Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng PECTINASE ở một số chủng BACILLUS

THƯ VIỆN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THỊ MAI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS-TS: PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2010 Lời cảm ơn Để có kết luận văn này, em xin gởi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS-TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Đã đưa phương hướng, mục tiêu hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em suốt trình thực luận văn Em xin gởi lời cảm ơn đến: Anh TRẦN QUỐC TUẤN Đã động viên hỗ trợ em nhiều công việc Em vô biết ơn Thầy Cô khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm Hồ Chí Minh, đặc biệt TS TRẦN THỊ THANH THỦY, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm dành cho em giúp đỡ q báu q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị bạn lớp cao học vi sinh K18 học tập, động viên có trợ giúp cần thiết lúc cho Cuối cùng, xin gởi lời biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ yêu thương ủng hộ tiếp bước đường học vấn Tơi xin cam đoan số liệu trình bày phần kết luận văn thân tơi thực không chép người khác Đặng Thị Mai Phương MỞ ĐẦU Đã từ lâu enzym sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học nghiện cứu khoa học Việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzym có ý nghĩa lớn thúc đẩy quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì nâng cao hiệu kinh tế cho người sử dụng Hiện người ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật ứng dụng nhiều đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzym từ động vật thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất hồn tồn theo qui mơ cơng nghiệp Trong số enzym pectinase có ứng dụng rộng rãi sau amylase protease Trong ứng dụng, pectinase chia làm hai nhóm là: pectinase acid pectinase kiềm Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, dùng li trích chế biến loại nước ép trái cây, rượu tạo sản phẩm đơn bào Pectinase kiềm li trích chủ yếu từ vi khuẩn dùng chế biến có sợi, cơng nghiệp giấy, xử lí nước thải lên men trà, cà phê Nhằm đa dạng hoá nguồn cung cấp enzym pectinase từ vi sinh vật nâng cao hiệu sinh tổng hợp pectinase, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng pectinase số chủng Bacillus ” Mục tiêu đề tài: - Nâng cao hiệu sinh tổng hợp pectinase số chủng Bacillus - Nâng cao hiệu hoạt động chế phẩm enzym pectinase từ chủng Bacillus chọn Nội dung đề tài bao gồm: - Xác định đường kính vịng phân giải pectin enzym pectinase từ sáu chủng Bacillus Từ chọn lọc hai chủng có vịng phân giải lớn - Ni cấy chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc mơi trường ni cấy khác (khơng có chất cảm ứng có chất cảm ứng) để thu nhận enzym pectinase - Xác định so sánh hoạt tính enzym pectinase canh trường vừa thu nhận điều kiện có khơng có chất cảm ứng - Khảo sát loại nguyên liệu cảm ứng thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao - Kháo sát nồng độ chất cảm ứng tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao - Từ nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase chủng vi khuẩn chọn - Khảo sát điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp pectinase chủng vi khuẩn chọn - Tối ưu hố điều kiện ni cấy (nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) quy hoạch thực nghiệm nhằm thu sản lượng pectinase cao - Nuôi cấy thử nghiệm chủng vi khuẩn Bacillus chọn môi trường tối ưu hóa để kiểm tra mơ hình tối ưu - Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu enzym pectinase như: pH, nồng độ chất, nhiệt độ, thời gian phân hủy