ tương quan mật độ quang nồng độ protein Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Khuẩn lạc VK Methylobacterium extorquens nuôi nguồn Carbon khác so với mẫu đối chứng 28 Hình 3.2 Nồng độ protein thu VK M extorquens nguồn Carbon khác (µg/ml) .31 Hình 3.3 Khuẩn lạc VK Methylobacterium extorquens nuôi nguồn Nitơ khác so với mẫu đối chứng 33 Hình 3.4 Nồng độ protein thu VK M extorquens nguồn Nitơ khác (µg/ml) 36 Hình 3.5 Nồng độ protein thu VK M extorquens nghiệm thức bổ sung kết hợp tỉ lệ nguồn Carbon Nitơ khác (µg/ml) 40 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày nay, với tốc độ tăng sản lượng lương thực, thực phẩm không theo kịp tốc độ gia tăng dân số; phân phối nguồn protein không đồng nơi giới; môi trường ô nhiễm làm dần nguồn lợi thức ăn từ tự nhiên làm thiếu hụt nguồn protein đa bào Do đó, ưu điểm protein đơn bào khả sinh sản phát triển nhanh, hàm lượng protein cao, thành phần cân đối đầy đủ, dễ điều khiển chất lượng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy tác động vào hệ gene, chủ động sản xuất, chiếm diện tích mở tiềm thay nguồn protein đa bào vi sinh vật nguồn cung cấp thức ăn tương lai [12] Protein đơn bào (Single-cell protein – SCP) thuật ngữ thường dùng để phần protein thu sinh khối khô tế bào tổng lượng protein tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, sử dụng làm nguồn thức ăn cho người hay nguồn thức ăn chăn ni Các protein đơn bào có thành phần protein cao (60-80% khối lượng khô tế bào), chất béo, carbohydrate, acid nucleic, vitamin chất khoáng Chúng chứa nhiều axit amin thiết yếu lysine methionine [2] Công nghệ sản xuất protein đơn bào công nghệ nuôi cấy thu sinh khối vi sinh vật Nó đời coi phương pháp hứa hẹn giải vấn đề thiếu protein tồn giới Cơng nghệ sản xuất protein đơn bào bao gồm trình chuyển vị sinh học, biến đổi sản phẩm phụ giá trị chi phí thấp, thường chất thải, trở thành sản phẩm với giá trị dinh dưỡng giá trị thị trường cao Một nguồn chất quan tâm methanol có nhiều ưu điểm vượt trội so với chất khác n-paraffin, khí metan hay chí số hợp chất carbohydrate [1] Chi Methylobacterium nhóm vi khuẩn hồng, dinh dưỡng methyl tùy ý (pinkpigmented facultatively methylotrophic, PPFM) Chúng cư ngụ chủ yếu vùng diệp quyển, đơi tìm thấy đất nước Chúng sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu Với khả sử dụng nguồn carbon rẻ tiền methanol, hàm lượng protein tế bào chiếm 70% trọng lượng khô mà thành phần protein, acid amin phân tử sinh học khác tương tự cá tự nhiên, chủng Methylobacterium sp đánh giá chủng vi khuẩn có tiềm lớn cho trình sản xuất protein đơn bào giá thành thấp quy mô công nghiệp [2] Một hướng tiếp cận nhiều nhà khoa học giới quan tâm hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn protein thay thức ăn nuôi trồng thủy sản Trong nghiên cứu vào đầu năm 2017 cơng ty cơng nghệ sinh học có trụ sở Massachusetts KnipBio, Tổ chức New England Aquarium, Đại học Massachusetts, Đại học Roger Williams Cơ quan Nghiên cứu Nông nghiệp Bộ Nông nghiệp Mỹ USDA chế độ ăn có chứa từ 30% đến 100% vi khuẩn dạng viên Methylobacterium extorquens đóng vai trị chất thay protein nơng nghiệp có chất lượng cao thức ăn cho thủy sản (tôm, cá) Đặc biệt đặc điểm nội sinh mang lại lợi M extorquens chứa hợp chất carotenoid chống oxy hóa tự nhiên, giúp tăng cường khả miễn dịch [3] Xuất phát từ lí luận thực tiễn trên, tiến hành thực đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng nguồn Carbon Nitơ đến khả sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu