NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

Đã từ lâu enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện cứu khoa học. Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sử dụng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS-TS: PHẠM THỊ ÁNH HỒNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2010

THƯ

VIỆN

Em xin gởi lời cảm ơn đến:

Anh TRẦN QUỐC TUẤN

Đã luôn động viên và hỗ trợ em rất nhiều trong công việc

Em vô cùng biết ơn các Thầy Cô khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm tp Hồ Chí Minh, đặc biệt là

TS TRẦN THỊ THANH THỦY, đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý

báu trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn lớp cao học vi sinh K18 đã cùng tôi học tập, động viên và có những trợ giúp cần thiết đúng lúc cho tôi

Cuối cùng, con xin gởi lời biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ đã yêu thương và luôn ủng hộ con tiếp bước trên con đường học vấn của mình

Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện không sao chép của người khác

Đặng Thị Mai Phương

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện cứu khoa học Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế biến,…Vì vậy nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sử dụng

Hiện nay người ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp

Trong số các enzym thì pectinase có ứng dụng khá rộng rãi chỉ sau amylase và protease Trong ứng dụng, pectinase được chia làm hai nhóm chính là: pectinase acid và pectinase kiềm Pectinase acid chủ yếu được thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong li trích và chế biến các loại nước ép trái cây, rượu và tạo

ra các sản phẩm đơn bào Pectinase kiềm được li trích chủ yếu từ vi khuẩn và dùng trong chế biến các cây

có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải và lên men trà, cà phê

Nhằm đa dạng hoá nguồn cung cấp enzym pectinase từ vi sinh vật và nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp

pectinase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase của một số chủng

Bacillus ”

Mục tiêu của đề tài:

- Nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp pectinase của một số chủng Bacillus

- Nâng cao hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzym pectinase từ các chủng Bacillus được chọn

Nội dung của đề tài bao gồm:

- Xác định đường kính vòng phân giải pectin của enzym pectinase từ sáu chủng Bacillus Từ đó chọn

lọc một hoặc hai chủng có vòng phân giải lớn nhất

- Nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được trên những môi trường nuôi cấy khác nhau (không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng) để thu nhận enzym pectinase

- Xác định và so sánh hoạt tính enzym pectinase trong canh trường vừa thu nhận được trong điều kiện

có và không có chất cảm ứng

- Khảo sát loại nguyên liệu cảm ứng thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao

- Kháo sát nồng độ chất cảm ứng tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao nhất

- Từ các nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng

hợp enzym pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn

- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn

- Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) bằng quy hoạch thực nghiệm nhằm thu được sản lượng pectinase cao

- Nuôi cấy thử nghiệm các chủng vi khuẩn Bacillus được chọn trên môi trường tối ưu hóa để kiểm tra

mô hình tối ưu

- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase như: pH, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, thời

gian phân hủy cơ chất và xác định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại lên sự hoạt động của enzym

- Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính các chế phẩm

enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ENZYM PECTINASE

1.1.1 Giới thiệu chung

Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt

pectin của những enzym này [44]

sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase Người ta cũng đã chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau (Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997) [44]

Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre,

1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies,

1999; Gognies, 2001) [44]

Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Đây là nhóm enzym thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và protease [9]

Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzym pectinesterase.[16]

1.1.2 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

 Nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzym pectinase trên đối tượng

chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus

 Nghiên cứu ngoài nước

Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí

Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác

nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001),

Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được

nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993;

Taragano, 1997; Caltisho, 2000) [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48]

Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004) Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng

Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997) đã “ Cải thiện

việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus” [20], [23], [39], [46]

khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003) Enzym pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997) [18], [27], [31], [32], [45], [48]

Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym pectinase cũng thay đổi Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987) Năm 2000, trong công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của

Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường

nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và glycerol, gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37]

1.1.3 Cơ chất của enzym pectinase

Pectin là cơ chất của enzym pectinase Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật

Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4 glucosid tạo nên Các mạch bên của phân tử pectin

Công thức cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.1

Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986) [30]

Đây là dạng pectin nguyên thuỷ Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid pectinic Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982) [30]

Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan [16]

Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể Dạng muối của acid pectic gọi là pectat

Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982) Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp)[30]

Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác nhau mà trong đó acid pectic

là thành phần chủ yếu [30]

Bảng 1.1: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [55]

1.1.5 Cơ chế hoạt động của enzym pectinase

 Trung tâm hoạt động của enzym pectinase

Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đấn khả năng xúc tác của enzym [53]

Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của enzym pectinesterase(PE) [13]

1.1.5.2 Protopectinase

Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao [30]

1.1.5.3 Các enzym khử mạch polymer

Chia làm 2 tiểu nhóm:

a Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase)

có mức độ ester hoá cao Polymethylgalacturonase gồm 2 loại:

- Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin

Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)[13]

-Exo-PMG: phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin

Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)[13]

polygalacturonic), gồm 2 loại:

- Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên

liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic

Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG)[13]

- Exo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt

liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử

Endo-PG

COOH COOH

COOH

Exo-PG

COOH

Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin [69]

Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm:

pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại:

- Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết

α-1-4-glycosid của pectin

- Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin

- Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết

α-1-4-glycosid của acid pectic

- Exo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết

α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử

1.1.6 Ứng dụng pectinase

Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase được chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase

kiềm Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây,

rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào Pectinase kiềm được ly trích chủ yếu từ vi khuẩn được dùng trong

chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải, lên men trà, cà phê [30]

Bảng 1.2: Một vài ví dụ về pectinase acid và pectinase kiềm của vi sinh vật

Vi sinh vật Loại pectinase

Aspergillug niger CH4 Endo-pectinase

Exo-pectinase

Penicillium frequentans Endo-PG

Sclerotium rolfsii Endo-PG

Pectinases acid Rhizoctonia solani Endo-PG

Rhizoctonia solani Endo-PG

(Nguồn: Kashyap et al., 2001)

1.1.6.1 Ứng dụng trong công ngiệp nước ép trái cây và rượu vang

Pectinase được dùng rộng rãi trong công nghiệp nước ép trái cây và rượu vang Pectinase được bổ sung nhằm làm tăng hiệu suất li trích nước ép và làm trong nước ép trái cây Trong công nghiệp nước ép trái cây, người ta thường tạo ra hai loại nước ép là nước ép trong và nước ép đục (hay purée) Phương pháp tạo nước ép trong thường dùng để tạo nước ép táo, lê, nho, dâu,… Phương pháp tạo nước ép đục được dùng để sản xuất nước ép các loại citrus như cam, chanh, bưởi và nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm

chuối,

Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất nước ép trái cây[30]

 Nước ép trong:

Trong quá trình sản xuất nước ép trong, enzym pectinase được bổ sung hai lần (xem sơ đồ 1.2):

+ Lần một: pectinase có tác dụng làm lỏng lẻo cấu trúc màng tế bào thực vật, giúp làm trong hiệu quả li trích nước ép

+ Lần hai: pectinase được bổ sung cùng với một số enzym khác (nếu cần thiết) nhằm làm trong nước ép trái cây