chất xác định ảnh hưởng số ion kim loại lên hoạt động enzym - Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính chế phẩm enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM PECTINASE 1.1.1 Giới thiệu chung Lịch sử nghiên cứu pectinase người ta hiểu biết cấu trúc pectin chế phân cắt pectin enzym [44] Trong nhiều thập niên gần việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật trở nên phổ biến Nhiều vi sinh vật vi khuẩn, nấm men, nấm mốc có khả sản xuất enzym pectinase Người ta chứng minh rằng: pectinase enzym cảm ứng sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997) [44] Cùng với phát triển sinh học phân tử người ta đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng biểu gen enzym pectinase tế bào chủ khác (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ sử dụng nhiều Saccharomyces (Gognies, 1999; Gognies, 2001) [44] Enzym pectinase nhóm enzym thuỷ phân chất pectin, sản phẩm tạo thành acid galacturonic, galactose, methanol… Đây nhóm enzym thứ ba ứng dụng rộng rãi sau amylase protease [9] Enzym pectinase tìm thấy thực vật bậc cao vi sinh vật Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều lá, củ khoai tây, chanh, cà chua, cỏ ba Trong loại cỏ khác thường có enzym pectinesterase.[16] Nhiệt độ tối ưu enzym pectinase thường khoảng 45-550 C[52] 1.1.2 Các nghiên cứu nước  Nghiên cứu nước Đã có nhiều đề tài nghiên cứu nước enzym pectinase, hướng nghiên cứu tập trung cảm ứng, thu nhận, khảo sát đặc tính, tinh sạch, cố định, ứng dụng enzym pectinase đối tượng chủ yếu vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus  Nghiên cứu nước Pectinase nghiên cứu từ lâu giới với nhiều khía cạnh đa dạng, điều hồ sinh tổng hợp enzym pectinase nghiên cứu đựơc đăng nhiều tạp chí Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase tiến hành nhiều đối tượng khác như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng nghiên cứu nhiều Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000) [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48] Ngày với phát triển sinh học phân tử công nghệ gen, đa số chủng vi sinh vật dùng nuôi cấy thu nhận enzym pectinase chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004) Nhiều cơng trình nghiên cứu tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase chủng vi sinh vật như: Couri công (1995) nghiên cứu “ Sự thao tác gen chủng Aspergillus nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997) “ Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng thể lai chủng Aspergillus” [20], [23], [39], [46] Qua nghiên cứu tác giả nhận thấy nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác gây ảnh hưởng khác đến sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; SolisPereira, 1993; Lisbeth, 2003) Enzym pectinase tổng hợp cảm ứng mạnh mơi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic tổng hợp bị hạn chế môi trường giàu acid galacturonic glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997) [18], [27], [31], [32], [45], [48] Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng nuôi cấy nghiên cứu tổng hợp cảm ứng enzym pectinase thay đổi Vào năm 90 tác giả chủ yếu sử dụng nguồn cabon tinh khiết bổ sung riêng lẻ nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987) Năm 2000, cơng trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng nguồn cacbon khác đến sinh tổng hợp pectinase Aspergillus japonicus 586”, Maria cộng kết hợp nhiều nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy như: pectin glucose, pectin glycerol, gần nghiên cứu hướng tới sử dụng phế liệu, chất thải công nông nghiệp để làm nguồn chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37] 1.1.3 Cơ chất enzym pectinase Pectin chất enzym pectinase Pectinase phổ biến tự nhiên, đặc biệt giới thực vật Về phương diện hoá học, pectin polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch phân tử acid galacturonic liên kết với liên kết - 1,4 glucosid tạo nên Các mạch bên phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose xylose Các nhóm carboxyl* acid galacturonic ester hố phần nhóm methyl trung hịa phần hay hoàn toàn ion Na+, K+ NH4+, hay bị decacboxyl hố …[30] Cơng thức ngun acid galacturonic: C6H10O7 Công thức cấu tạo acid -galacturonic khung cấu tạo phân tử pectin giới thiệu hình 1.1 Hình 1.1: Cấu tạo acid -galacturonic khung cấu tạo pectin Dựa vào loại biến đổi khung sườn mà pectin phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, pectin ( Be Miller, 1986) [30]  Protopectin Đây dạng pectin nguyên thuỷ Khi thuỷ phân giới hạn protopectin tạo pectin hay acid pectinic Đơi khi, protopectin cịn thuật ngữ dùng để mô tả hợp chất không tan nước tìm thấy mơ thực vật ( Kilara, 1982) [30] Protopectin thành phần quan trọng chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết tế bào thực vật với Dưới tác dụng acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay đun sơi, protopectin chuyển hố thành pectin hồ tan [16]  Acid pectic ( acid polygalacturonic) Acid pectic galacturonan có chứa hàm lượng nhóm methoxyl khơng đáng kể Dạng muối acid pectic gọi pectat  Acid pectinic Acid pectinic galacturonan có chứa hàm lượng nhóm methoxyl cao Dạng muối acid pectinic gọi pectinat ( Kilara, 1982) Acid pectinic tồn riêng lẻ có đặc tính độc đáo hình thành dạng geo với đường acid, với số hợp chất khác muối canxi( hàm lượng methyl vừa đủ thấp)[30]  Pectin Pectin tên chung để hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác mà acid pectic thành phần chủ yếu [30] Bảng 1.1: Hàm lượng pectin loại trái [55] Trái Hàm lượng pectin (% trọng lượng tươi) Táo 0,71-0,84 Chuối 0,59-1,28 Cà rốt 1,17-2,29 Nho 0,09-0,28 Bưởi 3,30-4,50 Chanh 2,80-2,99 Cam 2,34-2,38 Mơ 0,71-1,32 1.1.4 Phân loại[30] Dựa vào đặc điểm chất chế phân cắt, enzym pectinase chia thành nhóm chính: - Pectinesterase - Các emzim khử mạch polymer - Protopectinase Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phân loại enzym pectinase[30] Pectinase Pectinesterase Protopectinase Emzim khử polymer Hydrolase PMG PG PMGL PGL Exo-PGL Endo-PGL Exo-PMGL Endo-PMGL Exo-PG Endo-PG Exo-PMG Endo-PMG 1.1.5 Lyase Cơ chế hoạt động enzym pectinase  Trung tâm hoạt động enzym pectinase Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa vùng có 8-10 vịng xoắn kép β quay phía phải; vịng tạo khe liên kết với chất người ta nghiên cứu thấy trung tâm hoạt động enzym có chứa axit amin Aspartic Lysine Người ta thấy có Histidine nằm gần trung tâm hoạt động ảnh hưởng đấn khả xúc tác enzym [53] 1.1.5.1 Pectinesterase(PE) Pectinesterase gọi pectinmethyl hydrolase, xúc tác khử ester hố nhóm methoxyl pectin, tạo thành acid pectic Enzym hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic khơng bị este hố [30] PE PE PE - Thời gian phản ứng: 60 phút - pH: 7( với Bl2), (với Bs4) - Nồng độ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.3 Kết trình bày bảng 3.21 đồ thị 3.10 Bảng 3.22: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nhiệt độ Chủng Bacillus Bl2 Hoạt độ enzim pectinase(UI/g CT) Bs4 Nhiệt độ (0C) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) 30 35 40 45 50 55 60 65 70 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0,214 0,236 0,35 0,365 0,372 0,289 0,254 0,221 0,199 0,185 0,214 0,269 0,328 