thiết lập môi trường nuôi cấy tối ưu để sản xuất nhanh sinh khối tế bào sinh tổng hợp nhiều protein chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens thông qua việc xác định nguồn Carbon, Nitơ tỉ lệ Carbon/Nitơ thích hợp Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học có tính hệ thống môi trường dinh dưỡng tối ưu cho sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens, từ làm sở để thu sinh khối protein đơn bào 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài sở để xây dựng quy trình thu nhận protein đơn bào từ chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens quy mô công nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trên sở kết thu được, rút kết luận sau đây:  Nguồn Carbon thích hợp cho khả sinh trưởng sinh tổng hợp protein VK M exotrquens 0.5% Formaldehyde môi trường MMS Mật độ tế bào đạt 26,07 108 CFU/ml nồng độ protein thu đạt 255.86 µg/ml  Nguồn Nitơ thích hợp cho khả sinh trưởng sinh tổng hợp protein VK M exotrquens 1.5% Cao nấm men môi trường MMS Mật độ tế bào đạt 32,5 108 CFU/ml nồng độ protein thu cao đạt xấp xỉ 302 µg/ml  Xác định hàm lượng protein thô sinh khối SCP VK M extorquens chiếm 78.5% tính theo trọng lượng chất khơ tế bào KIẾN NGHỊ Để đề tài nghiên cứu hoàn thiện nghiên cứu nhóm nghiên cứu định hướng số hướng nghiên cứu sau:  Nghiên cứu xác định hàm lượng acid amin thiết yếu chủng vi khuẩn M extorquens  Nghiên cứu thu nhận sinh khối protein đơn bào từ chủng vi khuẩn M extorquens  Nghiên cứu tạo chế phẩm để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc 43 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Phạm Anh Cường, Panfilov V.I (1999), “Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất thức ăn gia súc giàu protein đơn bào từ bả mía”, Báo cáo Khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc Nhà XB KH&KT Hà Nội [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục [3] Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng cộng (2012), “Nghiên cứu sử dụng nước thải sau chưng cất cồn để sản suất chế phẩm BIO-HR dùng chăn ni”, Tạp chí Sinh học, 2012, 34(3SE): tr 132-136 [4] Nguyễn Đức Lượng (2002), Thí nghiệm công nghệ sinh học tập Th nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr – 67, 260 -291, 445 [5] Trần Thị Xuân Mai, Nguyễn Thị Pha, Nguyễn Thị Liên, Nguyễn Văn Bé (2015), “Phân lập nhận diện vi tảo dị dưỡng Thraustochytrid sản xuất carotenoid”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ sinh học,37(1),tr.57-64 [6] Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, Biện Anh Tuấn (2006), “Khảo sát hệ VK Methylobacterium sp lúa ( Oryza sativa L.) Việt Nam”, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thôn, ISSN 2566-5320, 3:34-50 [7] Kiều Phương Nam, Trần Minh Tuấn, Đỗ Thị Duy Thiện, Biện Anh Tuấn, Bùi Văn Lệ (2010), “Định danh chủng VK phân lập vùng Đông Nam Bộ kĩ thuật rDNA 16S xác định quan hệ di truyền chúng chi Methylobacterium”, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thôn, ISSN 0866-7020, 3:44-49 [8] Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, Đỗ Thị Duy Thiện, Lê Thị Thùy Dương, Trần Thị Trinh (2010), “Sinh tổng hợp giberelin (gibbrellin) VK Methylobacterium sp.”, Tạp chí nơng thơn phát triển nơng thôn, ISSN 0866-7020, 5:51-54 [9] Kiều Phương Nam, Nguyễn Tấn Trung, Trần Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Việt, Trần Thị Thúy, Bùi Văn Lệ (2010), “Nghiên cứu điều kiện lên men thúc đẩy 44 t ch lũy PHB chủng