Luận văn : Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định, tìm hiểu đặc tính và điều khiển các yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp glucosinolate

Luận văn : Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định, tìm hiểu đặc tính và điều khiển các yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp glucosinolate

- i -

Trong suốt thời gian gần 5 năm học ở trường Đại học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh, ngành Công nghệ sinh học, em cùng các bạn lớp HC06BSH đã được trang bị vốn kiến thức chuyên ngành quý báu, là hành trang vững chắc để bước vào đời

Hôm nay, khi đã hoàn tất trang cuối cùng của Luận văn tốt nghiệp, em cảm thấy

vô cùng biết ơn các thầy cô của trường Đại học Bách Khoa, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học – Khoa Kỹ thuật hóa học, đã dìu dắt em trong suốt quãng đường đại học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô Lê Thị Thủy Tiên, người đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện Luận văn tốt nghiệp Cô đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ

em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn

Em cũng xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn đã tận tình giúp đỡ mỗi khi em gặp khó khăn trong quá trình thí nghiệm

Cảm ơn các bạn lớp HC06BSH, các anh chị cao học, mọi người đã luôn bên cạnh tôi và góp thêm động lực giúp tôi phấn đấu nhiều hơn nữa

Con cũng xin cảm ơn bố mẹ, gia đình là nơi nương tựa và là nguồn động viên tinh thần lớn lao, giúp con hoàn thành tốt quá trình học tập và vững tin bước vào đời Mặc dù đã cố gắng hết sức nhưng chắc chắn luận văn không tránh khỏi những thiếu sót, mong Quý thầy cô chỉ bảo và các bạn góp ý để luận văn được hoàn thiện hơn nữa Xin cảm ơn /

TP Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 12 năm 2010 SVTH: VŨ THỊ NGỌC AN

- ii -

Tử diệp, trụ hạ diệp và cuống tử diệp của cây bông cải xanh in vitro 7 ngày tuổi

được đưa vào môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l, kinetin 1.0 mg/l và NAA nồng

độ thay đổi (1.0, 1.5, 2.0 mg/l) để kích thích tạo rễ bất định Kết quả cho thấy tử diệp

và trụ hạ diệp tạo rễ bất định tốt nhất trên môi trường chứa NAA 1.5 mg/l với tỉ lệ phát sinh rễ lần lượt là 53.33% và 60.00%, mật độ rễ/mẫu cấy tương ứng là 7.25 và 7.44 rễ/mẫu Cuống tử diệp có tỉ lệ phát sinh rễ bất định cao 63.33% trên môi trường có NAA 1.0 mg/l, tuy nhiên rễ phát sinh không nhiều (3.8 rễ/mẫu) và có nhiều mẫu tạo chồi Rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp tiếp tục được cấy chuyền nhằm tăng sinh trước khi chuyển sang môi trường lỏng có thành phần tương tự môi trường tạo rễ Trên môi trường lỏng, sau 4 tuần nuôi cấy, chỉ số tăng trưởng của rễ từ tử diệp và trụ hạ diệp là 1.021  0.104 và 1.318  0.110 Lượng glucosinolate tích lũy trong rễ qua 4 tuần theo dõi đạt cao nhất ở tuần thứ 3 (rễ từ tử diệp đạt 0.488  0.068 mol/g và từ trụ

hạ diệp đạt 0.430  0.022 mol/g) và không thay đổi đáng kể ở tuần thứ 4 Khi bổ sung acid amin (methionine, phenylalanine và tyrosine) vào môi trường lỏng với nồng

độ 10, 20, 30 mg/l, kết quả ở tất cả các nghiệm thức đều có sự gia tăng hàm lượng glucosinolate trong rễ so với mẫu đối chứng và cao nhất ở nồng độ 30 mg/l Ở rễ từ tử diệp, hàm lượng glucosinolate tích lũy khi bổ sung methionine, phenylalanine, tyrosine nồng độ 30 mg/l lần lượt là 0.770  0.051, 0.790  0.075, 0.757  0.036 mol/g và rễ

từ trụ hạ diệp là 0.844  0.069, 0.649  0.070, 0.634  0.050 mol/g

- iii -

AITC Allyl isothiocyanate

BAP (BA) 6-benzylaminopurine (benzyladenine)

BITC Benzyl isothiocyanate

CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

NAA 1-naphthalene acetic acid

PEITC Phenethyl isothiocyanate

UGT UDP-glucuronosyl transferase

- iv -

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC ẢNH ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cây bông cải xanh Brassica oleracea var italica 3

2.1.1 Giới thiệu – vị trí phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái 5

2.1.4 Thành phần hóa học bông cải xanh 6

2.1.5 Công dụng của bông cải xanh 8

2.1.6 Nhân giống bông cải xanh nhờ phương pháp nuôi cấy mô 8

2.2 Glucosinolate 10

2.2.1 Giới thiệu và cấu trúc hóa học 10

2.2.2 Phân loại 11

2.2.3 Sinh tổng hợp glucosinolate 11

2.2.4 Thủy phân glucosinolate 14

- v -

2.2.6 Các phương pháp trích ly và định lượng glucosinolate 17

2.3 Nuôi cấy rễ bất định thu nhận hợp chất thứ cấp (HCTC) 18

2.3.1 Rễ bất định 18

2.3.2 Nuôi cấy rễ bất định thu nhận HCTC 19

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ bất định in vitro 22

2.3.4 Phương pháp làm tăng sản lượng HCTC trong nuôi cấy rễ bất định 23

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Vật liệu 25

3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.2.1 Giai đoạn 1: Tạo cây mầm in vitro 27