0,339 0,345 0,245 0,186 0,115 1,038 1,494 2,727 2,936 2,967 2,273 1,801 1,577 1,132 0,755 1,277 2,033 2,610 2,715 2,807 1,954 1,572 0,927 0,824 1,258 2,377 2,571 2,595 1,984 1,547 1,356 0,933 0,570 1,063 1,764 2,282 2,376 2,462 1,709 1,386 0,812 228,823 349,202 659,912 713,671 720,333 550,636 429,424 376,498 258,894 158,223 294,980 489,752 633,542 659,542 683,507 474,485 384,733 225,492 800 720,333 683,507 700 600 500 Bl2 400 Bs4 300 200 100 30 35 40 45 50 55 Nhiệt độ(0C) 60 65 70 Đồ thị 3.10: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nhiệt độ Nhận xét: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ enzym pectinase chủng Bl2 500C, lúc hoạt độ enzym đạt 720,333 UI/g CT Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzym pectinase Bs4 55 C với giá trị hoạt độ enzym 683,507 UI/g CT Như pectinase Bs4 enzym có khả chịu nhiệt tốt pectinase Bl2 3.10.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng lên lượng D- galaturonic tạo thành Thí nghiệm nhằm xác định thời gian phản ứng enzym pectinase hai chủng Bacillus để tạo lượng D- galaturonic nhiều Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn điều kiện nuôi cấy tối ưu xác định Quá trình tách chiết enzym thực theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết dịch enzym thô Các phản ứng enzym tiến hành điều kện: - pH: 7( với Bl2), (với Bs4) - Nồng độ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 - Nhiệt độ: 500C( với chủng Bl2), 550C( với chủng Bs4) Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.4 Kết trình bày bảng 3.22 đồ thị 3.1 Bảng 3.23: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo thời gian phản ứng Chủng Bacillus Thời gian (phút) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) Bl2 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0,214 0,236 0,35 0,365 0,372 0,289 0,254 0,221 0,199 1,038 1,494 2,727 2,936 2,967 2,273 1,801 1,577 1,132 0,824 1,258 2,377 2,571 2,595 1,984 1,547 1,356 0,933 228,823 349,202 659,912 713,671 720,333 550,636 429,424 376,498 258,894 0,185 0,214 0,269 0,328 0,339 0,345 0,245 0,186 0,115 0,755 1,277 2,033 2,610 2,715 2,807 1,954 1,572 0,927 Hoạt độ enzim pectinase(UI/g CT) Bs4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0,570 1,063 1,764 2,282 2,376 2,462 1,709 1,386 0,812 158,223 294,980 489,752 633,542 659,542 683,507 474,485 384,733 225,492 800 719,778 684,340 700 600 500 Bl2 400 Bs4 300 200 100 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian(phút) Đồ thị 3.11: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo thời gian Nhận xét: Ở chủng Bl2 Bs4, hoạt độ enzym pectinase đạt giá trị cực đại 60 p 3.9.5 Khảo sát ảnh hưởng số ion kim loại lên hoạt độ enzym pectinase Thí nghiệm nhằm xác định khảo sát ảnh hưởng số ion kim loại lên hoạt độ enzym pectinase Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn điều kiện nuôi cấy tối ưu xác định Quá trình tách chiết enzym thực theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết dịch enzym thô Các phản ứng enzym tiến hành điều kện: - pH: 7( với Bl2), (với Bs4) - Nồng độ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 - Nhiệt độ: 500C( với chủng Bl2), 550C( với chủng Bs4) - Thời gian phản ứng: 60 phút Tiến hành khảo sát ảnh hưởng số ion kim loại hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.5 Kết trình bày bảng 3.23 Bảng 3.24: Ảnh hưởng hưởng số ion kim loại hoạt độ pectinase OD0 ODt OD Hoạt độ trung trung trung pectinase (UI/g bình bình bình CT) 0,37 2,962 2,592 719,408 100,00 Mg2+ 0,387 3,217 2,830 785,566 109,20 Ca2+ 0,365 3,078 2,713 753,088 104,68 Mn2+ 0,254 1,751 1,497 415,637 57,77 Zn2+ 0,201 1,276 