 Nước ép đục hay purée:

Quá trình sản xuất nước ép đục chỉ cần bổ sung enzym pectinase một lần đầu tiên (xem sơ đồ 1.2) nhằm làm tăng hiệu quả trích li nước ép Để ổn định độ đục của nước ép, sau khi ép người ta xử lí nhiệt

dịch ép để làm bất hoạt enzym [30]

1.1.6.2 Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast

Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast( tế bào trần) cô lập từ tế bào soma(tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai Đây có thể là một công cụ

Bổ sung pectinase lần một

Bổ sung các enzym khác

hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên

(Gleba, 1978)

Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật bằng cách sử lí với enzym pectinase, sau đó tiếp tục xử lí

với enzym cellulase để chuyển mô này thành protoplast Nồng độ của enzym là pectinase 0,5%(W/V) và

cellulase 5%(W/V), chỉnh pH 5,6 bằng HCl 2N

(Tanabe, 1968; Bock, 1983).[ 30]

1.1.6.3 Xử lí nước thải có chứa pectin

Nước thải từ công nghiệp chế biến các loại citrus rất giàu pectin Lượng citrus này chỉ bị vi sinh vật

phân hủy trong quá trình xử lí bùn (Tanabe và cộng sự, 1986) Năm 1987, Tanabe và cộng sự đã thử

nghiệm một quy trình xử lí nước thải mới bằng cách sử dụng những vi sinh vật ưa kiềm Chủng Bacillus

sp (GIR 621) được phân lập từ đất của họ có khả năng sản xuất ra enzym endopectat lyase ngoại bào

trong môi trường kiềm pH 10,0 Người ta chứng minh rằng chủng vi khuẩn này có khả năng loại bỏ hữu

hiệu pectin ra khỏi nước thải

Erwinia carotovora cũng có khả năng tiết endopectat lyase, cũng có tác dụng xử lí nước thải giàu

pectin( Tanabe, 1986), tuy nhiên do chúng có khả năng gây bệnh thực vật nên người ta chỉ xử lí gián tiếp

bằng enzym phân giải pectin được sản xuất ra từ vi khuẩn này

1.1.6.4 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

việc thoát nước qua các phiến lọc sẽ ngày càng giảm Để giải quyết vấn đề này, người ta dùng các khung

lọc có kích thước đủ lớn, tuy nhiên những lỗ này cũng làm cho những phần mịn và những chất độn đi qua

Trong công nghiệp làm giấy hiện đại người ta thêm một số chất trợ giúp thẩm tích vào bột giấy để

giữ những phần mịn và những chất độn trong các phiến giấy và làm tăng tốc độ thoát nước Ngày nay,

công nghiệp giấy và bột giặt đã bắt đầu đùng enzym pectinase để giải quyết những vấn đề trên trong quá

trình sản xuất [30]

Do enzym pectinase kiềm của Bacillus sp và Erwinia carotovora có tác dụng làm mềm hóa mạnh

nên nó được dùng để giầm sợi libe của cây Misumata( Tanabe và Kobayashi, 1987) Những sợi libe đã

được giầm này được dùng để sản xuất giấy Nhật như giấy Washi, giấy Wagami, ( Horikoshi, 1990) Hiệu

quả khi giầm bột giấy với vi khuẩn cao tương tự như phương pháp nấu với tro-soda thông thường [43]

1.1.6.5 Ứng dụng trong quá trình trích li dầu thực vật

Trước đây, dầu từ hạt cây cải dầu (Canola), phôi dừa , hạt hoa hướng dương, hạt cọ, quả ôliu được

sản xuất theo kiểu truyền thống bằng cách li trích dung môi hữu cơ Dung môi thường được sử dụng là

hexan, một chất có khả năng gây ra ung thư Ngày nay người ta sử dụng các enzym phân hủy vách tế bào

thực vật, trong đó hệ enzym pectinase , để li trích dầu thực vật theo phương pháp li trích với nước Các enzym này có tác dụng làm hóa lỏng các thành phần cấu trúc vách tế bào của cây có chứa dầu

Gần đây enzym phân hủy vách tế bào đã được dùng trong quá trình li trích dầu ôliu Các enzym này được thêm vào trong quá trình nghiền hạt ôliu, do đó dầu được phóng thích ra dễ dàng trong quá trình tiếp theo(West, 1996) Ví vậy, việc xử lí enzym làm tăng sản lượng của dầu ôliu Sự tăng sản lượng này

phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, và liều lượng enzym được dùng [30]

1.1.6.6 Ứng dụng trong lên men trà và cà phê

Pectinase đóng vai trò quan trọng trong lên men trà, cà phê Trong quá trình lên men cà phê, người

ta dùng các vi sinh vật phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhầy khỏi hạt cà phê( ba phần tư lớp vỏ nhầy này

enzym pectinase, giai đọan lên men của quá trình chế biến cà phê được thúc đẩy và giảm từ 40-80 giờ còn khoảng 20 giờ Do việc xử lí cá phê với enzym thương mại thì đắt và không kinh tế nên người ta dùng lớp

vỏ nhầy của cà phê thải ra để nuôi vi khuẩn sinh enzym pectinase Canh trường sau khi lên men được lọc

và sau đó phun vào hạt ( Amorim, 1997; Carr,1985; Godfray, 1985)

Pectinase nấm mốc được dùng trong chế biến trà Việc xử lí enzym thúc đẩy quá trình lên men mặc

dù liều lượng của enzym phải được đều chỉnh cẩn thận để tránh tổn hại đến lá trà Việc thêm enzym pectinase cũng cải thiện tính tạo bọt của bột trà bằng cách phân hủy pectin trà (Carr, 1985) [30]

1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS

Cohn (1872) phân loại Bacillus như sau:

Bacillus thuộc Giới : Bacteria

Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli

Bộ : Bacillales

Họ : Bacillaceae

Hình 1.8: Đặc điểm hình thái của Bacillus[51]

1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là nhóm vi khuẩn gram dương, có hình que( trực khuẩn) Chúng có khả năng

hình thành nội bào tử có hình oval hoặc hình cầu [51]

Bảng 1.3: Đặc điểm các nhóm vi khuẩn Bacillus theo khoá phân loại của Priest [47]

oval

Hiếu khí hoặc hiếu khí không nghiêm ngặt, không lên men

1.2.3 Đặc điểm sinh thái của Bacillus

 Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus

Phần lớn vi khuẩn Bacillus cư trú trong đất Một số sống hoại sinh, chúng tiết ra những enzym thuỷ phân cellulose, tinh bột, glucan, pectin và protein Đại đa số vi khuẩn này thuộc nhóm B subtilis ( B

cereus, B licheniformis, B megaterium, B pumilus, B subtilis) và nhóm B sphaericus Số lượng vi

khuẩn Bacillus quyết định độ phì của đất Thông thường, đất trồng trọt chứa khoảng 10- 100 triệu cfu/1g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang, vi khuẩn Bacillus rất hiếm Ngoài những vi khuẩn

kể trên, trong đất giàu dinh dưỡng còn có các loài: B alvei B macerans, B polymyxa Sự có mặt của vi

khuẩn sinh bào tử gắn liền với tính chất đặc trưng của chúng Ví dụ: trong đất kiềm, có nhiều vi khuẩn ưa kiềm, vi khuẩn ưa nhiệt chiếm ưu thế ở những vùng đất có nhiệt độ cao.[49]