3.2.2 Giai đoạn 2: Tạo rễ bất định 28

3.2.3 Giai đoạn 3: Cảm ứng sinh tổng hợp glucosinolate 29

3.2.4 Giai đoạn 4: Trích ly và định lượng glucosinolate 31

3.2.5 Phương pháp xử lý kết quả 34

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả 35

4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng và nguồn gốc mẫu cấy đến khả năng tạo rễ bất định 35

4.1.2 Thí nghiệm 2: khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ 38

4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các acid amin lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất định 42

4.2 Thảo luận 48

- vi -

khả năng tạo rễ bất định 48

4.2.2 Sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ 49

4.2.3 Ảnh hưởng của các acid amin lên sự tích lũy glucosinolate của rễ bất định 50

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 56

- vii -

Bảng 2.1 10 nước trồng súp lơ và bông cải xanh nhiều nhất trên thế giới 4

Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng và khoáng chất trong bông cải xanh tươi 6

Bảng 2.3 Hàm lượng glucosinolate ở 1 số loài Brassica 11

Bảng 2.4 Cấu trúc và phân loại glucosinolate 12

Bảng 2.5: Nguồn thực phẩm chứa isothiocyanate và tiền chất glucosinolate 15

Bảng 3.1 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu cấy và nồng độ các CĐHSTTV lên khả năng phát sinh rễ bất định 29

Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các acid amin lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất định 30

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự phát sinh rễ bất định 37

Bảng 4.2 Nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ bất định 37

- viii -

Hình 2.1 Cấu tạo 3,3’- diindolymethane 7

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của glucosinolate 10

Hình 2.3 Các giai đoạn trong quá trình sinh tổng hợp glucosinolate 13

Hình 2.4 Quá trình thủy phân glucosinolate và cấu trúc một số isothiocyanate 14

Hình 2.5 Cơ chế ngăn chặn ung thư của glucosinolate 16

Hình 2.6 Các loại rễ ở thực vật 19

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm chung 26

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình tạo cây mầm in vitro 27

Hình 3.3 Phản ứng ngưng tụ vòng của isothiocyanate và 1,2-benzendithiol 31

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình thủy phân glucosinolate thành isothiocyanate 32

Hình 3.5 Sơ đồ quy trình phản ứng định lượng isothiocyanate 33

Hình 4.1 Đường cong sinh trưởng của rễ qua 4 tuần nuôi cấy trên môi trường lỏng 40

Hình 4.2 Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định từ tử diệp 40

Hình 4.3 Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định từ trụ hạ diệp 41

Hình 4.4 So sánh hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ từ tử diệp và rễ từ trụ hạ diệp qua 4 tuần nuôi cấy 41

Hình 4.5 Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ khi bổ sung methionine 43

Hình 4.6 Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ khi bổ sung phenylalanine 44

Hình 4.7 Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ khi bổ sung tyrosine 45

Hình 4.8 So sánh ảnh hưởng của các acid amin lên rễ bất định từ tử diệp 46

Hình 4.9 So sánh ảnh hưởng của các acid amin lên rễ bất định từ trụ hạ diệp ………… 47

- ix -

Ảnh 2.1 Cây bông cải xanh 3

Ảnh 2.2 Rễ cây bông cải xanh 5

Ảnh 2.3 Hoa cây bông cải xanh 6

Ảnh 2.4 Trụ hạ diệp trên môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA kích thích tạo chồi 9

Ảnh 2.5 Tái sinh chồi từ chồi ngọn 9

Ảnh 2.6 Quy trình nuôi cấy rễ bất định Echinacea purpurea 20

Ảnh 3.1 Hạt giống bông cải xanh Brassica oleracea var italica 25

Ảnh 3.2 Hạt giống củ cải trắng Raphanus sativus 25

Ảnh 3.3 Cây mầm bông cải xanh in vitro 28

Ảnh 4.1 Rễ bất định phát sinh từ mẫu cấy sau 10 ngày nuôi cấy 35

Ảnh 4.2 Rễ bất định phát sinh từ các mẫu cấy khác nhau 36

Ảnh 4.3 Rễ thứ cấp phát sinh từ mẫu cấy sau 1 tuần cấy chuyền 38

Ảnh 4.4 Rễ tăng trưởng trong môi trường lỏng 39

Ảnh 4.5 Rễ bất định trên môi trường lỏng bổ sung acid amin 42

- 1 -

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

Thực vật là nguồn cung cấp rất nhiều loại hợp chất tự nhiên quý giá, được sử

dụng trong dược phẩm, hóa học nông nghiệp, ngoài ra còn dùng làm hương vị, hương thơm tự nhiên, thuốc trừ sâu sinh học và phụ gia thực phẩm (Philipson JD., 1990; Hadacek F., 2002) Việc thu nhận các hợp chất này trong tự nhiên gặp nhiều khó khăn

và phụ thuộc nhiều yếu tố (thời tiết, thổ nhưỡng …) Hợp chất thứ cấp (HCTC) thường

bị giới hạn theo từng loài, chi thực vật, có thể chỉ sinh ra trong một giai đoạn tăng

trưởng và phát triển nhất định hoặc theo từng mùa, khi thực vật bị stress hay phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng cung cấp

Chính vì những nguyên nhân đó mà từ những thập niên trước, nhiều nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận HCTC đã được tiến hành (Rao SR và cs 2002,

Verpoorte R và cs 2002) Tuy nhiên, năng suất thu được còn quá thấp, mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tối ưu hóa môi trường phát triển và tổng hợp HCTC của tế bào cũng như chọn lựa các dòng tế bào có khả năng sản xuất cao nhất Nguyên nhân có thể do quá trình sinh tổng hợp HCTC chịu ảnh hưởng bởi một loại mô cụ thể, sự khác biệt

của các tế bào về nguồn gốc mô dẫn đến khả năng sản xuất HCTC giảm Chính vì vậy, nuôi cấy rễ, phôi và chồi được tập trung nghiên cứu như một phương pháp có thể thay thế cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào nhằm sản xuất HCTC (Rao và cs, 2002)

