Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦU Các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) là những cây rừng phổ biến và đóng vai trò quan trọng về giá trị sinh thái và kinh tế. Có khoảng trên 45 loài cây họ Dầu với 6 chi được tìm thấy ở Việt Nam, phần lớn là cây bản địa và đặc hữu. Do giá trị thương mại và nhu cầu của người dân địa phương các loài cây họ Dầu bị khai thác quá mức. Hơn nữa, trong nhiều năm, dưới áp lực tăng trưởng kinh tế nhanh, hậu quả là sự suy giảm diện tích rừng và tăng mức độ phân cắt của các mảnh rừng còn lại, làm ảnh hưởng đến nơi sống của cây họ Dầu. Hiện tại, 33 loài cây họ Dầu đang bị đe doạ ở mức độ toàn cầu. Hai loài cây họ Dầu: Dầu nước (Dipterocarpus alatus) và Dầu mít (Dipterocarpus costatus) đang được khai thác sử dụng rộng rãi trong xây dựng và đồ dùng gia đình. Chúng cũng được sử dụng như là nguồn tinh dầu có giá trị. Chúng cũng được sử dụng vì mục đích thương mại. Các cây họ Dầu phân bố ở trong rừng mưa nhiệt đới núi thấp ở Việt Nam. Theo xếp hạng của IUCN tới năm 2004 hai loài cây họ Dầu này đã được đưa vào danh sách các loài đang bị đe doạ ở mức độ EN A1cd, B1+2c. Ở Việt Nam, do mức độ suy giảm nơi sống và khai thác quá mức, chúng đều ở mức độ nguy cấp. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử đã mở ra một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại học đó là “phân loại học phân tử”. Phương pháp này sử dụng các dữ liệu về câu trúc phân tử DNA, ARN, protein để xây dựng mối quan hệ tiến hoá giữa các loài sinh vật, giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài. Nó ứng dụng các kỹ thuật hiện đại của sinh học phân tử vào mục đích nghiên cứu phân loại. Mặc dù mới ra đời nhưng đã sớm trở thành một phương pháp nghiên cứu rất có hiệu quả. Tuy chưa thể trở thành phương pháp phân loại chính thống, xong phân loại học phân tử đang hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu phân loại. Nhằm phát triển kỹ thuật phân loại phân tử ở Việt Nam, luận văn này nghiên cứu đề tài: “Xác định vị trí của hai loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) và Dầu mít (D. costatus) trong họ Dầu Dipterocapaceae ở Việt Nam trên cơ sở giải mã vùng gen matK”. Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu khả năng phân loại bằng các trình tự DNA ngắn, mang thông tin tiến hoá trên 2 loài cây họ Dầu thuộc chi Dipterocarpus bao gồm D. Costatus và D. alatus, đồng thời bổ sung mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxa trong chi Dipterocarpus. Kết quả đồng thời góp phần cung cấp các dữ liệu DNA cho các loài, phục vụ cho việc lưu giữ và bảo tồn loài tại Việt Nam. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây họ Dầu trên thế giới 1.1.1 Thực vật học và hình thái Ashton (1982) phân chia họ Dầu (Dipterocaparceae) thành 3 phân họ (họ phụ ) như sau: • Dipterocarpoideae: có các loài gặp ở vùng nhiệt đới châu Á và Malesia, đặc trưng bởi bao phấn đính gốc, lá đài cùng phát triển thành cánh, quả có 2 hoặc thường 3 ngăn với 2 hạt trong mỗi ngăn. • Monotoideae: có các loài của nhiệt đới châu Phi và Madagasca ,có bao phấn lắc lư lá đài ít phát triển cùng và chỉ đôi khi thành cánh, quả có 2 và ít khi 4 ngăn với 1-2 noãn mỗi ngăn. • Pakaraimoideae: Đặc hữu của vùng cao Guayana, nhiệt đới Nam Mỹ, gần gũi với họ phụ Monotoideae nhưng có cánh hoa ngắn hơn lá đài và không có cuống hoa lưỡng tính, quả có 4-5 ngăn, mỗi ngăn có 2-4 noãn. Một số nhà nghiên cứu hiện nay chia họ Dầu thành 2 họ khác biệt, là họ Dầu (Dipterocarpaceae B1) với 13 chi và ước khoảng trên 600 loài, còn họ kia là: Monotaceae với 4 chi và khoảng 40 loài. Hiện nay họ Dầu được chia thành 3 phân họ: Monotoideae (Monotes và Marquesia); Pakaraimaeoideae (Pakaraimeae) và Pseudomonotoideae (Pseudomonotes). Các nhà khoa học đề thống nhất là các cây họ Dầu nhóm Pakaraimaea của Nam Mỹ là cổ xưa hơn các loài Monotoideae ở châu Phi và tiên tiến nhất vẫn là các cây họ Dầu ở châu Á. Maury-Lecon và Curtet (1998) cho rằng họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Phân họ Dipterocarpoideae) là thuần nhất ở châu Á trong khi họ Dầu có 3 phân họ là : Dipterocarpoideae ở châu Á; Pakaraimaeoideae ở Nam mỹ và Monotoideae ở châu Phi và Nam Mỹ. Ashton (1982) và Maury-Lecon và Curtet (1998) mô tả cây họ Dầu châu Á là cây có nhựa, có kích thước từ nhỏ tới lớn, thường có bạnh vè. Đặc điểm điển hình là lá đơn, mọc cách với các lá kèm phát triển để bảo vệ chồi và mọi phần của cây được một lớp lông che phủ. Hoa tự hình chùy có nhiều chùm. Trên hoa, cánh hoa dài hơn lá đài và có lông tơ ở các mức độ khác nhau, đài có 3 hoặc 5 lá đài lớn ra làm các cánh trên quả, tạo thành ống bao lấy quả hay một phần, hợp sinh hoặc tự do; khi tự do chúng thường xếp gối lên nhau. Bao phấn thường có hai túi phấn (ít khi 4). Buồng trứng có 3 (ít khi 2) ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn. Đặc trưng của cây họ Dầu châu Á về giải phẫu là sự có mặt của các ống nhựa trong gỗ và các tia gỗ xếp theo nhiều hang về mặt hóa học là sự có mặt của Dầu nhựa damaranic, các triterpen và sesquiterpen trong nhựa, trong khi đó lại thiếu vắng các monoterpen. Đặc điểm hình thái và giải phẫu ở đây có lien quan đến chức năng sinh học và các chức năng này lại gắn với các quần xã sinh vật và các đặc điểm khí hậu mà chúng ảnh hưởng đến thụ phấn của hoa, phát tán hat và thụ phấn của hạt. Ashton (1982) cho rằng nhiều taxon tam bội trong họ Dầu có thể có nguồn gốc lai dưới loài, đã nghiên cứu hình thái và phân bố cây lai họ Dầu ở Thái Lan trên cơ sở các mẫu vật thu thập cho thấy có 3 dạng lai tự nhiên giữa các loài là Dipterocarpus costatus x D.obtusifolius từ Doi Suthep, Chiang Mai; D.tuberculatus x D.intricatus từ Sakearat và D.gracilis x D.costatus từ Phangnga. 