Nước và bùn cửa sông có mặt bào tử và tế bào Bacillus, phần lớn là Bacillus nhóm II, đặc biệt B firmus,

và B lentus thường được phân lập từ nước chứa nhiều natri clorua Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn loại này

thường rất ít, nhất là những nơi có nồng độ muối khá cao

Bacillus có mặt ở đại dương tiêu biểu B firmus, B licheniformis, B subtilis và B marinus

 Bacillus ưu nhiệt, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa axit

Một trong những đặc điểm hấp dẫn và lôi cuốn sự chú ý đến vi khuẩn Bacillus trong lĩnh vực công

nghệ sinh học là khả năng chịu nhiệt, chịu lạnh, chịu axit, chịu kiềm của chúng Ngay từ đầu thế kỉ, nhiều

Bacillus ưu nhiệt đã được mô tả và phân loại Theo Gordon[42], Bacillus ưu nhiệt có tên B coagulans, B stearothermophilus, B brevis, B kaustophilus, B thermodenitrificans Từ lâu, enzym Bacillus đặc biệt là

-amylase của Bacillus ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp dệt [3] Enzym của Bacillus ưu nhiệt thường chịu được nhiêt độ cao hơn enzym của Bacillus ưu

nhiệt trung bình (trừ -amylase chịu nhiệt của B licheniformis) Nhiều enzym chịu nhiệt đã được đưa ra

-amylase của B stearothermophilus và biểu hiện tính trạng di truyền trong vi khuẩn ưu nhiệt trung bình giúp giải quyết nhiều vấn đề trong lên men công nghiệp Bởi thế Bacillus ưu nhiệt là đối tượng nghiên

cứu trong nhiều lĩnh vực: sản phẩm công nghệ, tách dòng gen, nguồn gen có lợi

Bacillus có khả năng phát triển trong môi trường có pH cao (8-9) được gọi là Bacillus ưa kiềm Đối

với Bacillus ưa kiềm bắt buộc, pH thích hợp: 10 hoặc cao hơn Chúng không phát triển trong môi trường

có pH trung tính Ứng dụng chính của nhóm Bacillus ưa kiềm trong lĩnh vực công nghệ sinh học là sản xuất enzym công nghiệp Protease của B licheniformis có những tính chất như: chịu nhiệt, chịu pH và

chịu tác nhân oxy hoá được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy

1.2.4 Đặc điểm sinh lí của Bacillus

Phần lớn Bacillus là những vi khuẩn dị đưỡng hoá năng, thu năng lượng do oxy hoá các hợp chất

(B schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO2 và CO là nguồn cacbon duy nhất Một

số loài Bacillus (B subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác (B

sphaericus, B cereus) cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự sinh trưởng Đặc biệt Bacillus

gây bệnh côn trùng (B popilliae, B lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển

trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: NA, NB [19]

1.2.4.1 Quan hệ với oxy

Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào tử trong điều kiện hiếu khí, trao đổi năng lượng thông

qua quá trình lên men hoặc hô hấp hiếm khí

Phần lớn Bacillus nhóm I kỵ khí không bắt buộc, lên men hầu hết các loại đường Bacillus nhóm II phần lớn hiếu khí, chỉ một vài loài lên men B licheniformis lên men glucoza, sản phẩm chính của quá

cereus và B thurigiensis cũng có khả năng lên men glucoza, tạo ra butanediol và acid Riêng B subtilis

rất bí ẩn, chúng là những vi khuẩn hiếu khí nghiêm ngặt nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy, sinh axetoin và 2,3-butaediol từ pyruvat bằng con đường axetolactat Chúng cũng có thể

không phát triển mạnh trong điều kiện kỵ khí như B cereus hoặc B licheniformis

Bacillus nhóm III và VI nhìn chung hiếu khí bắt buộc, không phát triển khi thiếu oxy, nhưng một vài loài khử nitrat bằng phản ứng nitrat kỵ khí

1.2.4.2 Chuyển hoá cacbon

Nhiều loài Bacillus tiết enzym ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hoá các hợp chất cao phân tử

trong môi trường (những chất không thể chuyển vào tế bào vì quá lớn) thành các chất có trọng lượng phân

tử thấp làm nguồn cabon và năng lượng Một số enzym ngoại bào phổ biến của Bacillus được tóm tắt ở bảng 1.3 Amylase và protease có lẽ là hai nhóm enzym quan trọng nhất của chủng Bacillus

Bảng 1.3: Một số enzym ngoại bào của Bacillus[38], [40]

B licheniformis, B macerans, B stearothermophilus

B subtilis, B subtilis var amylosacchariticus, Alkalophilic Bacillus spp

B subtilis

B stearothermophilus, B subtilis, Alkalophilic Bacillus spp

B subtilis var amylosacchariticus

Alkalophilic

Serine-metal

B subtilis var amylosacchariticus

Metal protease

Metal protease

B amyloliquefaciens, B cereus, B licheniformis

B megaterium, B polymyxa, B subtili,

B subtilis var amylosacchariticus

B thermoproteolyticus, B thuringiensis

Halophilic

Tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus được điều khiển bởi cơ chế kiểm tra phức tạp Hệ thống 2

thành phần protein DegS/DegU kiểm tra tổng hợp enzym ngoại bào (-amylase, β- glucanase, cellulase,

xynalase và protease) của Bacillus subtilis và những loài khác đã được công bố[17], [26] Đường phân tử thấp trong môi trường có thể là sản phẩm của hoạt động enzym ngoại bào được chuyển vào tế bào B

subtilis bằng những con đường khác nhau CPTS (cabohidrat phosphotransferase system) là hệ thống

chính chuyển đường vào tế bào CPTS gồm hai thành phần : protein nguyên sinh chất và protein đặc trưng đường (sugar-specific protein) ở trong màng Trong một số trường hợp khác, đường chuyển vào tế bào dưới dạng đường photphat [28] Những loại đường chuyển vào tế bào bằng CPTS: fructose, sucrose, manitol Những loại đường không chuyển vào tế bào bằng con đường CPTS: arabinose, glucose, glycerol, maltose, sorbitol, xylose Riêng đường mannose, raffinose và salicin chuyển vào tế bào chưa được nghiên

cứu chi tiết B sphaericus và một số loài nhóm III và IV hiếu khí nghiêm ngặt chúng không chuyển hoá

hidrat cacbon Nhiều enzym tham gia quá trình chuyển hoá con đường Embden-Mayerhof không có trong

loài B sphaericus Thực tế B sphaericus không thể chuyển hóa hoặc vận chuyển đường hexose hay