Rễ bất định được cảm ứng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro có khả năng sinh

tổng hợp HCTC cao và hoạt tính khá ổn định (Hahn EJ và cs, 2003; Yu KW và cs,

2005) Rễ bất định có thể phát triển mạnh trên môi trường bổ sung hormone thực vật

và tích lũy lượng lớn các HCTC có giá trị Ngày nay, việc mở rộng quy mô nuôi cấy rễ bất định trong các thiết bị phản ứng sinh học lớn (bioreactor) cho thấy khả năng sản

xuất HCTC trên quy mô công nghiệp là hoàn toàn khả thi (theo Murthy và cs, 2008)

[13]

- 2 -

Bông cải xanh (Brassica oleracea var italica) được xem như một loại thực phẩm

chức năng vì là nguồn cung cấp dồi dào glucosinolate – tiền chất của isothiocyanate, những hợp chất có khả năng chống ung thư mạnh trong các loại thực phẩm

Đề tài này được tiến hành nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định, từ đó có thể tìm hiểu đặc tính và điều khiển các yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp glucosinolate của bông cải xanh Nội dung đề tài bao gồm:

 Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng phát sinh rễ bất định

 Khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ

 Khảo sát ảnh hưởng của các amino acid lên sự sinh tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

- 3 -

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cây bông cải xanh Brassica oleracea var italica

2.1.1 Giới thiệu – vị trí phân loại

Thứ : B oleracea L var italica

Tên khoa học: Brassica oleracea L var italica

Tên thông thường: Bông cải xanh, súp lơ xanh, broccoli (tiếng Anh), brachium (tiếng Latin)

Ảnh 2.1 Cây bông cải xanh

- 4 -

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Bông cải xanh có nguồn gốc từ một loài bắp cải hoang dại ở châu Âu (miền Nam nước Ý), trải qua thời gian dài trồng trọt và phát triển bởi cư dân La Mã, bông cải xanh được biết đến như một loại rau ăn được từ cách đây khoảng 2000 năm Từ thời Đế chế

La Mã, bông cải xanh đã được xem là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và cho đến nay vẫn thường có mặt trong các món ăn Ý Bông cải xanh được du nhập sang Mỹ bởi những người di cư và trở nên phổ biến từ những năm 1920 (Murray, 2005) Từ

broccoli được dịch ra từ tiếng Latin brachium, có nghĩa là cành hoặc cánh tay, giống như hình dạng của cây bông cải xanh [24, 26]

Ngày nay, bông cải xanh được trồng ở nhiều quốc gia trên thế giới, điển hình như Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Mỹ, Mexico, Ý, Tây Ban Nha, Anh, Pháp, Ba Lan (FAO, 2008)

Bông cải xanh thích hợp trồng ở những nơi có khí hậu mát, nhiệt độ thích hợp từ

18 – 230C (Smith, 1999) Tại Việt Nam, bông cải xanh được trồng nhiều ở các vùng cao nguyên như Đà Lạt – Lâm Đồng, ở miền Bắc thì thường trồng vào mùa Đông

Bảng 2.1 10 nước trồng súp lơ và bông cải xanh nhiều nhất trên thế giới

- 5 -

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cây bông cải xanh trưởng thành có chiều cao khoảng 2 – 3 feet (60 – 90 cm) [26], lá dày, mập, không có lông, mọc so le và chia thùy hình lông chim, tỏa đều xung quanh thân, ở giữa là những cụm hoa màu xanh (Phạm Hoàng Hộ, 2006) Thân bông cải xanh thường không chia nhánh, đỉnh của thân cây phát sinh những cụm chồi (mà sau này là hoa) bề ngang 6 – 10 inch (15 – 25 cm) Một hàng bông cải xanh dài 15 bước có thể cho sản lượng 10 pound (tương đương 4.5 kg) sau 5 tuần [26]

Bông cải xanh có một rễ cái và nhiều rễ bên khi còn là cây mầm Trong quá trình chuyển cây ra đồng, rễ cái bị tổn thương dẫn đến việc phát sinh thêm rễ bất định Ban đầu rễ mọc tương đối nông, rễ bên phát triển theo chiều ngang và có thể lan rộng đến 1m, có rất nhiều lông mịn Sau vài tháng, một vài rễ sẽ đâm xuống các tầng đất sâu hơn (theo Phạm Văn Lộc, 2010) [1]

Ảnh 2.2 Rễ cây bông cải xanh

Hoa bắt đầu hình thành khi cây đạt chiều cao từ 60 – 90 cm Hoa có màu vàng sáng với 4 đài hoa, 6 nhị hoa (4 dài, 2 ngắn), 2 lá noãn và 4 cánh hoa Chồi hoa có màu xanh đen, kết chặt với nhau tạo thành đầu hoa (ảnh 2.3) Bông cải xanh là cây tự thụ phấn Trái của bông cải xanh hình thon dài, bề mặt nhẵn, mỗi trái chứa khoảng 10 – 30 hạt [1]

- 6 -

Ảnh 2.3 Hoa cây bông cải xanh [24]

2.1.4 Thành phần hóa học bông cải xanh

Bông cải xanh chứa nhiều loại vitamin thiết yếu như vitamin C, K và A, đồng thời cũng là loại thực phẩm giàu chất xơ Bông cải xanh có hàm lượng carotenoid cao nhất trong chi Brassica, đặc biệt giàu lutein và -carotene (Science Daily, 2009)

Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng và khoáng chất trong bông cải xanh tươi

Dinh dưỡng trong 100g bông cải xanh tươi

Nguồn: Dữ liệu dinh dưỡng USDA

Ngoài ra, bông cải xanh còn chứa nhiều chất dinh dưỡng với tiềm năng chống ung thư như diindolylmethane và Selenium (Tổ chức George Mateljan, 2009) 3,3'-diindolylmethane trong bông cải xanh có khả năng điều khiển hệ thống đáp ứng miễn dịch chống lại virus, vi khuẩn và bệnh ung thư (Đại học Berkeley, California, 2007) [23]

Hình 2.1 Cấu tạo 3,3’-diindolymethane

Bông cải xanh còn chứa các hợp chất glucoraphanin (thuộc nhóm chất glucosinolate), có thể chuyển hóa thành sulforaphane - một hợp chất chống ung thư và indole-3-carbinol, một chất hóa học góp phần vào quá trình sửa sai DNA trong các tế bào và ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư (Science Daily, 2010) Tuy vậy, những hợp chất có giá trị này của bông cải xanh sẽ giảm đi rất nhiều qua quá trình chế

biến do ảnh hưởng của nhiệt độ, áp suất cao [8, 18]

- 8 -

2.1.5 Công dụng của bông cải xanh

Cho đến nay nhiều nghiên cứu khác nhau cũng đã khẳng định bông cải xanh là

nguồn giàu chất chống oxi hóa, các vitamin, và chất xơ, những chất này có thể phòng chống bệnh ung thư Tuy nhiên khi chế biến bông cải xanh ở nhiệt độ cao, nhiều nghiên cứu đã cho thấy những thành phần vitamin đặc biệt là nhóm chất có tác dụng ngăn ngừa ung thư bị giảm (Jones R.B và cs, 2010) [13]

Sulforaphane lần đầu được giáo sư Paul Talalay ở trường Ðại Học Johns Hopkins

phát hiện có trong các cây rau họ cải có khả năng chống ung thư Trong bông cải xanh

có các hợp chất glucosinolate, trong quá trình thái nhỏ, nhai và tiêu hóa, chất này sẽ bị thủy phân thành isothiocyanate, có vai trò ngăn ngừa ung thư Sulforaphane là hợp chất tiêu biểu trong nhóm isothiocyanate Vai trò của các isothiocyanate đối với con

người được trình bày ở mục 2.2.5 của luận văn

2.1.6 Nhân giống bông cải xanh nhờ phương pháp nuôi cấy mô

Ngày nay, với sự phát triển mạnh của công nghệ nuôi cấy mô – tế bào, bên cạnh

việc nhân giống cây trồng theo các phương pháp in vivo thông thường thì việc nhân

giống vô tính thực vật in vitro đã không còn xa lạ Đối với bông cải xanh, nhân giống

vô tính trong nuôi cấy mô đã được nghiên cứu và áp dụng thành công Nhiều nghiên cứu đã tiến hành tái sinh chồi và nhân giống bông cải xanh từ mẫu lá, thân, rễ hay tử

diệp và trụ hạ diệp của cây mầm in vitro [15, 16, 20]

Viện rau quả và cây trồng Serbia đã tiến hành nhân giống bông cải xanh với các

mẫu cấy từ rễ, tử diệp, trụ hạ diệp của cây mầm in vitro cho thấy trụ hạ diệp là mẫu

cấy thích hợp với tỉ lệ mẫu cấy nảy chồi là 84% và số chồi trung bình/mẫu cấy là 5.2  0.1 trên môi trường MS bổ sung BA 1.0 mg/l và IBA 0.1 mg/l Tuy nhiên, khi sử dụng riêng lẻ BA mà không kết hợp IBA thì tỉ lệ mẫu cấy nảy chồi thấp hơn (57%) nhưng số chồi/mẫu cấy nhiều hơn (7.4  0.3) [15]

Nghiên cứu tái sinh chồi từ trụ hạ diệp và chồi ngọn của Đại học Putra Malaysia cho kết quả 96.67% trụ hạ diệp phát sinh chồi với số lượng 6.03 chồi/mẫu trên môi

trường MS bổ sung BA 3 mg/l (ảnh 2.4) Với mẫu cấy là chồi ngọn, môi trường thích hợp là môi trường MS bổ sung BA 5 mg/l, tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi là 100%, số chồi/mẫu

- 9 -

là 3.76 Khi chuyển sang môi trường MS kích thích tạo rễ thì môi trường bổ sung IBA nồng độ 0.2 mg/l cho kết quả cao nhất với 100% số chồi phát sinh rễ, trung bình 6.5 rễ/chồi Chiều dài rễ lớn nhất là 2.46 cm được thu nhận trên môi trường MS cơ bản

[16]

Ảnh 2.4 Trụ hạ diệp trên môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l kích thích tạo chồi [16]

(A): 1 tuần; (B): 4 tuần; (C): 8 tuần Thang đo = 5mm

Với đối tượng nhân giống in vitro là chồi ngọn (Viện công nghệ Bandung –

Indonesia tiến hành) thì môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi là môi trường MS

bổ sung BA 10.0 M Kết quả thu được 16 – 20 chồi/ chồi ngọn và đa số chồi phát sinh nhiều rễ trên môi trường MS bổ sung NAA 1.0 M (ảnh 2.5) [20]

Ảnh 2.5 Tái sinh chồi từ chồi ngọn [20]

(A): chồi nách sinh ra từ mẫu cấy;

(B): tăng sinh chồi trên môi trường MS bổ sung BA 10 M;