1.1.2 Phân loại Maury-Lecon and Curtet (1998) đã liệt kê chi tiết các thông tin lien quan đến phân loại của cây họ Dầu mà t heo họ có thể có 15, 16 hoặc 19 chi với 4710-480 loài ở châu Á và châu Phi với số liệu chưa chắc chắn. Họ cũng đã kết luận những thay đổi lien quan đến cây họ Dầu là: • Thiết lập các phân chi Shorea, Anthoshorea, Richetia và Rubroshorea • Thiết lập 11 nhóm trong Shorea bao gồm cả chi Doona và Pentacme trước đây • Lập lại chi Vateriosis • Phát hiện pakaraimaea ở Nam Mỹ • Phát hiện ra loài Pseudomonotes tropenposi trong phân họ Monotoideae gần gũi với Monotes và Marquesia châu Phi Ashton (1982) đã đưa ra tiêu chí cho việc xác định các nhóm phân loại trên loài đó là: 1, Có ít nhất một cặp tính trạng không có quan hê qua lại về chức năng 2, Các tính trạng này phải là chung cho mọi loài trong nhóm 3, Chúng cũng là những gián đoạn về biến dị giữa các taxon 4, Mục tiêu quan trọng nhất của phân loại là có được sự ổn định về tên gọi.
MỞ ĐẦU Các loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) rừng phổ biến đóng vai trị quan trọng giá trị sinh thái kinh tế Có khoảng 45 loài họ Dầu với chi tìm thấy Việt Nam, phần lớn địa đặc hữu Do giá trị thương mại nhu cầu người dân địa phương loài họ Dầu bị khai thác mức Hơn nữa, nhiều năm, áp lực tăng trưởng kinh tế nhanh, hậu suy giảm diện tích rừng tăng mức độ phân cắt mảnh rừng lại, làm ảnh hưởng đến nơi sống họ Dầu Hiện tại, 33 loài họ Dầu bị đe doạ mức độ toàn cầu Hai loài họ Dầu: Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Dầu mít (Dipterocarpus costatus) khai thác sử dụng rộng rãi xây dựng đồ dùng gia đình Chúng sử dụng nguồn tinh dầu có giá trị Chúng sử dụng mục đích thương mại Các họ Dầu phân bố rừng mưa nhiệt đới núi thấp Việt Nam Theo xếp hạng IUCN tới năm 2004 hai loài họ Dầu đưa vào danh sách loài bị đe doạ mức độ EN A1cd, B1+2c Ở Việt Nam, mức độ suy giảm nơi sống khai thác mức, chúng mức độ nguy cấp Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ sinh học phân tử mở phương pháp nghiên cứu cho phân loại học “phân loại học phân tử” Phương pháp sử dụng liệu câu trúc phân tử DNA, ARN, protein để xây dựng mối quan hệ tiến hoá lồi sinh vật, giải thích tính đa dạng sinh học mức độ phân tử loài phạm vi lồi Nó ứng dụng kỹ thuật đại sinh học phân tử vào mục đích nghiên cứu phân loại Mặc dù đời sớm trở thành phương pháp nghiên cứu có hiệu Tuy chưa thể trở thành phương pháp phân loại thống, xong phân loại học phân tử hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu phân loại Nhằm phát triển kỹ thuật phân loại phân tử Việt Nam, luận văn nghiên cứu đề tài: “Xác định vị trí hai lồi Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Dầu mít (D costatus) họ Dầu Dipterocapaceae Việt Nam sở giải mã vùng gen matK” Mục tiêu đề tài nghiên cứu khả phân loại trình tự DNA