đường pentose, chúng sử dụng axetat và axit hữu cơ làm nguồn cacbon và năng lượng

1.2.5 Một vài ứng dụng quan trọng của Bacillus

1.2.5.1 Độc tố diệt côn trùng

Một số Bacillus có khả năng tổng hợp thể vùi bào tử bên trong quá trình hình thành bào tử Thể vùi

được cấu thành từ tiền độc tố protein (có tên -endotoxin đối với B thuringiensis) Thể vùi có hình dạng

và kích thước khác nhau Khi côn trùng ăn phải thể vùi(thường là bào tử), chúng được hòa tan và tiền độc

tố trở thành độc tố làm cho ấu trùng ngừng ăn và cuối cùng chết

 Bacillus tổng hợp độc tố diệt côn trùng

B popilliae là một trong những Bacillus sinh độc tố diệt côn trùng được nghiên cứu và ứng dụng đầu

tiên [19] Thực tế B popilliae chỉ có thể phát triển và sinh bào tử trong ruột ấu trùng bị nhiễm, nhưng

người ta cho rằng loài vi khuẩn này tồn lưu liên tục trong đất

B sphaericus sinh độc tố kép gồm 2 polipeptid có tác dụng gây độc với ấu trùng của một số loài

muỗi [29] Protein này được tổng hợp trong quá trình hình thành bào tử giống protein tiền độc tố của B

thuringiensis

Phần lớn các nghiên cứu đang tiến hành với các chủng thuộc loài B thuringiensis sinh protein thể

vùi trong quá trình hình thành bào tử Thể vùi có hình dạng khác nhau(hình tháp, hình thoi, hình oval) Ngay cả trong cùng một chủng, đôi khi cũng xuất hiện thể vùi dưới dạng khác nhau Khi ở thể dinh

Trong tất cả các trường hợp, khi tế bào bị tan, thể vùi và bào tử đều thoát ra ngoài Phần lớn các chủng B

thuringiensis phân lập được ngiên cứu về tác dụng gây bệnh với côn trùng bộ cánh vảy, nhưng một số tiền

chủng B thuringiensis tiết độc tố - exotoxin bản chất không phải protein Độc tố này được thử nghiệm

với ruồi và không được ứng dụng rộng rãi như -endotoxin

1.2.5.2 Kháng sinh polipeptid của Bacillus

Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh hóa khác như tổng hợp protein tinh thể trong trường hợp B sphaericus, B thuringiensis hay tổng hợp một số chất kháng khuẩn

bản chất polipeptid (baxitraxin, tyroxidin, gramixidin, polymixin) Nhiều kháng sinh polipeptid được mô

tả chi tiết về tính chất hóa học và chức năng Căn cứ vào thành phần cấu tạo và chức năng tác dụng mà người ta chia kháng sinh polipeptid thành 3 lớp:

- Adeine: kháng sinh polipeptid mạch thẳng, ức chế sinh tổng hợp màng tế bào vi khuẩn

- Baxitraxin:kháng sinh mạch vòng, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào

- Gramixidin, polymixin, tyroxidin: cấu trúc mạch thẳng hoặc vòng có tác dụng sửa đổi cấu tạo và chức năng của màng [36]

Baxitraxin là nhóm quan trọng nhất Baxitraxin là một loại kháng sinh bản chất polipeptid gồm 12

loại axit amin được tổng hợp từ loài vi khuẩn B licheniformis và B subtilis Baxitraxin bao gồm các đơn

vị baxitraxin riêng rẽ có kí hiệu A, A1, B, C, D, E, F1, F2, F3, G, trong đó baxitraxin A chiếm phần lớn

(37%)trong các chế phẩm được tạo ra bằng lên men các chủng B licheniformis Baxitraxin có công thức

đồng hóa các axit amin tổng hợp mucopeptid thành tế bào Ngoài ra, baxitraxin còn ức chế hoạt động một

số enzym và ức chế sự phát triển của chủng B licheniformis dưới một số điều kiện nhất định Tuy nhiên nồng độ kháng sinh đủ để ức chế B licheniformis cao hơn nhiều nồng độ kháng sinh để ức chế vi sinh vật

Staphylococus, Haemophilus, Neisseria, Coorynebacterium, Diplococcus, Pneumococi nhưng không có

điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trong 7 loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng và phòng chống bệnh

1.3 SỰ CẢM ỨNG SINH TỔNG HỢP ENZYM

Hiện tượng cảm ứng là hiện tượng làm tăng sự tổng hợp enzym trong tế bào, khi bổ sung một chất nào đó vào môi trường nuôi cấy thì thì sự tổng hợp enzym phân giải cơ chất đó sẽ tăng lên đáng kể Hiện tượng cảm ứng thường biểu hiện rất nhạy cảm ở vi sinh vật, hơn hẳn ở động vật, thực vật.[11]

1.3.2 Đặc điểm của sự cảm ứng

Hiện tượng của sự cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng Đặc điểm này được thể hiện ở chỗ: một chất cảm ứng có thể cùng một lúc gây ra sự tổng hợp cảm ứng của một vài enzym Chẳng hạn chất tổng hợp cảm ứng β- galactosidlactose (hoặc chất cảm ứng tương tự của nó) ngoài khả năng gây ra sự tổng hợp cảm ứng enzym β- galactosidase còn đồng thời gây ra sự tổng hợp cảm ứng của hai enzym khác nữa

là galactosid permease (có tác dụng chuyển cơ chất qua màng tế bào) và galactosid transferase Cả 3 loại enzym này được thực hiện có tính chất hợp đồng về số lượng

Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền Trong một hệ thống bao gồm nhiều phản ứng, cơ chất đầu tiên của hệ thống có thể cảm ứng quá trình tổng hợp tất cả các enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa nó Điều này được thực hiện theo cơ chế sau: trước hết chất cảm ứng làm tăng quá trình tổng hợp enzym tương ứng, sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzym thứ hai để phân giải

nó, tiếp theo sản phẩm thứ hai lại cảm ứng tổng hợp cho enzym thứ ba.[11]

Hiện tượng cảm ứng thường có tính chất đặc hiệu, ví dụ: khi thêm DL serin vào môi trường nuôi cấy E coli thì enzym D-serindeaminase được tổng hợp tăng lên 200 lần, trong khi hàm lượng L-

vào cũng môi trường ấy thì sự tổng hợp L- threonindeaminase lại chiếm ưu thế [2]

1.3.3 Lịch sử nghiên cứu sự cảm ứng sinh tổng hợp enzym

Jacob, Monod và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu về sự điều hòa biểu hiện gen Khi tiến hành nghiên cứu trên operon Lac, họ đã chứng minh được rằng:

+ Sự điều hòa 3 enzym có liên quan trong chu trình lactose (được mã hóa trong operon Lac) xảy ra

ở mức độ biểu hiện gen chứ không phải bằng cách hoạt hóa tiền chất enzym

+ Chất cảm ứng tác động vào chất kìm hãm sự phiên mã chứ không phải bằng cách hoạt hóa một