(C): Rễ phát sinh trên môi trường bổ sung NAA 1.0 M; Thang đo = 1cm

- 10 -

2.2 Glucosinolate

2.2.1 Giới thiệu và cấu trúc hóa học

Glucosinolate và các sản phẩm thủy phân của chúng từ lâu đã được biết đến với tên gọi chung là dầu mù tạc (mustard oil) Các dẫn xuất của glucosinolate không những góp phần tạo nên hương vị và mùi thơm đặc trưng của các loại rau họ cải, gia

vị, mà còn đóng vai trò như một chất hoạt động sinh học giúp thực vật tự bảo vệ khi bị thương hoặc bị vi sinh vật tấn công Ngoài ra, glucosinolate còn nội cân bằng auxin

giúp phòng chống ung thư ở người [11]

Các loại rau họ cải như bông cải xanh, cải bắp, cải xoăn, là những nguồn cung

cấp glucosinolate (bảng 2.3) Glucosinolate là một nhóm nhỏ nhưng bao gồm nhiều chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau chứa lưu huỳnh, đặc trưng cho họ cải và chỉ có ở

một số loài thực vật khác (như Arabidopsis thaliana) [11, 25]

Glucosinolate có cấu trúc bao gồm một nhóm isothiocyanate bị sulfat hóa kết hợp với nhóm -D-thioglucose và gốc R là dẫn xuất của các acid amin (hình 2.2) Cả glucose và nguyên tử carbon trung tâm của isothiocyanate đều có thể biến đổi, do đó cấu trúc của glucosinolate rất đa dạng [7]

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của glucosinolate [26]

- 11 -

Bảng 2.3 Hàm lượng glucosinolate ở 1 số loài Brassica

Glucosinolate Hàm lượng glucosinolate (mol/100g trọng lượng tươi)

Bông cải xanh Cải Brussel Súp lơ Bắp cải xanh

 Aliphatic glucosinolate: tiền chất là methionin, alanin, leucin, isoleucin, valin

 Aromatic glucosinolate: tiền chất là phenylalanin, tyrosin

 Indole glucosinolate: tiền chất là tryptophan (Bennett và Wallsgrove, 1994; Mithen, 2001) [5, 12]

Bảng 2.4 cho thấy cấu trúc và phân loại glucosinolate (Iryna S., 2006) [12]

2.2.3 Sinh tổng hợp glucosinolate

Quá trình sinh tổng hợp glucosinolate gồm 3 giai đoạn:

1- Kéo dài chuỗi acid amin

2- Hình thành cấu trúc glucosinolate

3- Biến đổi mạch bên, hoàn tất quá trình sinh tổng hợp

Hình 2.3 mô tả quá trình sinh tổng hợp glucosinolate qua 3 giai đoạn (Grubb và

cs, 2006) [11]

- 12 -

Bảng 2.4 Cấu trúc và phân loại glucosinolate

- 13 -

Hình 2.3 Các giai đoạn trong quá trình sinh tổng hợp glucosinolate [11]

- 14 -

2.2.4 Thủy phân glucosinolate

Glucosinolate bị thủy phân bởi enzyme nội sinh myrosinase ở thực vật, sản phẩm thủy phân là các hợp chất isothiocyanate Khi tế bào thực vật bị tổn thương, myrosinase sẽ được giải phóng Myrosinase là một glycoprotein cùng tồn tại song song với glucosinolate nhưng được cho là nằm tách biệt trong các tế bào “myrosin” (theo Fahey và cs, 2001) [9]

Ở người không tồn tại enzyme myrosinase nhưng vẫn có thể chuyển hóa glucosinolate nhờ hoạt động của hệ vi sinh vật đường ruột (Fahey và cs, 2001) [9]

Hình 2.4 Quá trình thủy phân glucosinolate và cấu trúc một số isothiocyanate [25]

Isothiocyanate là các sản phẩm thủy phân của glucosinolate Mỗi loại glucosinolate khác nhau khi thủy phân tạo ra các isothiocyanate khác nhau (hình 2.4) Một số loại glucosinolate và isothiocyanate tương ứng được nêu ở bảng 2.5 Hiện nay, các nhà khoa học quan tâm đến các hoạt động phòng chống ung thư của các loại

rau có chứa nhiều glucosinolate nói chung, cũng như isothiocyanate nói riêng [25]

Một số procarcinogen (tiền thân của chất gây ung thư) được chuyển hóa bởi enzyme phase I, như cytochrome P450 (CYP), trở thành chất gây ung thư có khả năng gắn kết với DNA và gây đột biến Nếu ức chế enzyme CYP thì có thể ngăn ngừa sự phát triển của bệnh ung thư Isothiocyanate, bao gồm PEITC và BITC, đã được chứng minh là có khả năng ức chế enzyme CYP ở động vật (Conaway và cs, 2002; Hetch, 2000)

Nhiều isothiocyanate, đặc biệt là SFN (sulforaphane), là chất cảm ứng mạnh của enzyme phase II trong việc phục hồi tế bào (Fimognari và cs, 2007; Zhang, 2004) Các enzyme phase II, gồm GST (glutathione S-transferase), UDP-glucuronosyl transferase (UGT), quinone reductase, và glutamate cysteine ligase, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ DNA tế bào không bị tổn thương bởi chất gây ung thư và chất oxy hóa (Kensler và cs, 2004)

- 16 -

Hình 2.5 Cơ chế ngăn chặn ung thƣ của glucosinolate [12]

2.2.5.2 Bảo toàn chu trình tế bào

Sau khi tế bào phân chia, nó đi qua một chuỗi các giai đoạn gọi là chu kì tế bào

trước khi phân chia lại Nếu DNA bị tổn thương, chu trình tế bào có thể bị tạm ngừng

