NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

Đã từ lâu enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện cứu khoa học. Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sử dụng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ĐẶNG THỊ MAI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS-TS: PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2010 THƯ VIỆN Lời cảm ơn Để có được kết quả của luận văn này, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS-TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG Đã đưa ra phương hướng, mục tiêu cũng như hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Em xin gởi lời cảm ơn đến: Anh TRẦN QUỐC TUẤN Đã luôn động viên và hỗ trợ em rấ t nhiều trong công việc. Em vô cùng biết ơn các Thầy Cô khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm tp Hồ Chí Minh, đặc biệt là TS. TRẦN THỊ THANH THỦY, đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý báu trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn lớp cao học vi sinh K18 đã cùng tôi học tập, động viên và có những trợ giúp cần thiết đúng lúc cho tôi. Cuối cùng, con xin gởi lời biế t ơn vô hạn đến Ba Mẹ đã yêu thương và luôn ủng hộ con tiếp bước trên con đường học vấn của mình. Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện không sao chép của người khác. Đặng Thị Mai Phương MỞ ĐẦU Đã từ lâu enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện cứu khoa học. Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sử dụng. Hiện nay ng ười ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp. Trong số các enzym thì pectinase có ứng d ụng khá rộng rãi chỉ sau amylase và protease. Trong ứng dụng, pectinase được chia làm hai nhóm chính là: pectinase acid và pectinase kiềm. Pectinase acid chủ yếu được thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong li trích và chế biến các loại nước ép trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được li trích chủ yếu từ vi khuẩn và dùng trong chế biến các cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải và lên men trà, cà phê. Nhằm đa dạng hoá nguồn cung cấp enzym pectinase từ vi sinh vật và nâng cao hiệu quả sinh tổng h ợp pectinase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase của một số chủng Bacillus ”. Mục tiêu của đề tài: - Nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp pectinase của một số chủng Bacillus - Nâng cao hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzym pectinase từ các chủng Bacillus được chọn. Nội dung của đề tài bao gồm: - Xác định đường kính vòng phân giả i pectin của enzym pectinase từ sáu chủng Bacillus. Từ đó chọn lọc một hoặc hai chủng có vòng phân giải lớn nhất - Nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được trên những môi trường nuôi cấy khác nhau (không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng) để thu nhận enzym pectinase. - Xác định và so sánh hoạt tính enzym pectinase trong canh trường vừa thu nhận được trong điều kiện có và không có chất cảm ứng. - Khảo sát loại nguyên liệu cảm ứng thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao. - Kháo sát nồng độ chất cảm ứng tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao nhất. - Từ các nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn. - Khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn. - Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệ t độ, pH, nguồn nitơ) bằng quy hoạch thực nghiệm nhằm thu được sản lượng pectinase cao. - Nuôi cấy thử nghiệm các chủng vi khuẩn Bacillus được chọn trên môi trường tối ưu hóa để kiểm tra mô hình tối ưu. - Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase như: pH, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, thời gian phân hủy cơ chất và xác định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại lên sự hoạt động của enzym. - Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính các chế phẩm enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ENZYM PECTINASE 1.1.1. Giới thiệu chung Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt pectin của những enzym này. [44] Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ biến. Nhiều vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase. Người ta cũng đã chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997). [44] Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre, 1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies, 1999; Gognies, 2001) [44] Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Đ ây là nhóm enzym thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease. [9] Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá. Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzym pectinesterase.[16] Nhiệt độ tối ưu của enzym pectinase thường khoảng 45-55 0 C[52] 1.1.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước  Nghiên cứu trong nước Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzym pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus.  Nghiên cứu ngoài nước Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí. Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhi ều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993; Taragano, 1997; Caltisho, 2000). [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48] Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997) đã “ Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus” . [20], [23], [39], [46] Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzym pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997). [18], [27], [31], [32], [45], [48] Theo thời gian ngu ồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000, trong công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như : pectin và glucose, pectin và glycerol, .gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37] 1.1.3. Cơ chất của enzym pectinase Pectin là cơ chất của enzym pectinase. Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật. Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl * của acid galacturonic có thể được ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na + , K + hoặc NH 4 + , hay bị decacboxyl hoá …[30] Công thức nguyên của acid galacturonic: C 6 H 10 O 7 Công thức cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.1. Hình 1.1: Cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo của pectin Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986). [30]  Protopectin Đây là dạng pectin nguyên thuỷ. Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982). [30] Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thự c vật với nhau. Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan. [16]  Acid pectic ( acid polygalacturonic) Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể. Dạng muối của acid pectic gọi là pectat.  Acid pectinic Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp)[30]  Pectin Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp g ồm nhiều thành phần khác nhau mà trong đó acid pectic là thành phần chủ yếu. [30] Bảng 1.1 : Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [55] Trái cây Hàm lượng pectin (% trọng lượng tươi) Táo 0,71-0,84 Chuối 0,59-1,28 Cà rốt 1,17-2,29 Nho 0,09-0,28 Bưởi 3,30-4,50 Chanh 2,80-2,99 Cam 2,34-2,38 Mơ 0,71-1,32 1.1.4. Phân loại[30] Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia thành 3 nhóm chính: - Pectinesterase - Các emzim khử mạch polymer - Protopectinase Sơ đồ 1.1 : Sơ đồ phân loại enzym pectinase[30] 1.1.5. Cơ chế hoạt động của enzym pectinase  Trung tâm hoạt động của enzym pectinase Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh h ưởng đấn khả năng xúc tác của enzym. [53] 1.1.5.1. Pectinesterase(PE) Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. [30] Pectinase Pectinesterase Emzim khử polymer Protopectinase PMG PG PE PE PE Hydrolase Lyase PMGL PGL Endo - PMG Exo - PMG Endo - PG Exo - PG Endo - PMGL Endo - PGL Exo - PGL Exo - PMGL [...]... vi sinh vật, hơn hẳn ở động vật, thực vật.[11] 1.3.2 Đặc điểm của sự cảm ứng Hiện tượng của sự cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng Đặc điểm này được thể hiện ở chỗ: một chất cảm ứng có thể cùng một lúc gây ra sự tổng hợp cảm ứng của một vài enzym Chẳng hạn chất tổng hợp cảm ứng β- galactosidlactose (hoặc chất cảm ứng tương tự của nó) ngoài khả năng gây ra sự tổng hợp cảm ứng enzym β- galactosidase... chất gây cảm ứng được đưa vào cơ thể Những enzym cảm ứng thường là những enzym thủy phân (hydrolase) Hiện tượng tổng hợp cảm ứng của enzym thường thấy ở vi sinh vật và ở loài có vú Ở vi sinh vật, hiện tượng tổng hợp cảm ứng thường thấy nhất là hiện tượng tổng hợp cảm ứng β- galctosidase (một enzym thủy phân các chất β- galactosid) ở E.coli Ở động vật có vú cũng gặp hiện tượng tổng hợp cảm ứng của nhiều... sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng và phòng chống bệnh 1.3 SỰ CẢM ỨNG SINH TỔNG HỢP ENZYM 1.3.1 Hiện tượng cảm ứng Hiện tượng cảm ứng là hiện tượng làm tăng sự tổng hợp enzym trong tế bào, khi bổ sung một chất nào đó vào môi trường nuôi cấy thì thì sự tổng hợp enzym phân giải cơ chất đó sẽ tăng lên đáng kể Hiện tượng cảm ứng thường biểu hiện rất nhạy cảm ở vi sinh... môi trường ấy thì sự tổng hợp L- threonindeaminase lại chiếm ưu thế [2] 1.3.3 Lịch sử nghiên cứu sự cảm ứng sinh tổng hợp enzym Jacob, Monod và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu về sự điều hòa biểu hiện gen Khi tiến hành nghiên cứu trên operon Lac, họ đã chứng minh được rằng: + Sự điều hòa 3 enzym có liên quan trong chu trình lactose (được mã hóa trong operon Lac) xảy ra ở mức độ biểu hiện... chất cảm ứng sinh tổng hợp pectinase của chủng Bacillus được nghiên cứu 2.3.7.1 Khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng pectin tối ưu Tiền hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trong môi trường bán rắn không bổ sung cơ chất cảm ứng và có bổ sung pectin với tỉ lệ khác nhau 1%, 2%, 3%, 4% Tách chiết enzym Xác định sự biến thiên của hoạt độ Từ đó xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho việc sinh tổng hợp pectinase. .. cơ chế sau: trước hết chất cảm ứng làm tăng quá trình tổng hợp enzym tương ứng, sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzym thứ hai để phân giải nó, tiếp theo sản phẩm thứ hai lại cảm ứng tổng hợp cho enzym thứ ba.[11] Hiện tượng cảm ứng thường có tính chất đặc hiệu, ví dụ: khi thêm DL serin vào môi trường nuôi cấy E coli thì enzym D-serindeaminase được tổng hợp tăng lên 200 lần, trong... nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu 2.3.8 Phương pháp khảo sát một số điều kiện môi trường nuôi cấy thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất của Bacillus Bên cạnh cơ chất cảm ứng có vai trò quan trọng đối với quá trình tổng hợp enzym thì các yếu tố khác của môi trường như nguồn nitơ, nguồn chất khoáng, yếu tố pH, nhiệt độ, độ ẩm, … cũng ảnh hưởng đáng kể quá... Chất cảm ứng Nếu không có chất cảm ứng thì dù có đủ ba điều kiện trên thì cũng không tổng hợp được enzym Như vậy, ta có thể coi việc có chất cảm ứng là việc rất cần để thu được những enzym mong muốn Trong công nghiệp sản xuất enzym, cần phải lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [11] Hiện tượng tổng hợp cảm ứng. .. gắn chất cảm ứng vào protein kìm hãm Lac; Vì vậy làm tăng sự phiên mã của operon Lac [68] 1.3.5 Chất cảm ứng Trong số các enzym do vi sinh vật tổng hợp, một số enzym bình thường chỉ được tổng hợp với một lượng rất ít , nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng gấp lên nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số chất nhất định vào môi trường nuôi cấy Monob và Cohn (1952) gọi các enzym này là enzym cảm ứng Chất... thêm ảnh hưởng của các yếu tố: nguồn nitơ, pH, nhiệt độ của môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu 2.3.8.1 Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho môi trường nuôi cấy Bacillus để thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trên môi trường bán rắn có bổ sung chất cảm ứng và thời gian nuôi cấy thích hợp theo kết . MAI PHƯƠNG NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 42 40 LUẬN. pectinase từ vi sinh vật và nâng cao hiệu quả sinh tổng h ợp pectinase, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase của một