“protein cảm ứng”

Sau đó, Gilber và Muller-Hill, những người đã cô lập được chất kìm hãm operon Lac, đã chứng minh in vitro rằng chất kìm hãm này đã gắn vào một vị trí trên ADN đặc hiệu nằm gần promoter của operon Lac

Sau đó, Record và cộng sự đã chứng minh rằng sự liên kết giữa chất kìm hãm operon Lac với DNA hoàn toàn là liên kết tĩnh điện

Năm 1970, Riggs và cộng sự đã chứng minh rằng chất kìm hãm operon Lac nhận biết đích operator của nó với một tốc độ nhanh hơn nhiều so với một phản ứng được điều khiển bằng sự truyền tin

Berg và cộng sự đã phân tích định lượng Họ đã đưa ra 3 cơ chế xác định làm thế nào chất ức chế

xác định vị trí operon của nó Ba cơ chế đó là sự trượt, sự chuyển đổi hai giai đoạn, và sự di chuyển từ nơi

này qua nơi khác[41]

1.3.4 Mô hình cảm ứng operon Lac

1.3.4.1 Cấu trúc operon Lac

Dựa vào chức năng của các gen tham gia vào quá trình tổng hợp protein có thể phân thành các loại

gen như sau:

+ Gen

Promoter (P):

đứng trước gen operator, là vị trí liên kết

RNA polymerase

Promoter điều khiển việc nhận biết vị trí khởi đầu phiên mã của RNA polymerase Ở vi khuẩn, hai trình tự consensus quan trọng trong promoter là TATAAT ( ở vị trí -10) và

TTGACA ( ở vị trí -35)

Hình 1.9: Cấu trúc của Operon Lac [66]

+ Gen điều hòa(i): gen này mã hóa cho một protein đặc biệt gọi là chất kìm hãm (repressor) Chất

kìm hãm có vai trò “đóng mở” gen operator Do đó, gen điều hòa có thể kiểm tra quá trình sao chép gen

cấu trúc thông qua chất kìm hãm này

Protein kìm hãm được tạo thành từ bốn chuỗi polypeptid (homotetramer)

Trên protein kìm hãm có hai vị trí liên kết: một gắn với một trình tự gồm 24 cặp base của operator trong

operon Lac và một gắn với chất cảm ứng lactose Protein kìm hãm gắn với DNA chủ yếu bằng liên kết

tĩnh điện được tạo thành giữa các acid amin tích điện dương của protein (ví dụ; Lys, Arg, …) với khung

sườn deoxyribose-phosphat tích điện âm của DNA

+ Gen operator (O): Ở cạnh nhóm gen cấu trúc, đảm bảo cho quá trình sao mã các gen cấu trúc

theo cơ chế ‘đóng mở” tựa công tắc của một dãy đèn Quá trình sao chép chỉ có thể tiến hành khi gen

Promoter của

gen điều hòa(Pi)

Gen điều hòa(i)

Promoter của gen cấu trúc(Plac )

Gen cấu trúcOperator

Operon Lac

operator ở trạng thái “mở” (không kết hợp với một chất nào cả) và ngừng lại khi nó bị đóng ( kết hợp với một chất đặc biệt gọi là chất kìm hãm)

Các gen cấu trúc cùng với gen operator tạo thành một đơn vị sao chép sơ cấp gọi là operon Sự tổng hợp ARNm được bắt đầu ở một đầu của operon và chuyển qua gen cấu trúc đến đầu kia của operon

+ Gen cấu trúc (S): Gen cấu trúc mã hóa enzym (hay protein) cần được tổng hợp Các gen mã hóa

các enzym được xắp xếp liền nhau thành một nhóm trên ADN Chúng làm khuôn để tổng hợp phân tử ARN thông tin ( mARN) để từ đó tổng hợp nên phân tử protein tương ứng

Trong operon Lac có ba gen cấu trúc:

 Gen Z: Mã hóa cho enzym β-galactosidase (β-gal) Enzym này thủy phân lactose thành glucose

và galactose Khi được cảm ứng bằng lactose, số lượng enzym β-galactosidase tăng từ hầu như bằng không lên đến khoảng 2% trọng lượng của tế bào.[67],[68]

 Gen Y: Mã hóa cho gen permease Enzym này làm tăng tính thấm của màng tế bào với các galactosid Permease vận chuyển lactose từ môi trường nuôi cấy qua màng tế bào chất để vào bên trong của tế bào [67],[68]

β- Gen A: Mã hóa cho enzym transacetylase Chức năng của enzym này chưa được hiểu rõ [67],[68]

+ CAP: là một trình tự gồm 16 cặp base nằm phía trước promoter, là vị trí mà protein CAP

(catabolite activator protein) gắn với DNA Protein CAP hay còn gọi là protein CRP(cAMP receptor protein) có khả năng hoạt hóa sự biểu hiện của operon Lac Giống như chất kìm hãm, trên protein CAP có hai vị trí: một gắn với cAMP và một gắn với trình tự CAP trên ADN Protein CAP chỉ có thể gắn với DNA khi ở trạng thái phức hợp với cAMP Phức hợp này sẽ gắn vào một vùng nằm phía trước của vùng

sẽ liên kết với RNA polymerase (promoter) và che phủ vị trí gắn của chất kìm hãm trên operator Vì vậy, chất kìm hãm không gắn được vào trên operator, nên thúc đẩy sự phiên mã của RNA polymerase Việc gắn phức hợp cAMP-CRP vào operon Lac kích thích hạt động của RNA polymerase lên gấp từ 20 đến 50 lần [67],[68]

1.3.4.2 Sự cảm ứng operon Lac [11], [61], [68]

Sự cảm ứng bởi cơ chất ở operon Lac là một quá trình điều hòa phiên mã (điều hòa ở mức độ gen) [61]

Năm 1961, Jacob và Monob đã đưa ra mô hình cảm ứng ở operon Lac gồm 5 bước như sau:

 Bước 1: Gen điều hòa (gen i) mã hóa tạo ra protein kìm hãm có khả năng gắn vào operator và

ức chế sự phiên mã của các gen cấu trúc

 Bước 2: Một chất cảm ứng có phân tử lượng nhỏ tạo ra phức hợp với chất kìm hãm và làm biến đổi chất kìm hãm

 Bước 3: Phức hợp chất cảm ứng-chất kìm hãm không gắn được vào operator

 Bước 4: Sự lỏng lẻo này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiên mã các gen cấu trúc

 Bước 5: Trình tự RNA thông tin được dịch mã thành protein

 Khi môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng

Trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng (lactose), gen điều hòa (gen i) tạo ra protein kìm hãm Protein này được tổng hợp không có một sự điều chỉnh nào nhưng tồn tại một lượng không đáng

kể (khoảng 10-20 phân tử trong tế bào) Protein kìm hãm có ái lực lớn với operator và gắn vào vùng operator của operon Lac, ngăn cản RNA polymerase phiên mã operon Lac Vì vậy thông tin di truyền trên DNA không được sử dụng [11]