Methylobacterium radiotolerans H2T”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3B): 1551-1556 [10] Cao Đăng Ngun (2007), Giáo trình cơng nghệ protein, NXB Đại học Huế [11] Lê Văn Nhương, Nguyễn Hồng Cách cộng (2009), Cơ sở cơng nghệ sinh học – Tập – Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục Việt Nam [12] Lương Đức Phẩm (2015), Công nghệ vi sinh, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội [13] Lê Xuân Phương (2008), Giáo trình vi sinh vật học mơi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [14] Lưu Thị Tâm, Lê Thị Thơm, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Hà Thu, Đặng Diễm Hồng (2015), “Bước đầu nghiên cứu ứng dụng sinh khối tảo Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin làm thức ăn bổ sung cho cá hồi vân Việt Nam”, Tạp chí Sinh học,37(4),tr.470-478 [15] Lưu Thị Tâm, Đinh Đức Hoàng, Đinh Thị Ngọc Mai, Ngơ Thị Hồi Thu, Hồng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng (2012), “Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng khả t ch lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis làm sở bước đầu cho qui trình ni cấy pha”, Tạp chí Sinh học, 34(2), tr.213-223 [16] Nguyễn Thị Hiếu Thu, Đinh Thúy Hằng (2016), “Phân lập vi khuẩn oxy hóa methane nhằm nghiên cứu ứng dụng để tạo nguồn đạm vi sinh”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(3): tr 581-588 [17] Phạm Thị Mỹ, Bùi Xuân Đông, Lê Thị Mai (2018), “ Nghiên cứu thu nhận sinh khối protein đơn bào từ vi khuẩn Methylobacterium sp.”, Đề tài KH CN cấp trường [18] Lê Lý Thùy Trâm, Kiều Nam Phương, Bùi Văn Lệ (2006), “Thu nhận poly-β hydroxybutyrate- loại nhựa sinh học dễ phân hủy từ VK methylobacterium sp phân lập Việt Nam”, Tạp chí KH CN Đại học Đà Nẵng, số 1(13), Tr 47-52 [19] Phạm Thanh Hà, Trần Đình Mấn, Trần Thị Hoa (2013), “Nghiên cứu, lựa chọn điều kiện nuôi cấy lên men chủng vi khuẩn Pseudomonas putida để thu nhận enzyme uricase”, Tạp chí KH CN số 51, Tr 709-718 45 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [20] Araujo w L., Maccheroni w Jr., Aguilar-Vildoso c L, Barroso p A V., Saridakis H o., Azevedo J L (2001), “Variability and interractions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks”, Canadian Journal of Microbiology, Vol 47, pp 229-236 [21] Arthi K., Appalarạu B., Parvathi S (2003), “Vancomycin sensitivity and KOH string test as an alternative to gram staining of bacteria”, India Journal of Medical Microbiology, Vol 21, pp 121-123 [22] Bergey D.H.; Noel R.K.; John G.H (1989), Bergey’s manual of sytematic bacteriology, Publisher: Baltimore, MD: Williams & Wilins [23] Bousfied, I J Green, P N (1985), “Eclassification of Bacteria of the Genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the Genus Methylobacterium (Patt Cole and Hanson) Emend Green and Bousfield 1983”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 35, pp 209 [24] Davies, S.J and Wareham, H., (1988), “A preliminary evaluation of an industrial single cell protein in practical diets for tilapia (Oreochromis mossambicus Peters.)” Aquaculture, 73: 189-199 [25] Dharumadurai Dhanasekaran, Subramaniyan Lawanya, Subhasish Saha, Nooruddin Thajuddin, Annamalai Panneerselvam (2011), “Production of single cell protein from pineapple waste using yeast”, Innovative romanian food biotechnology (2011) 8, 26-32pp [26] Doronina N V., Trotsenko Y A., Kuzentsov B B., Tourova T p., Salkinoja- Salonen M s (2002b), “Methylobacterium suomiense spp nov and Methylobacterium lusitanum