1,075 298,404 41,48 0,342 2,805 2,463 683,692 100,00 Mg2+ 0,343 2,896 2,553 708,767 103,67 Ca2+ 0,351 2,997 2,646 734,490 107,43 Mn2+ 0,235 1,604 1,369 379,921 55,57 Zn2+ 0,267 1,757 1,490 413,602 60,49 Chủng Ion kim Bacillus loại Không bổ sung Bl2 Không bổ sung Bs4 Tỷ lệ % Nhận xét: Kết cho thấy Mg2+ Ca2+ có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym pectinase chủng Bl2 Bs4 Mn2+ Zn2+ có tác dụng ức chế hai enzym Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Qua kết thu được, rút số kết luận sau: Cả sáu chủng Bacillus tiến hành thí nghiệm chọn lọc có khả tổng hợp pectinase, mạnh hai chủng  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis  Chủng Bs4: Bacillus subtilis Khi bổ sung chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis Bacillus subtilis hoạt độ enzym tăng rõ rệt Chứng tỏ enzym pectinase enzym cảm ứng Các nguyên liệu cảm ứng khác gây hiệu cảm ứng sinh tổng hợp pectinase khác Với chất cảm ứng pectin, nồng độ 3% thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Cà rốt nguyên liệu cảm ứng thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase vi khuẩn Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Đã tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tỉ lệ cao nấm men) cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase hai chủng vi khuẩn :  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis: - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,1 - Nhiệt độ: 37,7 0C  Chủng Bs4( Bacillus subtilis) - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,5 - Nhiệt độ: 40,1 0C Xác định điều kiện hoạt động tối ưu enzym pectinase hai chủng vi khuẩn Bacillus:  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis: - pH: - Nồng độ chất: 1,5% - Nhiệt độ: 500C - Thời gian phản ứng: 60phút  Chủng Bs4: Bacillus subtilis - pH: - Nồng độ chất: 1% - Nhiệt độ: 550C - Thời gian phản ứng: 60phút Ion Mg2+ Ca2+ có tác dụng làm tăng hoạt tính, ngược lại, Mn2+ Zn2+ có tác dụng ức chế enzym pectinase chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Hiệu suất thu nhận enzym pectinase từ hai chủng vi khuẩn là: Bacillus licheniformis 72,56%, Bacillus subtilis 71,54% 10 Trong hai chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc thí nghiệm Bacillus licheniformis có hoạt độ pectinase cao Bacillus subtilis Hoạt độ cao xác định chủng Bacillus licheniformis thí nghiệm tiến hành 720,333 UI/g CT (gấp 1,05 lần hoạt độ pectinase vi khuẩn Bacillus subtilis: 683,507 UI/g CT) Tuy nhiên pectinase Bacillus subtilis lại có khả chịu kiềm chịu nhiệt tốt pectinase Bacillus licheniformis 4.2 ĐỀ NGHỊ Từ kết nghiên cứu đạt , để làm tăng hiệu ứng dụng đề tài này, đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm hướng sau: Nghiên cứu thêm ảnh hưởng nguyên liệu cảm ứng khác phế phụ liệu nông nghiệp công nghiệp thực phẩm để sinh tổng hợp enzym pectinase hai chủng vi khuẩn trên, nhằm tận dụng nguồn phế phụ liệu công nông nghiệp nâng cao giá trị sử dụng phế phụ liệu Tinh sạch, xác định thành phần, khối lượng phân tử hệ enzym pectinase hai chủng vi khuẩn Nghiên cứu thêm hệ enzym hydrolase hai chủng vi khuẩn TÀI LIỆU THAM KHẢO  TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzym xúc tác sinh học, Nxb Y Học, Hà Nội [2] Phạm Thị Ánh Hồng(2003), kĩ thuật sinh hóa, Nxb đại học quốc gia TP.HCM [3] Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ loại đất khác thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ Luận văn Thạc sĩ Sinh [4] Nguyễn Đình Lạc, Trần Văn Sỹ, Võ Thị Thứ ctv, 1990 Nghiên cứu kĩ thuật sản xuất baxitraxin phục vụ chăn nuôi Đề tài cấp nhà nước mã số 52D – 01 – 