Hình 1.10: Hoạt động của Operon Lac trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng[66]

 Khi môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng

Khi có chất cảm ứng trong môi trường nuôi cấy, chất cảm ứng gắn vào protein kìm hãm và làm thay đổi hình dạng của protein này; vì vậy, nó không có khả năng gắn vào operator của operon Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho enzym RNA polymerase trượt trên operon và tiến hành quá trình phiên mã RNA thông tin được tạo ra trong quá trình phiên mã sẽ tạo ra các enzym β- galactosidase, permaese và transacetylase [11]

Hình 1.11: Hoạt động của Operon Lac trong môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng[66]

Thực tế trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, khi môi trường có chứa glucose, chất ức chế operon Lac sẽ gắn vào vùng operator của operon Lac và ngăn cản sự phiên mã Tuy nhiên, khi có chất cảm ứng của operon Lac (lactose, allolactose,…), chất cảm ứng này sẽ gắn với protein ức chế, vì vậy, nó không có

khả năng tương tác với vùng operator của operon RNA polymerase có thể gắn vào vùng promoter và tiến hành phiên mã operon đó Khi môi trường có glucose, operon Lac vẫn bị kìm hãm mặc dù vẫn có chất cảm ứng lactose trong môi trường Sự kìm hãm này duy trì cho đến khi nguồn glucose cạn kiệt Sự kìm hãm operon Lac như trên gọi là sự kiềm hãm dị hóa Sự kiềm hãm dị hóa là do mức độ cAMP thấp trong môi trường có nguồn glucose dồi dào Vì vậy, nếu ta thêm cAMP vào môi trường giàu glucose thì sự kiềm hãm operon Lac sẽ được giảm đi Khi lượng glucose trong môi trường giảm thì lượng cAMP sẽ tăng lên , đồng thời, làm tăng gắn chất cảm ứng vào protein kìm hãm Lac; Vì vậy làm tăng sự phiên mã của operon Lac [68]

1.3.5 Chất cảm ứng

Trong số các enzym do vi sinh vật tổng hợp, một số enzym bình thường chỉ được tổng hợp với một lượng rất ít , nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng gấp lên nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số chất nhất định vào môi trường nuôi cấy Monob và Cohn (1952) gọi các enzym này là enzym cảm ứng Chất gây nên hiệu quả này gọi là chất cảm ứng

Chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzym hay những chất tương tự như cơ chất hoặc những sản phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất.[68], [11]

1.3.6 Sinh tổng hợp enzym cảm ứng

Cơ thể sống tự tổng hợp cho mình những hệ thống enzym theo nhu cầu và khả năng của cơ thể Trong cơ thể sống, sự tổng hợp enzym xảy ra một cách liên tục để đổi mới cho những enzym đã bị già cỗi thoái hóa, hoặc thay thế những enzym đã mất đi, hoặc tăng thêm số lượng cho nhu cầu phát triển của cơ thể Có những enzym được tổng hợp nên với tốc độ ổn định và tồn tại với số lượng ổn định, không phụ thuộc vào trạng thái chuyển hóa của cơ thể; những enzym này được gọi là enzym cấu tạo Nhưng cũng có những enzym bình thường tồn tại với số lượng tương đối ít, nhiều khi khó phát hiện, chỉ khi có nhu cầu cần thiết thì sự tổng hợp enzym đó mới được thực hiện, làm tăng số lượng lên một cách đột ngột, đó là hiện tượng tổng hợp cảm ứng của enzym và enzym này gọi là enzym cảm ứng [1]

Muốn tổng hợp được enzym cảm ứng cần phải có 4 điều liện sau:

a Có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể của tế bào

b Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng enzym đó (các acid amin và các hợp phần của coenzym

nếu enzym đó gồm hai cấu tử)

c Năng lượng cần thiết cần cho việc tổng hợp enzym

d Chất cảm ứng Nếu không có chất cảm ứng thì dù có đủ ba điều kiện trên thì cũng không tổng hợp

được enzym

Như vậy, ta có thể coi việc có chất cảm ứng là việc rất cần để thu được những enzym mong muốn Trong công nghiệp sản xuất enzym, cần phải lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [11]

Hiện tượng tổng hợp cảm ứng của enzym xảy ra khi có chất gây cảm ứng được đưa vào cơ thể Những enzym cảm ứng thường là những enzym thủy phân (hydrolase) Hiện tượng tổng hợp cảm ứng của enzym thường thấy ở vi sinh vật và ở loài có vú Ở vi sinh vật, hiện tượng tổng hợp cảm ứng thường thấy nhất là hiện tượng tổng hợp cảm ứng β- galctosidase (một enzym thủy phân các chất β- galactosid) ở E.coli Ở động vật có vú cũng gặp hiện tượng tổng hợp cảm ứng của nhiều enzym như : tryptophan dioxygenase, threonin dehydrase, invertase, Hiện tượng tổng hợp cảm ứng ở vi sinh vật có thể xảy ra vài ba phút sau khi cho chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy Trái lại, ở động vật, hiện tượng này xảy ra chậm hơn nhiều và nồng độ enzym cảm ứng sau nhiều giờ, nhiều ngày, có khi cả tháng mới tăng lên rõ rệt [1]

Sự cảm ứng của enzym là một cơ chế dự bị để đảm bảo cho sự chuyển hóa của tế bào được thực hiện một cách bình thường khi có những thay đổi không thuận lợi trong thành phần của môi trường [1]

Qua nhiều thí nghiệm với nhiều cơ chất khác nhau, người ta nhận thấy những hợp chất cacbon dễ dàng được vi sinh vật đồng hóa có tác dụng kìm hãm và ức chế quá trình tổng hợp enzym cảm ứng Sự tổng hợp cảm ứng chỉ thấy ở các môi trường không chứa nguồn cacbon dễ đồng hóa (ví dụ: glucose) Ngay khi

sự cảm ứng đã bắt đầu ta cũng có thể ngăn cản hiện tuợng này bằng cách cho thêm glucose vào môi trường Người ta gọi đó là hiệu ứng glucose [1]

Ví dụ: Khi bổ sung glucose vào môi trường sẽ xảy ra hiện tượng ức chế và kìm hãm quá trình sinh tổng hợp amylase Vì vậy trong sản xuất không nên thêm vào môi trường các nguồn cacbon dễ đồng hóa hoặc chỉ thêm vào một lượng rất hạn chế để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển lúc đầu mà thôi.[11]

1.3.7 Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzym

Thông tin về sự tổng hợp enzym hay bất kì một protein nào đều đã được mã hóa trong nhân tế bào Vì vậy sự điều hòa sinh tổng hợp enzym (hay protein) có thể xảy ra ở mức độ gen Cơ chế điều hòa luôn diễn

ra theo nguyên tắc tiết kiệm và đạt hiệu quả cao nhất [1]