spp nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 52, pp 773-776 [27] Fritz W, Hermann S (1977), “Process for producing single-cell protein from methanol using Methylomonas sp DSM 580” Patents US 4048013 A [28] Green P N (1992), “The Genus Methylobacterium”, In Balows A., Troper H G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K H (ed.) The Prokaryote, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin, pp 2342-2345 46 [29] Gallego V., Garcisa Ventosa A (2005a), “Methylobacterium hispanicum spp and Methylobacterium aquaticum spp nov isolated from drinking water”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp 281287 [30] Hellwing ALF (2005), Bacterial protein meal as protein source for monogastric animals – comparative studies on protein and energy metabolism, PhD dissertation The Royal Veterinary and Agricultural University Copenhagen, Denmark [31] Korotkova N., Lidstrom M E (2001), “Connection between PolyHydroxybutyrate biosynthesis and growth on Cl and C2 compounds in the methylotrop Methylobacterium extorquens AMi”, Journal of Bacteriology, Vol 183, No 3, pp 1038-1046 [32] Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa, (2002), “A new insight into foliar applied methanol influencing phylloplane methylotrophic dynamics ang growth promotion of cotton (Gossypium hirsutum L.) and sugarcane (Saccharum ofticinarum L.)”, Environmental and Experimental [33] Maliti C M (2000), Physiological and biochemical effects of Methylobacterium sp Strains and foliar-applied methanol on growth and development of rice Oryza satival L., Ph.D thesis, the city University of New York, USA [34] Overland M, Tauson AH, Shearer K, Skrede K (2010), “Evaluation of methane-utilising bacteria products as feed ingredients for monogastric animals”, Arch Anim Nutr 64: 171–189 [35] Patt T E., Cole G C., Hanson R S (1976), “Methylobacterium a New Genus of Facultatively Methylotrophic Bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 26, pp 226- 229 [36] Stepnowski p., Blotevogel K H., Jastor B (2004), “Extraction of carotenoid produced during methanol waste biodegradation”, International Biodeterioration & Biodegradation, Vol 53, pp 127 - 132 [37] Tlusty Michael, Andrew Rhyne, Joseph T Szczebak, Bradford Bourque, Jennifer L Bowen, Gary Burr, Christopher J Marx and Lawrence Feinberg (2017), “A transdisciplinary approach to the initial validation of a single cell protein as an 47 protein as alternative protein source for use in aquafeeds”, PeerJ, DOI 10.7717/peerj.3170 [38] Van Aken B., Peres C M., Doty S L., Yoon J M., Schnoor J L (2004a), “Methylobacterium populi sp nov a novel aerobic pink- pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 60, No 1, pp 308-317 [39] Van Dien SJ, Marx CJ, O 'Brien BN, Lidstrom ME 2003, “Genetic characterization of the carotenoid biosynthetic pathway in Methylobacterium extorquens AM1 and isolation of a colorless mutant”, Applied and Environmental Microbiology 69:7563_7566 [40] Verhoef R., De Waard p., Schols H A., Siika-aho M., Voragen A G J (2003), “Methylobacterium spp isolated from a finnis paper machine produces highly pyruvated galactan exopolysaccharide”, Carbohydrate Research, Vol 338, pp 18511859 [41] Walker John M (1996), The Protein Protocols Hand book 2nd ed, Humana Press Inc Totuwa, New Jersey [42] Weon H Y., Kim B Y., Joa J H., Son J A., Song M H., Kwon s w., Go s J., Yoon s H (2008), “Methylobacterium iners spp nov and Methylobacterium aerolatum