16 Chương trình Cơng nghệ sinh học [5] Lương Đức Phẩm, Tăng Thị Chính, Trần Đình Mẫn.1995 Nghiên cứu thu nhận - amylase chịu nhiệt theo phương pháp bề mặt với chủng Bacillus Tạp chí Khoa Học Và Công Nghệ, 1:15-20 [6] Lê Hồng Phú (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym pectinase cellulase từ Aspergillus niger ứng dụng sản xuất phân hữu cơ, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM [7] Lê Thị Hồng Nga(2005), Nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng pectinase cellulase số chủng nấm mốc, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM [8] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [9] Nguyễn Đức Lượng(2002), Công nghệ vi sinh, tập 2, Nxb đại học quốc gía TP HCM [10] Đặng Thị Thu (2002), Công nghệ enzym, Nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội [11] Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), vi sinh vật tổng hợp, Nxb Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội [12] Đồng Thị Thanh Thu (1998), Giáo trình sinh hóa bản, Tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM [13] Nguyễn Quang Tâm(2002), Nghiên cứu số enzim pectinase hòa tan enzim pectinase cố định thu nhận từ chủng nấm mốc, Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp HCM [14] Lê Đức Ngọc(1998), xử lí số liệu kế hoạch hóa thực nghiệm, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội [15] Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chính (1997), Thực tập lớn sinh hóa, Nxb Đại học Quốc gia TP HCM [16] Lê Ngọc Tú, Nguyễn Chúc (1975), Men công nghệ thực phẩm, Nxb Khoa Học Và Kĩ Thuật, Hà Nội [17] Lê Ngọc Tú (1982), Enzym vi sinh vật, tập 1, Nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội  TIẾNG ANH [18] Aguillar, G.; Huitron, C (1987), “ Stimulation of production of extracellular pectinolytic activities of Aspergillus sp by galacturonic acid and glucose additions”, Enz Microbiol Technol., 9, pp 690-696 [19] Bulla J.A, Costilow R, Sappe E.S.1978 Biology of Bacillus popilliae Adv Appl Microbiol 23: 118 [20] Bai, Z.H.; Zhang, H.X.; Qi, H.Y Peng, X.W (2004), “ pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance”, Bioresource Technology, 95, pp 49-52 [21] Blandino, A.; Dravillas, K.; Cantero, D.; Pandiella, S>S; Webb, C (2001), “Utilisation of whole wheat flour for the production of extracellular pectinase by fungal strains”, Process Biochemistry, 37, pp 497-503 [22] Castilho, L.R.; Medronho, R>A.; Alves, T.L.M (2000), “ Prodution and extraction of pectinase obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with Aspergillus niger”, Bioresource Technology, 71, pp 45-50 [23] Couri, S.; Terzi, S.D.C; Pinto, D.A.S (2000), “ Hydrolytic enzyme production in solid state fermentation by Aspergillus niger3T5B8”, Process Biochemistry, 36, pp 255-261 [24] Dênis Silva (2002), “Pectinase production by Penicillium viridicatum RFC3 by solid state fermentation using agricultural waste and agro-inductrial byproducts” 33,pp 318-324 [25] Droby, S.;Wisniewski,M.E; Cohen,L.; Weiss, B.; Touitou, D.; Eilam, Y.; Chaulutz, E(1997), “ Influence of CaCl2 on Penicillium digicatum, Grapefruit Peel tissue, and Biocontrol Activity of Pichia guilliermondii”, phytopathology, 87, pp.310-315 [26] Bourret R.B, Borkovich K A, Simon M I 1991 Signal transduction pathways involving protein phosphoylation in prokaryotes Annu Rev Biochem 60: 401-422 [27] Guevara, M.A.; Gonzalez-Jen, M.T.; Estevez P (1997), “Multiple forms of pectic lyases and polygalacturonase from Fusarium oxysporum f.sp redicais lycopersici: Regulation of their synthesis by galacturonic acid”, Canadian J Microbiol., 43, pp.245-253 [28] Meadow N D, Fox D K, Roseman S 1990 The bacterial phosphoenolpyruvate glucose phosphotransferase system Anmu Rev Biochem 59: 497-592 [29] Baumann P, Clark A M, Baumann L, Broadwell H A 1991 Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen Properties of the organisms and its toxins Microbiol Rev.55: 425-436 [30] Kashyap, D.R.; Vohra P.K., Chopra, S.; Tewari,R.