Sự tổng hợp cảm ứng enzym bởi cơ chất và ức chế tổng hợp enzym bởi sản phẩm cuối cùng là hai quá trình liên quan mật thiết với nhau và được điều hòa trong quá trình phiên mã (điều hòa ở mức độ gen) Cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzym được giải thích theo học thuyết operon ở E.coli nổi tiếng của Jacob nà Monod năm 1961 (đã được trình bày ở mục 1.3.4) Theo học thuyết này cơ thể sống chỉ tạo ra một lượng đáng kể những enzym cảm ứng khi có mặt chất cảm ứng Còn những enzym bản thể thường xuyên được tạo thành với mức độ đáng kể hoặc tối đa cả trên môi trường không có chất cảm ứng

mà enzym tác dụng [61]

Ngoài cơ chế điều hòa enzym ở mức độ gen như đã trình bày ở trên, trong quá trình sống của tế bào còn có kiểu điều hòa ở mức độ enzym theo nguyên tắc liên kết ngược hay còn gọi là cơ chế dị lập thể (alosteric) điều hòa tổng hợp các chất trao đổi Sự tổng hợp phần lớn các sản phẩm trao đổi chất thường xảy ra ở nhiều giai đoạn, ở mỗi giai đoạn được thực hiện bởi một enzym xác định Enzym này khác với những enzym khác ở chỗ ngoài khả năng tác động lên chất cảm ứng còn có tính nhạy cảm với sản phẩm cuối cùng Sản phẩm cuối cùng được tích tụ trong tế bào tới một nồng độ xác định sẽ ức chế hoạt động của enzym đầu tiên làm cho cả chuỗi phản ứng bị ngừng lại Enzym tuy vẫn được tổng hợp nhưng bị bất hoạt Kết quả là tế bào tạm ngừng tổng hợp sản phẩm cuối cùng cho tới khi nào nồng độ chất này không còn dư Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzym theo nguyên tắc liên kết ngược xảy ra như sau: enzym ở giai đọan đầu kết hợp với sản phẩm cuối cùng làm biến dạng bề mặt hoạt động, do đó nó không còn khả năng xúc tác phản ứng trong chuỗi phản ứng Người ta gọi biến dạng này là biến dạng dị lập thể và những

hệ thống enzym có thể bị biến dạng bởi các chất chuyển hóa được gọi là hệ thống dị lập thể [11]

Dẫn chứng cho quá trình điều hòa dị lập thể là quá trình sinh tổng hợp valin từ acid pyruvic qua bốn giai đoạn nhờ bốn enzym xúc tác tương ứng (hình 1.10) Khi sản phẩm cuối cùng là valin đạt được nồng

độ cao nó sẽ tác dụng với enzym ban đầu, làm nó biến dạng và mất hoạt động [11]

Hình 1.12: Sự điều hòa enzym theo nguyên tắc liên kết ngược( biến dạng dị lập thể) [11]

Acid

pyruvic Acid α-acetolactic Acid α, β-

dioxyisovaleric

Acid α- cetoisovaleric

Valin Enzym I Ức chế enzym

Enzym IV Enzym III

Enzym II

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu: Các chủng Bacillus do phòng thí nghiệm, bộ môn Sinh hóa,

trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

2.1.2 Nguyên liệu sử dụng làm cơ chất

- Pectin (hãng Merck)

- Cà rốt

- Vỏ bưởi

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường giữ giống: MT MPA

Dụng cụ: thước đo khuẩn lạc, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang,

que cấy, giấy lọc, giấy báo cũ, bông mỡ, bông thấm nước, đũa khuấy, phễu, ống đong, nồi nấu môi trường, lò điện, vải lọc …

Cao thịt, pepton, cao nấm men, pectinase, agar, cồn, trấu, cám

phương pháp sẽ nêu cụ thể

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Phương pháp cấy truyền và giữ giống

Trên môi trường ghi ở mục 2.1.3 Tiến hành cấy truyền định kì một tháng một lần, để tủ ấm

[8][2]

2.3.2 Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzym pectinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải

Nguyên tắc: Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục

môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt Độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng hoạt động của enzym

xác định chính xác hoạt độ pectinase

Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường ghi ở mục 2.1.3 đã tiệt trùng Đem ủ 48 h ở

giải Sau đó kết luận các chủng Bacillus đem nghiên cứu có tạo enzym pectinase hay không, nhiều hay ít

[4] [5] [6]

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Bacillus

Sau khi hấp khử trùng, các erlen chứa môi trường bán rắn ở mục 2.1.3 được để nguội

Giống vi khuẩn Bacillus được giữ trong ống thạch nghiêng được cấy vào trong các erlen Cho vào

10ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng, hòa đều Dùng que thủy tinh khuấy nhẹ để các tế bào và

bào tử Bacillus hòa lẫn trong nước Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 600nm Cho vào mỗi erlen

1g canh trường Nuôi cấy ở các điều kiện (nhiệt độ, pH,…) thích hợp theo từng thí nghiệm, độ ẩm

50-60%.[8]

2.3.4 Phương pháp chiết dung dịch enzym từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn

Cho vào mỗi erlen 50ml nước cất, khuấy trộn trong 30 phút và lọc lấy dịch lọc đem dịch lọc li tâm 7000vòng/ phút trong 15 phút, thu phần dịch trong bên trên và đem xác định họat tính enzym pectinase trong dung dịch enzym thu được [21]

2.3.5 Xác định hoạt độ pectinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) [25] [50]

 Phương pháp so màu

Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất Phân tích bằng phương pháp này mất ít thới gian so với các phương pháp hóa học khác

 Nguyên tắc

Cho enzym tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic được hiện màu với thuốc thử DNS (acid dinitrosalicylic) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm

 Định nghĩa đơn vị hoạt tính

Một đơn vị họat tính pectinase là lượng enzym cần thiết để giải phóng một µmol acid D-galacturonic

 Hóa chất

- Dung dịch đệm acetat 0,1 M, pH 4,2 (dung dịch đệm thí nghiệm)

- Thuốc thử DNS:

+ Dung dịch A: hòa tan trong 300g muối Na-K tartrat kép vào 500ml nước cất

+ Dung dịch B: hòa tan trong 10g acid 3,5-dinitrosalicylic vào trong 200ml dung dịch NaOH 2M Thuốc thử DNS dùng cho phản ứng: trộn dung dịch với dung dịch B, thêm nước cất đủ 1 lít Chỉ pha

- Dung dịch D-galacturonic chuẩn 100 µmol/ml

- Dung dịch pectin 1%: đun nóng 100ml dung dịch đệm thí nghiệm Trong khi đun và khuấy, cho từ

từ 1g pectin, đun và khuấy đến khi tan Dung dịch trong và có dạng keo Không đun sôi dung dịch Làm

- Dung dịch enzym: hòa tan một lượng enzym nhất định trong dung dịch đệm và bảo quản trong ngăn

đá

 Cách tiến hành

Cho vào ống nghiệm :

- 0,5ml dung dịch pectin 1% pha trong đệm acetat 0,1M pH 4,2

- 0,5ml dung dịch enzym pha trong đệm acetat

Thêm 3ml thuốc thử DNS, trộn đều và đun sôi chính xác trong 15 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong bồn nước lạnh