ngắn, mang thơng tin tiến hố lồi họ Dầu thuộc chi Dipterocarpus bao gồm D Costatus D alatus, đồng thời bổ sung mối quan hệ phát sinh chủng loại taxa chi Dipterocarpus Kết đồng thời góp phần cung cấp liệu DNA cho loài, phục vụ cho việc lưu giữ bảo tồn loài Việt Nam CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây họ Dầu giới 1.1.1 Thực vật học hình thái Ashton (1982) phân chia họ Dầu (Dipterocaparceae) thành phân họ (họ phụ ) sau: Dipterocarpoideae: có lồi gặp vùng nhiệt đới châu Á Malesia, đặc trưng bao phấn đính gốc, đài phát triển thành cánh, có thường ngăn với hạt ngăn Monotoideae: có lồi nhiệt đới châu Phi Madagasca ,có bao phấn lắc lư đài phát triển thành cánh, có ngăn với 1-2 nỗn ngăn Pakaraimoideae: Đặc hữu vùng cao Guayana, nhiệt đới Nam Mỹ, gần gũi với họ phụ Monotoideae có cánh hoa ngắn đài khơng có cuống hoa lưỡng tính, có 4-5 ngăn, ngăn có 2-4 nỗn Một số nhà nghiên cứu chia họ Dầu thành họ khác biệt, họ Dầu (Dipterocarpaceae B1) với 13 chi ước khoảng 600 lồi, cịn họ là: Monotaceae với chi khoảng 40 loài Hiện họ Dầu chia thành phân họ: Monotoideae (Monotes Marquesia); Pakaraimaeoideae (Pakaraimeae) Pseudomonotoideae (Pseudomonotes) Các nhà khoa học đề thống họ Dầu nhóm Pakaraimaea Nam Mỹ cổ xưa loài Monotoideae châu Phi tiên tiến họ Dầu châu Á Maury-Lecon Curtet (1998) cho họ Dầu (Dipterocarpaceae) (Phân họ Dipterocarpoideae) châu Á họ Dầu có phân họ : Dipterocarpoideae châu Á; Pakaraimaeoideae Nam mỹ Monotoideae châu Phi Nam Mỹ Ashton (1982) Maury-Lecon Curtet (1998) mô tả họ Dầu châu Á có nhựa, có kích thước từ nhỏ tới lớn, thường có bạnh vè Đặc điểm điển hình đơn, mọc cách với kèm phát triển để bảo vệ chồi phần lớp lơng che phủ Hoa tự hình chùy có nhiều chùm Trên hoa, cánh hoa dài đài có lơng tơ mức độ khác nhau, đài có đài lớn làm cánh quả, tạo thành ống bao lấy hay phần, hợp sinh tự do; tự chúng thường xếp gối lên Bao phấn thường có hai túi phấn (ít 4) Buồng trứng có (ít 2) ngăn, ngăn chứa noãn Đặc trưng họ Dầu châu Á giải phẫu có mặt ống nhựa gỗ tia gỗ xếp theo nhiều hang mặt hóa học có mặt Dầu nhựa damaranic, triterpen sesquiterpen nhựa, lại thiếu vắng monoterpen Đặc điểm hình thái giải phẫu có lien quan đến chức sinh học chức lại gắn với quần xã sinh vật đặc điểm khí hậu mà chúng ảnh hưởng đến thụ phấn hoa, phát tán hat thụ phấn hạt Ashton (1982) cho nhiều taxon tam bội họ Dầu có nguồn gốc lai lồi, nghiên cứu hình thái phân bố lai họ Dầu Thái Lan sở mẫu vật thu thập cho thấy có dạng lai tự nhiên loài Dipterocarpus costatus x D.obtusifolius từ Doi Suthep, Chiang Mai; D.tuberculatus x D.intricatus từ Sakearat D.gracilis x D.costatus từ Phangnga 1.1.2 Phân loại Maury-Lecon and Curtet (1998) liệt kê chi tiết thông tin lien quan đến phân loại họ Dầu mà t heo họ có 15, 16 19 chi với 4710-480 loài châu Á châu Phi với số liệu chưa chắn Họ kết luận thay