(2001), “Application of pectinase in the commercial sector: a review”, Bioresource Technology, 77,pp 512-227 [31] Leone, G.; Heuvel, J.; Van Den Heuvel J (1987), “Regulation by carbohidrates of the sequential in vitro production of pectic enzymes by Botrytis cinerea”, Canadial J Bot.,6,pp 2133-2141 [32] Lisbeth Olsson, Kim P Hansen (2003), “influence of the carbon source on production of cellulase, hemicellulase and pectinase by Trichoderma reesei Rut C-30”, Enzym and Microbial Technology, 33, pp 612-619 [33] Aronson A I and Fitz J 1976 Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat Bacteriol Rev 40: 360-402 [34] Maldonado, M.C.; Saad, A.M.S.; Callieri, D.A.S (1989), “Regulatory aspects of the synthesis of polygalacturonase and pectinesterase by Aspergillus niger:, Si Aliments, 9, pp 101-110 [35] Edwards D.L, Payner J, Soares G G 1990 Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against Nematodes U.S Patent 4: 734-948 [36] Stanier J Y, Ingraham J L, Wheellis M L, Paninter D, R 1990 General Microbiology, Macmilan Education Ltd Fith adition: 475-486 [37] Maria, T.F.S.; José L.F.L (2000), “Carbon sources effect on Pectinase production from Aspergillus japonicus 586”, Brazilian Journal of Microbiology, 31(4) [38] Matsuzaki, H., K Yamane, K Yamaguchi, Y.Nagata, and B Maruo 1974 Hybrid a-amylases produced by transformants of Bacillus subtilis I Purification and characterization of extracellular a-amylases produced by the parental strains and transformants Biochim Biophys Acta 356:235247 [39] Octavio L.; Jesús Aguirre (1999), “Pectinase production by a diploid construct from two Aspergillus niger overproducing mutants”, Enzym and Microbial Technology, 25, pp 103-108 [40] Shinke, R., H Nishira, and N Mugibayashi 1974 Isolation of -amylase producing microorganisms Agr Biol Chem 38:665-666 [41] Peter H von Hippel (2004), “Completing the view of transcriptional Regulation”, Science, 35,pp.350-352 [42] Gordon R E, Hayner W C, Pang N H.C.1973 The genus Bacillus, United states Department of Agriculture Washington D.C [43] Reid, I.; Ricard, M (2000), “Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide”, Enzym and Microbial Techolog, 26, pp.115-123 [44] Sathyanarayana, N.G; Panda, T (2003), “Purification and biochemichal properties of microbial pectinase – a review”, Process biochemistry, 38, pp 985-996 [45] Solis- Pereira, S.; Favela-Torres, E.; Viniegra-Gonzales, G.; Gutierrez-Rofas, M (1993), “Effect of different carbon source on the synthesis of pectinase by Aspergillus niger in submergered and solid state fermentation”, Appl Microbiol Biothnol., 39, pp 36-41 [46] Solis, S.; Flores, M.E.; Huitron, C (1997), “ Improvement of pectinase production by interspecific hybrids of Aspergillus Strain”, Lett Appl Microbiol,24,pp 77-81 [47] Priest G.F.Fellow G M, Tood C 1998 A Numerical classification of the genus Bacillus J Gen Microbiol 134: 1847-1882 [48] Taragano, V.; Sachez, V.E.; Pilosof, A.M.R (1997), “Combined effect of water activity depression and glucose addition on pectinases and protease production by Aspergillus niger”, Biotechnol.Lett., 19,pp 223-226 [49] Priest G.F 1993 Genus Bacillus In: Bacteriology 1: 368-397 Edited