để sửa chữa DNA Nếu DNA không thể sửa chữa, tế bào sẽ chết (Stewart, 2003) Việc

chu kỳ tế bào bị khiếm khuyết có thể dẫn đến đột biến, là tiền đề của ung thư

Một số isothiocyanate, bao gồm AITC, BITC, PEITC, và SFN, có khả năng giảm

thiểu khiếm khuyết diễn ra trong chu kì tế bào (Zhang, 2004)

2.2.5.3 Kháng viêm

Sự viêm nhiễm làm thúc đẩy tế bào phát triển và ức chế apoptosis (cơ chế gây

chết tế bào trong cơ thể), dẫn đến tăng nguy cơ ung thư (Steele và cs, 2003)

SFN và PEITC đã được nghiên cứu làm giảm khả năng gia tăng của các tế bào

viêm nhờ bạch cầu, đồng thời các hợp chất này cũng làm giảm hiện tượng DNA liên

kết với NF-kappaB, yếu tố phiên mã truyền tín hiệu viêm (Gerhauser và cs, 2003; Heiss và cs, 2001)

- 17 -

2.2.5.4 Kháng Helicobacter pylori

Vi khuẩn H pyl ori làm gia tăng đáng kể nguy cơ ung thư dạ dày (Normark và cs,

2003) Thử nghiệm trong ống nghiệm và nuôi cấy mô, SFN có khả năng ức chế sự

tăng trưởng và giết chết nhiều chủng H pylori, bao gồm cả chủng kháng kháng sinh

Cho khoảng 0.1 g mẫu vào 10 ml nước 95°C, đun sôi trong 5 phút Sau đó lắc

mạnh mẫu trong 30 giây và tiếp tục đun sôi thêm 10 phút Do tiến hành ở nhiệt độ cao nên phương pháp này làm tổn thất đáng kể các isothiocyanate dễ bay hơi và bất hoạt

enzyme myrosinase (Martin M F Choi, 2004)

 Trích ly với bộ ba dung môi:

Sử dung bộ ba dung môi gồm: dimethyl sulfoxide, dimethylformamide và acetonitrile (tỷ lệ 1:1:1 về thể tích) Đồng nhất mẫu ở 50°C rồi lọc và ly tâm Phương pháp này cũng cho hiệu suất trích ly cao (Fahey và cs, 1997)

2.2.6.2 Phương pháp định lượng

Do sự đa dạng của nhóm hợp chất này nên người ta có thể định lượng glucosinolale thông qua định lượng trực tiếp glucosinolate (GLS), hoặc thông qua định lượng các sản phẩm từ GLS như glucose hoặc isothiocyanate (ITC)

Các phương pháp thường được sử dụng là sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sắc

ký khí (GC), phương pháp quang phổ hấp thu UV

- 18 -

Phương pháp quang phổ hấp thu UV dựa trên phản ứng ngưng tụ giữa các ITC và 1,2-benzenedithiol hình thành phức 1,3-benzodithiole-2-thione (BDT) (Serkadis và cs, 1999) Phức này có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 365nm Dùng máy quang phổ có

thể định lượng được phức chất này Từ đó suy ra lượng GLS trong mẫu Ngoài ra người ta còn có thể sử dụng các phương pháp khác để định lượng phức chất này

Phương pháp sử dụng thuốc thử 1,2-benzenedithiol có nhiều ưu điểm:

 Phản ứng nhanh với hầu hết các ITC

 Chỉ tạo một sản phẩm BDT từ phản ứng ngưng tụ vòng mà không phụ thuộc vào cấu trúc chuỗi của các ITC và GLS

 Sản phẩm BDT rất ổn định dưới các điều kiện cần thiết cho phản ứng định

Chức năng chính của tất cả các loại rễ là giúp cây bám chặt vào giá thể, hấp thu

và vận chuyển nước, chất khoáng, dự trữ các chất dinh dưỡng hữu cơ trong cây

Có 3 loại rễ: rễ cọc, rễ chùm và rễ bất định

Rễ cọc: rễ đầu tiên xuất hiện ở cây con và đâm sâu xuống mặt đất là rễ sơ cấp, từ

rễ sơ cấp sẽ xuất hiện những rễ bên gọi là rễ thứ cấp Ở thực vật song tử diệp, rễ sơ cấp chiếm ưu thế so với rễ thứ cấp được gọi là hệ thống rễ cọc

Rễ chùm: ở thực vật đơn tử diệp, cây có nhiều rễ nhỏ, không có rễ nào chiếm ưu thế và không đâm sâu xuống đất như rễ cọc gọi là hệ thống rễ chùm

Rễ bất định: là những rễ xuất hiện không từ thành phần của hệ thống rễ, thường

thấy ở thực vật dây leo (N Đ Lượng và cs, 2006) [2]

- 19 -

Hình 2.6 Các loại rễ ở thực vật

2.3.2 Nuôi cấy rễ bất định thu nhận HCTC

Quá trình nuôi cấy rễ bất định thu nhận HCTC bao gồm 4 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Cảm ứng phát sinh rễ bất định từ mẫu cấy (mô sẹo trung gian

hoặc cảm ứng trực tiếp)

 Giai đoạn 2: Nuôi rễ trong môi trường lỏng trong bình tam giác hoặc bioreactor và thiết lập đường cong sinh trưởng (xác định các thành phần môi trường thích hợp nhằm gia tăng sinh khối và tích lũy HCTC)

 Giai đoạn 3: giai đoạn tích lũy HCTC (bổ sung chất cảm ứng, môi trường hoặc tiền chất)