Thêm 1ml nước cất , lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 575nm

Đồng thời thực hiện mẫu thử không bằng cách thay 0,5ml dung dịch enzym bằng 0,5ml dung dịch đệm acatat

 Dựng đường chuẩn

Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic chuẩn có nồng độ từ 0 đến 250mg/ml

Bảng 2.1 : Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic (mg/ml)

Trong đó:

X: lượng acid D-galacturonic được suy ra từ đường chuẩn(mg/ml)

m: khối lượng canh trường(g)

n: độ pha loãng

2.3.6 Định lượng pectin theo phương pháp Ca-pectat[13]

 Nguyên tắc

Dùng kiềm để xà phòng hóa hoàn toàn lượng pectin có trong mẫu vật, chuyển pectin sang dạng

đến trọng lượng không đổi, cân kết tủa khô rồi suy ra lượng pectin

giờ, lấy dung dịch chiết lần một, tương tự thực hiện lần 2, lần 3 sao cho tổng thể tích dung dịch chiết là 200ml

Lấy 20ml dung dịch này cho vào bình cầu rồi thêm 100ml dung dịch NaOH 0,1 N, để yên 7giờ (có

1giờ

Đem đun sôi 5 phút, lọc qua giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa kết tủa

khác nhau về trọng lượng giấy lọc và giấy lọc có kết tủa cho ta biết trọng lượng của Ca-pectat Vì hàm lượng của canxi trong Caxi-pectat là 8% nên khi tính hàm lượng pectin ta phải nhân trọng lượng Ca-pectat với 0,92

 Cách tính hàm lượng pectin trong nguyên liệu

Hàm lượng pectin trong nguyên liệu được tính theo công thức sau:

A 0 (%) = B 0 x 0,92 x 100

2

B0: Trọng lượng kết tủa Ca-pectat trên giấy (g)

2 : Lượng nguyên liệu có chứa pectin trong 20ml lấy để xà phòng hóa (g)

2.3.7 Phương pháp khảo sát cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp pectinase của chủng Bacillus được

nghiên cứu

2.3.7.1 Khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng pectin tối ưu

Tiền hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trong môi trường bán rắn không bổ sung cơ chất

cảm ứng và có bổ sung pectin với tỉ lệ khác nhau 1%, 2%, 3%, 4%

việc sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu

2.3.7.2 Khảo sát cơ chất cảm ứng tối ưu

Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trên môi trường bán rắn có bổ sung các nguồn cơ

chất cảm ứng khác nhau (vỏ bưởi, cà rốt) với nồng độ điều chỉnh theo kết quả thí nghiệm 2.3.6 và 2.3.7.1 với thời gian nuôi cấy khác nhau (24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144 h)

cấy thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu

2.3.8 Phương pháp khảo sát một số điều kiện môi trường nuôi cấy thu nhận pectinase có hoạt độ

cao nhất của Bacillus

của môi trường như nguồn nitơ, nguồn chất khoáng, yếu tố pH, nhiệt độ, độ ẩm, … cũng ảnh hưởng đáng

kể quá trình này Do thời gian có hạn, chúng tôi chỉ khảo sát thêm ảnh hưởng của các yếu tố: nguồn nitơ,

pH, nhiệt độ của môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu

2.3.8.1 Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho môi trường nuôi cấy Bacillus để thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất

Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trên môi trường bán rắn có bổ sung chất cảm ứng

và thời gian nuôi cấy thích hợp theo kết quả của thí nghiệm 2.3.7 Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các

Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết

như dịch enzym thô Vẽ đồ thị biến thiên của hoạt độ Xác định nguồn nitơ tối ưu cho chủng Bacillus

được chọn sinh tổng hợp pectinase

2.3.8.2 Phương pháp xác định pH thích hợp cho môi trường nuôi cấy Bacillus để thu nhận

pectinase có hoạt độ cao nhất:

Chuẩn bị canh trường nuôi cấy theo mục 2.3.7 và bổ sung nguồn nitơ thích hợp theo kết quả của thí

nghiệm 2.3.8.1 Sau đó điều chỉnh pH của môi trường bằng các dung dịch đệm:

- pH 3, 4: đệm acetat

- pH 5,6,7: đệm photphat

- pH 8, 9: đệm borat

Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như

dịch enzym thô Vẽ đồ thị biến thiên của hoạt độ Xác định pH tối ưu cho chủng Bacillus được chọn sinh

tổng hợp pectinase

2.3.8.3 Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy Bacillus thích hợp để thu nhận pectinase có hoạt

độ cao nhất:

theo kết quả của các thí nghiệm trên Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus chọn lọc ở các điều kiện nhiệt

Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô Vẽ đồ thị biến thiên của hoạt độ Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho chủng

Bacillus được chọn sinh tổng hợp pectinase

2.3.9 Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy thu nhận enzym pectinase của chủng Bacillus được chọn

theo quy hoạch thực nghiệm[14]

Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy các chủng Bacillus thu chế phẩm enzym

pectinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần Từ các kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng

riêng lẻ từng yếu tố, chúng tôi chọn 3 yếu tố là nguồn nitơ, nhiệt độ môi trường nuôi cấy và pH để nghiên

cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm

Bảng 2.2: Các mức yếu tố của môi trường

ba yếu tố (nhiệt độ, pH, cao nấm men(%)) ở mức trên, mức dưới Sáu thí nghiệm tiếp theo được thực hiện

ở cánh tay đòn  trên và dưới với các yếu tố còn lại được thực hiện ở tâm Một thí nghiệm còn lại được thực hiện ở tâm phương án của cả ba yếu tố Bố trí thí nghiệm được tóm tắt theo bảng 2.3

chương trình Data Analysis của Microsoft Office Excel

Kết quả sản lượng pectinase thực nghiệm, sản lượng pectinase suy ra từ mô hình tính toán, mô hình

và các giá trị tương quan giữa mô hình và thực nghiệm được trình bày trong chương III

2.3.10 Khảo sát một vài đặc điểm pectinase của chủng Bacillus được chọn

2.3.10.1 pH hoạt động tối ưu

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô

- Nồng độ cơ chất: 1%

- Thời gian phản ứng: 60 phút

- pH: 5,6,7,8,9,10,11

Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của chủng

Bacillus nghiên cứu

2.3.10.2 Nồng độ cơ chất tối ưu

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô

- Thời gian phản ứng: 60 phút

- pH : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.1

- Nồng độ cơ chất: 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%; 3,5%; 4%

Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của

chủng Bacillus nghiên cứu

2.3.10.3 Nhiệt độ hoạt động tối ưu

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên

Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô

- Thời gian phản ứng: 60 phút

- pH : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.1

- Nồng độ cơ chất : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.2

Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của

chủng Bacillus nghiên cứu

2.3.10.4 Thời gian hoạt động tối ưu

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô

- Thời gian phản ứng: 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút, 70 phút, 80 phút, 90 phút

- Nhiệt độ: theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.3

- pH : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.1