đổi lien quan đến họ Dầu là: Thiết lập phân chi Shorea, Anthoshorea, Richetia Rubroshorea Thiết lập 11 nhóm Shorea bao gồm chi Doona Pentacme trước Lập lại chi Vateriosis Phát pakaraimaea Nam Mỹ Phát loài Pseudomonotes tropenposi phân họ Monotoideae gần gũi với Monotes Marquesia châu Phi Ashton (1982) đưa tiêu chí cho việc xác định nhóm phân loại lồi là: 1, Có cặp tính trạng khơng có quan qua lại chức 2, Các tính trạng phải chung cho lồi nhóm 3, Chúng gián đoạn biến dị taxon 4, Mục tiêu quan trọng phân loại có ổn định tên gọi Kết hợp với kết Maury-Lecon (1979), ho Dầu châu Á ghép thành hai nhóm lớn dựa vào xếp đài số nhiễm sắc thể, là: Nhóm Valvate-Dipterocarpi: Vateria, Vaterisis, Stemonoporus, Vatica, Cotylelobium, Upuna, Anisoptera, Dipterocarpus với số lượng cá thể nhiễm sắc n=11 Nhóm Imbricate-Shoreae: Shorea, Parashorea, Hopea, Balanocarpus với số lượng cá thể nhiễm sắc n=7 Số lượng loài Châu Á trung tâm loài họ Dầu có nhiều lồi Ba khu vực đáng quan tâm vùng đảo Borneo, Sumatra bán đảo Malaixia Bảng 1.1 Số loài họ Dầu châu Á, Châu Phi Nam Mỹ (Maury-Lecon and Curtet,1998) Vùng/nước Malesia *Malaya * Borneo * Sumatra * Philippin * Sulawesi *Moluccas * New Guinea Đông Nam Á * Myanmar * Thái Lan * Lào * Cam-pu-chia * Việt Nam Nam Á * Bắc Ấn Độ * Nam Ấn Độ * Andamans * Ấn Độ + Andam Sri Lanca Seychelles Trung Quốc Châu Phi + Madagaxca Số chi 10 14 13 11 3 8 6 5-6 Số Loài 465 155-168 267-276 106 50-52 15 76 33 66 20 28 36 58 10 14 31 44-45 24 Tác giả Ashton, 1982 Symington, 1943 Symington, 1943 Ashton, 1982 Ashton, 1982 Ashton, 1982 Ashton, 1982 Ashton, 1982 Smitinand et al 1990 Smitinand et al 1990 Smitinand et al 1990 Smitinand et al 1990 Smitinand et al 1990 Smitinand et al 1990 Kostermans, 1992 Jacobs, 1981 Jacobs, 1981 Jacobs, 1981 Tewary, 1984 Ashton, 1977 Parkinson, 1932 Huang, 1973 11 49 Xu and Yu, 1982 Shaw, 1973 * Châu Phi * Madagaxca Nam Mỹ 1 48 1 Shaw, 1973 Shaw, 1973 Maguire and Ashton 1980 1.1.3 Phân bố vấn đề bảo tồn gen họ Dầu 1.1.3.1 Phân bố Maury-Lecon Curtet (1998) chia khu phân bố họ Dầu châu Á thành vùng chính: 1, Malesia: Bán đảo Malaixia, Sumatra, Java, quần đảo Sunda, Borneo, Philippin, Celebes, Moluccas, New Guinea, Bismarck Archipelago 2, Lục địa Đông Nam Á: Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Lào, Việt Nam Nam Trung Quốc 3, Nam Á: Ấn Độ, quần đảo Andaman, Bănglađét, Nêpan 4, Sri Lanca 5, Seychelles Đồng thời, tác giả xem xét kỹ lưỡng hai giả thuyết nguồn gốc địa lý họ Dầu, là: 1, Giả thuyết Aubreville: đề xuất hai trung tâm kỷ Đệ tam họ Dầu (i) Indo-Malesia có nguồn gốc Laurasia (ii) Africa-India có nguồn gốc Gondwana 2, Giả thuyết Vozenin-Serra Salard-Cheboldaef: xác định liên kết lục địa trực tiếp Đông Nam Á Laurasia hang loạt khối nhỏ tách khỏi phần đông bắc Gondwana, di chuyển qua Tethys tạo thành quần đảo với liên kết tạo mảng