 Giai đoạn 4: nuôi cấy rễ trên quy mô lớn trong bioreactor (xác định phương

pháp thích hợp để nuôi cấy trên quy mô lớn)

Giai đoạn cuối của quá trình trên là thu hồi HCTC từ lượng sinh khối thu được

(Murthy HN và cs, 2008) [14]

Dây leo

- 20 -

Ảnh 2.6 Quy trình nuôi cấy rễ bất định Echinacea purpurea [14]

A Mô sẹo phát sinh từ mẫu lá; B Cảm ứng rễ bất định từ mô sẹo;

C Nuôi cấy trong bình tam giác;

D, E, F Nuôi cấy trong bioreactor 20L, 500L, 1000L

G Rễ bất định sau khi nuôi cấy trong bioreactor

Cho tới nay, rễ bất định được cảm ứng thành công ở nhiều loài thực vật và một số

đã ứng dụng thành công trong sản xuất quy mô lớn Một số nghiên cứu có thể kể đến:

Ở loài nhân sâm núi Panax ginseng (Choi và cs, 2000; Kim và cs, 2002), rễ bất

định được cảm ứng thành công trên môi trường dành cho cây thân gỗ (woody plant medium WPM) bổ sung IBA 14.8 mol/l và được nuôi cấy trong bioreactor dung tích

5 L chứa môi trường WPM bổ sung IBA 24.6 mol/l và sucrose 30g/l Yu (2000) nuôi

rễ trong bioreactor nhỏ sử dụng môi trường MS và nghiên cứu tác động của nồng độ muối và áp lực thẩm thấu lên sự tăng trưởng và sinh tổng hợp ginsenoside của rễ bất định Jeong và cs (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của O2, CO2 và ethylene lên sự tăng sinh khối và tích lũy ginsenoside ở rễ bất định nhân sâm và so sánh với khi nuôi cấy

- 21 -

trong điều kiện không khí có thành phần bình thường (78% N 2, 20.8% O2, 0.9% Ar, 0.03% CO2, Ne, He) Nghiên cứu cho thấy CO 2 và C2H4 làm tăng sinh khối rễ, tuy nhiên chúng lại làm giảm sự tích lũy ginsenoside Mặt khác, nồng độ O2 tăng cao (40%) là nồng độ tối ưu cho sự tăng sinh khối và tích lũy ginsenoside ở rễ Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, lượng ginsenoside tích lũy trong rễ là 12.4 mg/g trọng lượng khô

Min và cs (2007) cảm ứng rễ bất định từ củ Scopolia parviflora và nuôi cấy trên

môi trường B5 bổ sung IBA 0.1 mg/l và sucrose 50 mg/l trong bình tam giác/bioreator

và thiết lập đường cong sinh trưởng Các thông số như thời gian nuôi cấy, sự thông khí được khảo sát khi nuôi cấy rễ trong bioreactor Ở điều kiện nuôi cấy lý tưởng, hàm

lượng scopolamine tích lũy tối ưu là 1.8 mg/g trọng lượng khô và hàm lượng hyoscyamine là 3.3 mg/g

Ở loài củ cải Raphanus sativus, Betsui và cs (2004) [4] đã cảm ứng rễ bất định từ

đoạn rễ củ cải trong môi trường MS ½ bổ sung IBA 0.5 mg/l nhằm thu nhận anthocyanin trong điều kiện tối

Rễ bất định còn được cảm ứng thành công ở loài Echinacea angustifolia (Wu và

cs, 2006) trên môi trường MS ½ bổ sung IBA 2 mg/l và sucrose 50 g/l Điều kiện nuôi

cấy thích hợp để thu nhận các hợp chất phenol và flavanoid là môi trường MS ½ bổ

sung IBA 2 mg/l, sucrose 50 g/l, amoni/nitrate tỉ lệ 5:25 mmol/l, pH 6.0, thể tích nuôi cấy là 10 g/l (trọng lượng tươi) Gần đây, Wu và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng

của nhiệt độ và thời gian chiếu sáng lên sự tăng trưởng và sản xuất acid caffeic ở rễ bất

định E purpurea Nghiên cứu tiến hành khảo sát dãy nhiệt độ 10, 15, 20, 25 và 30 0C Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng sinh khối và sản xuất acid caffeic là 20 0C và thời gian chiếu sáng là 3/12h (sáng/tối)

Hiện nay, phương pháp nuôi cấy rễ tơ, kết quả của sự biến đổi kiểu gen nhờ plasmid Ri của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, có nhiều đặc tính nổi bật trong

nuôi cấy thu nhận HCTC như thời gian cảm ứng nhanh, không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhờ có auxin nội sinh, sản xuất HCTC với sản lượng cao Tuy nhiên, để cảm ứng biến đổi gen người ta sử dụng các đoạn gen marker Đoạn gen

- 22 -

marker được sử dụng phổ biến nhất bao gồm neomycin phosphotransferase II (nptII),

mã hóa cho gen kháng kháng sinh kanamycin và thuốc diệt cỏ như glyphosate (Hensen, 1999) Việc sử dụng các đoạn gen marker khiến các nhà khoa học đặt ra nghi vấn liệu nó có ảnh hưởng đến sức khỏe con người không khi sản phẩm đích là các thực phẩm chức năng Chính vì vậy, phương pháp nuôi cấy rễ bất định trong các bioreactor được kì vọng là phương pháp đáng tin cậy hơn để sản xuất các hợp chất có giá trị dùng trong dược phẩm và dinh dưỡng (theo Murthy và cs, 2008) [14]