by Rehm H J and Reed G in cooperation with puhler A and Stadler P Weinherm [50] Wang, G.;Michailides, T.J.;Bostock,R.M(1997), “ improved detection of polygalcturonase activity due to mucor piriformis with a modified dinitrosalicylic acid reagent” phytopathology, 87,pp 161163  INTERNET [51] http://vi.wikipedia.org/wiki [52] http://www.enzymes.co.uk/answer23_pectinase.html [53] http://www.alpha2.bmc.uu.se/Course/PT/Project/Projects2000/anna_project.html [54] http://pdfcast.org/pdf/production-of-bacterial-pectinase-s-from-agro-industrial-wastes-under-solidstate-fermentation-conditions [55] http://aggie_horticulture.tamu.edu/syllabi/422/pdf/phyto_1.pdf [56] http://www.jproeng.com/qikan/manage/wenzhang/208165.pdf [57] http://www.insipub.com/jasr/2008/1708-1721.pdf [58] http://www.springerlink.com/index/0406rt006x661380.pdf [59] http://wxdeguan.en.alibaba.com/ /Alkaline_Pectinase.html [60] http://joi.jlc.jst.go.jp/JST.Journalarchive/bbb1961/36.285 [61] http://www.smbs.buffalo.edu/bch/Courses/bms503/sinha_s_class1.pdf [62] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12172603 [62] http://www.ftb.com.hr/44-221.pdf [63] http://en.wikipedia.org/ /Pectin_lyase [64] http://www.alibaba.com/ /pectinase-enzyme.html [65] http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1359511305001765 [66] http://www-saps.plantsci.cam.ac.uk/ /pectinase.htm [67] http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/L/LacOperon.html [68] http://web.indstate.edu/thcme/mwking/gene-regulation.html [69] http://www.pnas.org/content/97/16/8762.full PHỤ LỤC ĐỒ THỊ CHUẨN ACID GALACTURONIC ĐỂ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PECTINASE THEO PHƯƠNG PHÁP SO MÀU THUỐC THỬ DNS Bảng 1: Tương quan giá trị OD575nm nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) Ống Nồng độ 0,140 0,295 0,431 0,582 0,724 0,137 0,292 0,429 0,579 0,721 nghiệm mg/ml OD575nm 0,003 OD575nm 0,8 y = 0,1441x R2 = 0,9999 0,7 0,6  OD 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Nồng độ D-galacturonic(mg/ml) Đồ thị 1: Tương quan giá trị OD575nm nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG Q TRÌNH THỰC HIỆN LUẬN VĂN 2.1 Vịng phân giải pectin pectinase sáu chủng Bacillus Hình 1: Sự phân giải pectin pectinase B aureus môi trường Czapeck-Dox pectin Hình 2: Sự phân giải pectin pectinase B subtilis(BS1) mơi trường Czapeck-Dox pectin Hình 3: Sự phân giải pectin pectinase B subtilis(Bs3) môi trường Czapeck-Dox pectin Hình 4: Sự phân giải pectin pectinase B licheniformis( Bl2) mơi trường Czapeck-Dox pectin Hình 5: Sự phân giải pectin pectinase B subtilis (BS4) mơi trường Czapeck-Dox pectin Hình 6: Sự phân giải pectin pectinase B subtilis (BS2) môi trường Czapeck-Dox pectin 2.2 Thu chế phẩm petinase thô từ canh trường ni cấy hai chủng Bacillus Hình 7: Tủa enzim chủng B licheniformis (Bl2) cồn Hình 8: Tủa enzim chủng B subtilis (Bs4) cồn Hình 9: Enzim sau sấy khơ chủng B licheniformis (Bl2) Hình 10: Enzim sau sấy khô chủng B subtilis ( Bs4) ... cao hiệu sinh tổng hợp pectinase, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng pectinase số chủng Bacillus ” Mục tiêu đề tài: - Nâng cao hiệu sinh tổng hợp pectinase số chủng Bacillus - Nâng... Aspergillus  Nghiên cứu nước Pectinase nghiên cứu từ lâu giới với nhiều khía cạnh đa dạng, điều hồ sinh tổng hợp enzym pectinase nghiên cứu đựơc đăng nhiều tạp chí Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng. .. hợp cảm ứng vài enzym Chẳng hạn chất tổng hợp cảm ứng β- galactosidlactose (hoặc chất cảm ứng tương tự nó) ngồi khả gây tổng hợp cảm ứng enzym β- galactosidase đồng thời gây tổng hợp cảm ứng