Ứng dụng của pectinase tổng hợp từ một số chủng Bacillus

Ứng dụng pectinase

Pectinase kiềm được ly trích chủ yếu từ vi khuẩn được dùng trong chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải, lên men trà, cà phê. Phương pháp tạo nước ép trong thường dùng để tạo nước ép táo, lê, nho, dâu,… Phương pháp tạo nước ép đục được dùng để sản xuất nước ép các loại citrus như cam, chanh, bưởi và nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm chuối,. Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào.

Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast( tế bào trần) cô lập từ tế bào soma(tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai. Erwinia carotovora cũng có khả năng tiết endopectat lyase, cũng có tác dụng xử lí nước thải giàu pectin( Tanabe, 1986), tuy nhiên do chúng có khả năng gây bệnh thực vật nên người ta chỉ xử lí gián tiếp bằng enzym phân giải pectin được sản xuất ra từ vi khuẩn này. Trong công nghiệp làm giấy hiện đại người ta thêm một số chất trợ giúp thẩm tích vào bột giấy để giữ những phần mịn và những chất độn trong các phiến giấy và làm tăng tốc độ thoát nước.

Trước đây, dầu từ hạt cây cải dầu (Canola), phôi dừa , hạt hoa hướng dương, hạt cọ, quả ôliu được sản xuất theo kiểu truyền thống bằng cách li trích dung môi hữu cơ. Trong quá trình lên men cà phê, người ta dùng các vi sinh vật phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhầy khỏi hạt cà phê( ba phần tư lớp vỏ nhầy này là pectin).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Cho enzym tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic được hiện màu với thuốc thử DNS (acid dinitrosalicylic) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm. Tiền hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trong môi trường bán rắn không bổ sung cơ chất cảm ứng và có bổ sung pectin với tỉ lệ khác nhau 1%, 2%, 3%, 4%.

Từ đó xác định loại cơ chất và thời gian nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu. Bên cạnh cơ chất cảm ứng có vai trò quan trọng đối với quá trình tổng hợp enzym thì các yếu tố khác của môi trường như nguồn nitơ, nguồn chất khoáng, yếu tố pH, nhiệt độ, độ ẩm, … cũng ảnh hưởng đáng kể quá trình này. Do thời gian có hạn, chúng tôi chỉ khảo sát thêm ảnh hưởng của các yếu tố: nguồn nitơ, pH, nhiệt độ của môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu.

Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho môi trường nuôi cấy Bacillus để thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất. Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trên môi trường bán rắn có bổ sung chất cảm ứng và thời gian nuôi cấy thích hợp theo kết quả của thí nghiệm 2.3.7. Chuẩn bị canh trường nuôi cấy theo mục 2.3.7 có bổ sung nguồn nitơ, và điều chỉnh pH môi trường theo kết quả của các thí nghiệm trên.

Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy thu nhận enzym pectinase của chủng Bacillus được chọn theo quy hoạch thực nghiệm[14]. Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy các chủng Bacillus thu chế phẩm enzym pectinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần. Từ các kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ từng yếu tố, chúng tôi chọn 3 yếu tố là nguồn nitơ, nhiệt độ môi trường nuôi cấy và pH để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm.

Ma trận quy hoạch thực nghiệm được thiết lập bằng tổ hợp 8 thí nghiệm khác nhau hoàn toàn của ba yếu tố (nhiệt độ, pH, cao nấm men(%)) ở mức trên, mức dưới. Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của chủng Bacillus nghiên cứu. Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của chủng Bacillus nghiên cứu.

Nồng độ cơ chất(%)

Thí nghiệm nhằm xác định thời gian phản ứng của enzym pectinase hai chủng Bacillus để tạo ra lượng D- galaturonic nhiều nhất. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Cả sáu chủng Bacillus tiến hành thí nghiệm chọn lọc đều có khả năng tổng hợp pectinase, nhưng mạnh nhất là hai chủng.

Khi bổ sung chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis thỡ hoạt độ enzym tăng rừ rệt. Với chất cảm ứng pectin, nồng độ 3% là thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis. Cà rốt là nguyên liệu cảm ứng thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase của vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis.

Ion Mg2+ và Ca2+ có tác dụng làm tăng hoạt tính, ngược lại, Mn2+ và Zn2+ có tác dụng ức chế enzym pectinase của cả 2 chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis. Hiệu suất thu nhận của enzym pectinase từ hai chủng vi khuẩn là: Bacillus licheniformis là 72,56%, Bacillus subtilis là 71,54%. Trong hai chủng vi khuẩn Bacillus được chọn lọc thí nghiệm thì Bacillus licheniformis có hoạt độ pectinase cao hơn Bacillus subtilis.

Tuy nhiên pectinase của Bacillus subtilis lại có khả năng chịu kiềm và chịu nhiệt tốt hơn pectinase của Bacillus licheniformis. Nghiên cứu thêm sự ảnh hưởng của các nguyên liệu cảm ứng khác nhất là các phế phụ liệu của nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm để sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn trên, nhằm tận dụng nguồn phế phụ liệu công nông nghiệp và nâng cao giá trị sử dụng của các phế phụ liệu này. [6] Lê Hồng Phú (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.

[7] Lê Thị Hồng Nga(2005), Nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. [13] Nguyễn Quang Tâm(2002), Nghiên cứu một số enzim pectinase hòa tan và enzim pectinase cố định thu nhận từ các chủng nấm mốc, Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hansen (2003), “influence of the carbon source on production of cellulase, hemicellulase and pectinase by Trichoderma reesei Rut C-30”, Enzym and Microbial Technology, 33, pp.