Đông Nam Á khác Ashton (1982) cho phân bố họ Dầu có trung tâm Đơng Nam Á đặc biệt nhiều rừng mưa Malaixia, khơng tìm thấy loài họ Dầu chống chịu lửa dụng Malaixia chúng lại dễ nhận thấy lục địa Đông Nam Á rừng họ Dầu rụng theo mùa Theo Ashaton, họ Dầu tập trung vùng khí hậu nhiệt đới với lượng mưa bình quân lớn 1000 mm mùa mưa tháng, phần lớn laoif không phân bố độ cao 100m so với mục nước biển, New Guinea Borneo có đặc hữu cao, theo thứ tự 73% 15 loài New Guinea 59% 267 loài Borneo, bán đảo Malaixia 19% 156 loài Các loài phân bố rộng bao gồm loài chung cho vùng khí hậu thay đổi theo mùa, loài Shorea assamica, Dipterocarpus gracilis, D.kerrii Anisoptera Smitinand chia họ Dầu Thái Lan vào hai loại rừng thường xanh rụng lá, loài đại diện cho rừng rụng Dipterocarpus obtusifolius, D.tuberculattus, D.intricatus, Shorea obtuse S.siamensis chúng tìm thấy độ cao 1.300 m trừ D.intricatus Theo Thái Văn Trừng (1986) De Candolle phát châu Phi Madagaxca có chi Monotes với 36 lồi; sau Gilg phát them chi Marquasia với vài lồi, them mẫu hóa thạch Dipterocarpus Bắc Phi tạo cho họ Dầu có them phân họ Monotoideae mở rộng phân bố tới châu Phi Năm 1977, Naguiro Ashton lại tìm thấy phía Nam Guyana, châu Mỹ La Tinh chi độc loại khác Pakaraimaca đặt thành phân họ thứ ba Pakaraimoideae, song có nhà khoa học Kostermans khơng trí xếp nhóm vào họ Dầu Về độ cao so với mực nước biển, thong thường lồi họ Dầu có phân bố 1000 m, song có số lồi Shorea gặp độ cao 1700 m Sumatra loài Hopea beccariana Brunei (Borneo) cụng độ cao 1.1.3.2 Vấn đề bảo tồn gen họ Dầu Đối với chương trình bảo tồn nguồn gen, đa dạng di truyền lồi họ Dầu trì rừng trồng thông qua thu hái hạt giống Khi so sánh với loài kim, thấy có khac biệt cần quan tâm Cây kim thường tạo thành quần thụ lớn thụ phấn nhờ gió, nên thu hái hạt, thường thu hái hạt mẹ cho vùng đủ đảm bảo đa dạng di truyền thơng qua thụ phấn chéo nhờ gió với nguồn phấn hoa phong phú Ngược lại, họ Dầu cho thấy có tỷ lệ khơng thụ phấn chéo thụ phấn hai mẹ gần trùng thường quen thụi phấn cho khu vực trước mà chưa thể bay xa Do vậy, đa dạng di truyền nằm lượng hạt thu thập chưa đủ đại diện cho quần thể loài kim Để bảo tồn ex situ họ Dầu, nên thu hái hạt từ nhiều mẹ cách xa 1.1.4 Giá trị kinh tế Các loài họ Dầu nguồn cung cấp gỗ quan trọng vùng Đông Nam Á cho tiêu thụ nội địa xuất Gỗ lồi họ Dầu sử dụng vào cơng trình có cấu trúc chịu tải lớn dầm, xà nhà, khung cửa, cầu thang, sàn nhà, thùng xe… Sau xử lí thuốc bảo quản, chúng cịn dùng làm cột điện, tà vẹt đường sắt, cầu tàu… Nhiều sản phẩm đồ mộc xuất nước ta chế biến từ gỗ họ Dầu nhập nội Bên cạnh lồi họ Dầu cịn làm cảnh bong mát đường phố Nhiều sản phẩm gỗ khai thác từ loài họ Dầu nhựa – dầu chai (oleoresin), nhựa cứng (dammar hay hard resin), camphor, mỡ bơ tannin Phương pháp chích nhựa truyền thống áp dụng lâu đời chi