spp nov isolated from air samples in Korea”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 58, pp 93-96 [43] Kato Y., Asahara M., Goto K., Kasai H., Yokota A (2008), “Methylobacterium persicinum spp nov., Methylobacterium komagatae spp nov., Methylobacterium brachiatum spp nov., Methylobacterium tardum spp nov and Methylobacterium gregans spp nov isolated from freshwater”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 58, pp 1134-1141 [44] Mondal AK, Sengupta S, Bhowal J, Bhattacharya DK (2012), “Utilization of fruit wastes in producing single cell protein” Int J Sci, Environ Technol 1:430 – 438 [45] Penalvera c G N., Morin D., Canteta F., Saurel o., Alain M., Vorholt J A (2006), “Methylobacterium extorquens AMi produces a novel type of acyl- 48 homoserine lactone with a double unsaturated side chain under methylotrophic growth conditions”, FEBS Letters, Vol 580, pp 561-567 [46] Singh A, Abidi AB, Agrawal AK, Darmwal NS (1991), “Single cell protein production by Aspergillus niger and its evaluation” Zentralbl Mikrobiol 146:181-184 [47] Khan MY, Dahot MU (2010), “Effect of various agriculture wastes and pure sugars on the production of single cell protein by Penicillium expansum” World Appl Sci (Special issue of biotechnology & genetic engineering) 8: 80-84 [48] Mondal AK, Sengupta S, Bhowal J, Bhattacharya DK (2012), “Utilization of fruit wastes in producing single cell protein” Int J Sci, Environ Technol 1:430 – 438 [49] Şişman T, Gür Ö, Doğan N, Özdal, Algur ÖF, Ergon T (2013), “Singlecell protein as an alternative food for zebrafish, Danio rerio: a toxicological assessment”, ToxicolInd Health 29:792-799 [50] Skrede A, Berge GM, Storebakken T, Herstad O, Aarstad KG, Sundstøl F (1998), “Digestibility of bacterial protein grown on natural gas in mink, pigs, chicken and Atlantic salmon”, Anim Feed Sci Technol 76:103– 116 [51] J Deutsch, H A Prescott, D Mulller, E Kemnitz, H Lieske (2005), “Acylation of naphthalenes and anthracene on sulfated zirconia” Journal of Catalysis 231: 269 – 278 49 PHỤ LỤC  Thành phần môi trƣờng MMS K2HPO4 1,20 g KH2PO4 0,62 g CaCl2.6H2O 0,05 g MgSO4.7H2O 0,2 g NaCl 0,1 g FeCl3.6H2O 1,0 mg (NH4)2SO4 0,5 µg CuSO4.5H2O 5,0 µg MnSO4.5H2O 10,0 µg Na2MoO4.2H2O 10,0 µg H3BO3 10,0 µg ZnSO4.7H2O 70,0 µg CoCl2.6H2O 5,0 µg Nước cất vừa đủ 1000ml pH 7,0 Môi trường MMS trùng cách hấp nhiệt độ 121ºC 20 phút, sau để nguội bổ sung methanol vào môi trường với thể tích từ 0,1 đến 0.5%, mơi trường rắn có bổ sung agar 20g/l trước hấp  Mật độ tế bào VK M.extorquens nguồn Carbon khác (108 CFU/ml) Đối chứng Formaldehyde Natri acetate 0.10% 18.7 18.8 18.9 14.3 14.6 14.5 9.6 9.8 9.9 0.50% 23.6 23.7 23.4 26.1 25.8 26.3 14.4 14.6 14.2 50 1% 22.1 22.1 22.2 10.1 10.3 10 3.7 3.9 1.50% 13.7 13.5 13.8 3.2 3.4 3.3 2.6 2.7 2.8 D-Glucose 11.5 11.9 12.1 21.5 21.3 21.6 16.3 16 16.1 10 10  Nồng độ protein thu đƣợc VK Methylobacterium extorquens nguồn Carbon khác (µg/ml) Tỉ lệ 0.1 % 0.5% 1% 1.5% Đối chứng 169.97 ± 2.1 250.33 ± 1.53 248.23 ± 2.8 139.33 ± 2.08 Formaldehyde 145.67 ± 4.93 255.86 ± 2.97 157.67 ± 6.03 120.67 ± 3.78 Natri acetate 118.83 ± 1.89 141.67 ± 3.51 108.56 ± 3.4 102.93 ± 3.78 235.5 ± 4.27 210.7 ± 3.05 126 ± 3.05 Nguồn C D-Glucose 131.67 ± 3.51  Mật độ tế bào VK M.extorquens nguồn Nitơ khác (108 CFU/ml) Cao Nấm men Peptone KNO3 Urê Amonisulfat Đối chứng 0.10% 22.3 22 22.4 18.7 18.8 18.9 9.2 8.8 8.6 9.8 10 9.4 20 20.1 20.7 16.2 16.4 16.5 0.50% 24 24.1 24.1 21.5 21.9 21.6 18.2 18.4 18.5 