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ bất định in vitro

Tuổi và giai đoạn phát triển của cây: sự hình thành rễ từ mô của những cây còn

non dễ hơn là từ cây đã trưởng thành

Vị trí thu mẫu cấy trên cây: về nguyên tắc các mẫu cấy thu được trên cùng một

cơ quan thực vật thì có khả năng tái sinh như nhau nhưng thực tế thì khả năng tái sinh của mỗi mẫu cấy khác nhau do một cơ quan được cấu tạo bởi nhiều mô khác nhau và

có độ tuổi khác nhau Tương tự, mẫu cấy có cùng tuổi nhưng nằm ở vị trí khác nhau

trên cây, hoặc những mẫu cùng tuổi, cùng vị trí nhưng nhận được ánh sáng ở mức độ khác nhau cũng có đáp ứng khác nhau

Kích thước của mẫu cấy: mẫu cấy có kích thước lớn đôi khi dễ tái sinh hơn

những mẫu cấy có kích thước nhỏ do có nguồn dinh dưỡng dự trữ dồi dào hơn Mặt

khác mẫu cấy nhỏ có tỷ lệ diện tích vết thương lớn hơn so với mẫu cấy lớn Vết thương cũng là tác nhân kích thích sự tái sinh của mẫu cấy

Auxin: hầu hết thực vật đều cần auxin để cảm ứng sự ra rễ Khi cảm ứng sự ra rễ

thì cần một nồng độ auxin cao, nhưng để kéo dài phác thể rễ (sơ khởi rễ) thì nồng độ

auxin có thể thấp hơn Ở những loại cây thân thảo người ta thường sử dụng loại auxin

có tác dụng yếu như IAA Cây thân gỗ cần có auxin với nồng độ cao hơn cây thân thảo

để ra rễ IBA và NAA là 2 loại auxin hiệu quả nhất trong sự kích thích ra rễ

Lượng oxi đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh cơ quan từ mẫu cấy Sự

thông khí thường xuyên làm tăng sự ra rễ vì vậy sự ra rễ trong môi trường lỏng sẽ tốt hơn

Ánh sáng có tác dụng cản sự ra rễ

- 23 -

Ngoài ra, sự tạo rễ bất định còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như loài

thực vật, giới tính của chúng, cách đặt mẫu vào môi trường nuôi cấy, số lần cấy chuyền, nồng độ đường, nhiệt độ, pH, nguồn dinh dưỡng khoáng … (N Đ Lượng và

cs, 2006)

2.3.4 Phương pháp làm tăng sản lượng HCTC trong nuôi cấy rễ bất định

Bổ sung chất cảm ứng và tiền chất hữu cơ là 2 phương pháp hữu hiệu nhằm tăng cường sản xuất HCTC trong nuôi cấy rễ bất định Ngoài ra còn có các phương pháp

khác như: tạo điều kiện nuôi cấy thích hợp (nhiệt độ, ánh sáng, bổ sung CĐHSTTV…), tăng cường sự tiết HCTC ra ngoài môi trường, shock thẩm thấu, đồng nuôi cấy …

Sinh tổng hợp HCTC ở thực vật được điều khiển chặt chẽ trong suốt quá trình

phát triển và phụ thuộc vào các điều kiện như stress, sự tấn công của vi sinh vật Các chất cảm ứng như methyl jasmonate (MeJA) hay acid salicylic (SA) thường được sử dụng để cảm ứng tổng hợp HCTC ở rễ bất định Acid jasmonic và MeJA làm chậm lại quá trình sinh trưởng của rễ nhưng lại làm tăng hàm lượng ginsenoside tích lũy trong

rễ ở nhân sâm Do đó, quá trình nuôi cấy rễ bất định nhân sâm trải qua 2 bước: đầu

tiên, nuôi cấy rễ không bổ sung chất cảm ứng nhằm tăng sinh khối (trong 3 tuần) và

sau đó cảm ứng với MeJA 100 mol/l trong 2 tuần cuối Quy trình trên làm gia tăng hàm lượng ginsenoside rõ rệt ở nhân sâm (Kim và cs (2002, 2005))

Mặt khác, khi bổ sung ethephon (50 mol/l) là 1 tiền chất của ethylene trong suốt giai đoạn 1 và MeJA 100 mol/l trong giai đoạn 2 đồng thời làm tăng sinh khối rễ và

cả sản lượng ginsenoside (Bae và cs, 2006) Tương tự, khi sử dụng IBA 25 mol/l và MeJA 100 mol/l cũng làm tăng hàm lượng ginsenoside ở rễ bất định (Kim và cs, 2007)

Trong thực tế chỉ có một số ít nghiên cứu được ứng dụng thành công trên quy mô công nghiệp Thành công đầu tiên thuộc về Choi và cs (2000) Ông đã nuôi cấy thành công rễ bất định nhân sâm và nhân lượng sinh khối lên gấp 150 lần khi nuôi trong air-

- 24 -

lift bioreactor trong 7 tuần Lượng sinh khối thu được lớn hơn rất nhiều so với các nghiên cứu nuôi cấy tế bào, mô sẹo, rễ tơ đã công bố trước đó Khi bổ sung MeJA để

cảm ứng thì lượng ginsenoside (saponin) tăng lên 2.5% (Kim và cs, 2005) Thành công

thứ 2 là của Wu và cs (2007) Nhóm nghiên cứu đã nuôi cấy rễ bất định của Echinacea purpurea trong air lift bioreactor 1000 l Kết quả họ thu được 5.1 kg trọng lượng rễ

khô và rễ thu được có hàm lượng các HCTC cao: acid chichoric (22 mg/g khối lượng

khô), acid clorogenic (5 mg/g) và acid caftaric (4 mg/g) (theo Murthy và cs, 2008) [14]