16.4 16.9 17.2 23.6 23.7 23.4 21.6 21.9 22.1 51 1% 30.2 30.4 30.5 26.7 26.5 26.8 22.8 22.7 22.8 23.9 24 24.1 28.9 28.9 28.8 23.2 23.1 23.2 1.50% 32.6 32.4 32.5 23.5 23.1 23.4 14.5 14 13.9 17.8 17.9 17.5 25.7 25.9 25.7 12.4 12.6 12.7  Nồng độ protein thu đƣợc VK Methylobacterium extorquens nguồn Nitơ khác (µg/ml) Tỉ lệ 0.1 % 0.5% Đối chứng 145.67 ± 4.93 250.33 ± 1.53 248.23 ± 2.8 Cao Nấm Men 216.67 ± 6.11 246.63 ± 2.31 286.67 ± 2.08 302 ± 3.06 Peptone 174.5 ± 3.66 243.33 ± 3.51 256.83 ± 3.34 248.33 ± 1.53 Kali Nitrate 140.33 ± 1.53 234.76 ± 1.22 238.33 ± 1.53 125.67 ± 2.08 Urê 144.63 ± 1.21 231.7 ± 2.94 244.57 ± 3.96 134.66 ± 4.51 Amonisulfate 205.67 ± 4.93 250.33 ± 1.53 271.67 ± 2.08 264.33 ± 3.05 Nguồn N 1% 1.5% 248.23 ± 2.8  Bảng kết ANOVA thể khác mật độ tế bào VK Methylobacterium extorquens nguồn Carbon khác Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY Methanol Count Sum Average Variance 0.001 0.005 0.01 0.015 Total 3 3 12 56.4 70.7 66.4 41 234.5 18.8 23.56667 22.13333 13.66667 19.54167 0.01 0.023333 0.003333 0.023333 15.82447 Formandehyde Count 3 Sum 43.4 78.2 30.4 Average 14.46667 26.06667 10.13333 Variance 0.023333 0.063333 0.023333 12 9.9 161.9 3.3 13.49167 0.01 74.81174 Natri acetate Count Sum 29.3 Average 9.766667 Variance 0.023333 3 43.2 11.6 14.4 3.866667 0.04 0.023333 12 8.1 92.2 2.7 7.683333 0.01 24.25061 D-Glucose Count Sum 64.4 35.5 48.4 52 29 12 177.3 Average Variance 11.83333 21.46667 16.13333 9.666667 14.775 0.093333 0.023333 0.023333 0.333333 22.27841 Total Count Sum Average Variance 12 12 12 12 164.6 256.5 156.8 88 13.71667 21.375 13.06667 7.333333 12.45061 20.61114 50.42788 22.78424 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 856.8573 1196.662 310.6552 1.5 Total 2365.675 df 3 32 MS F P-value F crit 285.6191 6093.207 3.49E-44 2.90112 398.8874 8509.599 1.68E-46 2.90112 34.51725 736.3679 1.77E-34 2.188766 0.046875 47  Bảng kết ANOVA thể khác mật độ tế bào VK Methylobacterium extorquens nguồn Nitơ khác Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY 0.001 0.005 0.01 Cao Nấm men Count 3 Sum 66.7 72.2 91.1 Average 22.23333 24.06667 30.36667 Variance 0.043333 0.003333 0.023333 0.015 Total 12 97.5 327.5 32.5 27.29167 0.01 19.80629 Peptone Count Sum Average Variance 3 3 12 56.4 65 80 70 271.4 18.8 21.66667 26.66667 23.33333 22.61667 0.01 0.043333 0.023333 0.043333 8.854242 KNO3 Count Sum Average Variance 3 3 12 26.6 55.1 68.3 42.4 192.4 8.866667 18.36667 22.76667 14.13333 16.03333 0.093333 0.023333 0.003333 0.103333 28.88242 53 Ure Count Sum Average Variance 3 29.2 50.5 9.733333 16.83333 0.093333 0.163333 3 12 72 53.2 204.9 24 17.73333 17.075 0.01 0.043333 27.96932 Amoni sulfat Count 3 3 12 Sum 60.8 70.7 86.6 77.3 295.4 Average 20.26667 23.56667 28.86667 25.76667 24.61667 Variance 0.143333 0.023333 0.003333 0.013333 10.78152 Methanol Count 3 3 12 Sum 49.1 70.7 66.4 41 227.2 Average 16.36667 23.56667 22.13333 13.66667 18.93333 Variance 0.023333 0.023333 0.003333 0.023333 18.02242 Total Count Sum Average Variance 18 18 18 18 288.8 384.2 464.4 381.4 16.04444 21.34444 25.8 21.18889 27.43203 8.257908 10.04824 47.99281 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 1194.839 858.8911 396.6072 1.98 Total 2452.318 df 15 48 MS F P-value F crit 238.9679 5793.161 1.68E-65 2.408514 286.297 6940.534 2.69E-63 2.798061 26.44048 640.9814 6.26E-50 1.880175 0.04125 71  Bảng kết ANOVA thể khác nồng độ protein thu đƣợc VK Methylobacterium extorquens nguồn Carbon khác Anova: Two-Factor With Replication SUMMAR Y Methanol Count 0.001 0.005 0.01 3 54 0.015 Total 12 Sum 509.7 4.41 751 250.33333 33 2.3333333 33 747.7 249.23333 33 7.8433333 33 418 139.3333 33 4.333333 33 Average 169.9 Variance 2601.02 437 145.66666 67 24.333333 33 767.6 255.86666 67 8.8033333 33 473 157.66666 67 36.333333 33 362 120.6666 67 14.33333 33 12 2039.6 169.966 67 2892.80 42 356.5 118.83333 33 3.5833333 33 425 141.66666 67 12.333333 33 325.7 108.56666 67 11.563333 33 308.8 102.9333 33 14.34333 33 12 1416 118 246.730 91 395 131.66666 67 12.333333 33 706 235.33333 33 20.333333 33 632 210.66666 67 9.3333333 33 380 126.6666 67 9.333333 33 12 2113 176.083 33 2496.99 24 12 2649.6 12 2178.4 181.53333 33 3100.6842 42 12 1468.8 Variance 12 1698.2 141.51666 67 399.31787 88 122.4 195.0345 45 ANOVA Source of Variation Sample SS 44766.989 MS 14922.329 F 1218.895 Formaldehy de Count Sum Average Variance Natri acetate Count Sum Average Variance D-Glucose Count Sum Average Variance 2426.4 202.2 Total Count Sum Average 220.8 2346.6527 27 df 55 P-value F crit 4.733E- 2.90112 Interaction Within 17 68921.429 17 21299.834 17 391.76 32 Total 135380.01 25 47 Columns 72 22973.809 72 2366.6482 41 12.2425 63 1876.561 95 193.3141 33 4.996E36 2.90112 2.681E- 2.18876 25  Bảng kết ANOVA thể khác nồng độ protein thu đƣợc VK Methylobacterium extorquens nguồn Nitơ khác Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY Methanol Count Sum Average Variance 0.001 0.005 0.01 0.015 Total 3 3 509.7 751 747.7 418 169.9 250.3333 249.2333 139.3333 4.41 2.333333 7.843333 4.333333 12 2426.4 202.2 2601.02 Cao Nấm Men Count 3 3 12 Sum 650 739 860 908 3157 Average 216.6667 246.3333 286.6667 302.6667 263.0833 Variance 37.33333 4.333333 4.333333 9.333333 1253.174 peptone Count Sum Average Variance 3 3 12 523.5 730 770.5 745 2769 174.5 243.3333 256.8333 248.3333 230.75 13.39 12.33333 11.14333 2.333333 1183.105 KNO3 Count Sum Average Variance 3 3 12 421 703 715 377 2216 140.3333 234.3333 238.3333 125.6667 184.6667 2.333333 2.333333 2.333333 4.333333 2945.697 ure Count Sum 433.9 696.1 733 56 404 12 2267 Average Variance 144.6333 232.0333 244.3333 134.6667 188.9167 1.463333 7.303333 14.33333 20.33333 2689.932 Amoni sulfat Count 3 3 12 Sum 617 751 815 793 2976 Average 205.6667 250.3333 271.6667 264.3333 248 Variance 24.33333 2.333333 4.333333 9.333333 723.0909 Total Count Sum Average Variance 18 18 18 18 3155.1 4370.1 4641.2 3645 175.2833 242.7833 257.8444 202.5 861.4862 59.03324 298.1873 5379.794 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 63434.97 76616.66 48322.44 417.1067 Total 188791.2 df 15 48 MS F P-value F crit 12686.99 1460 3.45E-51 2.408514 25538.89 2938.976 2.26E-54 2.798061 3221.496 370.7248 2.86E-44 1.880175 8.689722 71 57 ... hợp xét ảnh hưởng nguồn Nitơ đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp protein chủng VK Methylobacterium extorquens 3.3 Ảnh hƣởng kết hợp nguồn Carbon Nitơ lên khả sinh trƣởng sinh tổng hợp protein chủng. .. Formaldehyde chủng VK Methylobacterium extorquens có khả sinh trưởng sinh tổng hợp protein mạnh 3.2 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ lên khả sinh trƣởng sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn Methylobacterium extorquens. .. CFU/ml 3.2.2 Khả sinh tổng hợp protein chủng VK Methylobacterium extorquens nguồn Nitơ khác Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành thí nghiệm khảo sát khả sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn môi trường