Dipterocarpus cung cấp dầu nhựa vùng Dầu nhựa gồm chủ yếu tinh dầu (essential oil nhựa (réin) Khi trưng cất dầu nhựa nước, người ta nhận tinh dầu với hàm lượng đạt 30%-70% tùy theo yêu loài Thành phần hóa học chủ yếu tinh dầu hợp chất sesquiterpen có tác dụng diệt nấm, vi khuẩn, mối mọt Hợp chất nhựa chứa chủ yếu dipterocarpol từ 10%-40% thuộc nhóm triterpennoid, dùng để sản xuất sơn bong, vécni, sơn dầu Dầu nhựa sản phẩm quan trọng miền nam nhiều nước Đông Nam Á khác Đầu kỷ XX, miền Nam khai thác khoảng 1000 dầu nhựa hàng năm từ loài họ Dầu Do rừng họ Dầu bị tàn phá nên sản phẩm nhựa dầu giảm xuống nhanh chóng Năm 1984, Thái Lan khai thác khoảng 1.700.000 dầu nhựa, đến năm 1989 cịn 640.000 lít năm 1990 cịn 293.000 lít Nhựa (dầu chai) chiết xuất từ Dipterocarpus alatus quan trọng khu vực Nó dùng vào cơng nghiệp sản xuất sơn, vécni, sơn mài tinh dầu dùng làm chất định hương nước hoa Nhụa dùng làm chất chống thấm vỏ thuyền Nhựa từ Shorea Hopea cịn dùng làm đuốc Ngồi hoa Vatica diospyroides Shorea roxburghii có mùi thơm dùng để chế tạo nước hoa Tannin thường chiết xuất từ vỏ Hopea parviflora, Dipterocarpus tuberculatus khô Hopea Odorata 1.2 Các loại họ Dầu Việt Nam 1.2.1 Phân loại Theo tài liệu cơng bố, Việt Nam có 40 lồi họ Dầu thuộc chi, chưa kể loài chưa xác định lại cách chắn như: Dầu (D.gracilis), Dầu cà luân hay Dầu ke (D.kerii) mà theo nhà phân loại khơng tồn nước ta Dựa vào công bố trước công bố (FIPI, 1996; Phân viện điều tra quy hoạch II, 1994; Phạm Hoàng Hộ, 1999; Nguyễn Hồng Nghĩa, 2003; Trung tâm Tài Ngun & Mơi Trường, Đại học Quốc Gia Hà Nội Viện Sinh Thái & Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam 2003) danh sách lồi họ Dầu nước ta gồm chi sau: Chi Anisotera Chi Dipterocarpus : 12 loài Chi Hopea : 11 loài Chi Parashorea : loài Chi Shorea : loài Chi Vatica : loài : loài Đặc điểm họ Dầu Họ Dầu bao gồm lồi có đơn mọc cách, hoa lưỡng tính, ngủ phân đều, mang đài tồn chín rụng Quả hạt khó tách rời phương diện gây trộng (quả chứa ln hạt) Có nhóm với chi đặc trưng sau: Quả có cánh tồn tại: Lá đài hình ống : Dipterocarpus (Dầu), Anisoptera (Vên Vên) Lá đài rời :Hopea (Sao), Vatica (Táu) Quả có ba cánh: Shorea (Chai), Pentacme (Cẩm liên) Quả có năm cánh: Parashorea (Chò chỉ) 1.2.2 Phân bố họ Dầu Dựa vào tài lệu phân chia thảm thực vật rừng Việt Nam GS.TS Thái Văn Trừng, xét lượng mưa điều kiện khơ hạn, chia rừng họ Dầu thành vùng phân bố chủ yếu sau: * Vùng rừng khô họ Dầu (rừng khộp) Các lồi chịu khơ hạn lửa rừng lồi Cà (Shorea obtusa), Cẩm lien (Shorea siamensis), Sến mủ (Shorea roxburghii), Dầu trà beng (D.obtusifolius), Dầu đồng (D.tuberculatus), Dầu lơng (D.intricatus) Đây lồi có vỏ dày, lồi sau có vỏ nứt thành rãnh, rụng mùa khô, mọc chiếm ưu vùng đất hay vùng núi, keo dài từ Ấn Độ qua Myanma, Thái Lan, Lào tới Việt Nam Đây lồi rừng khộp điển hình thường gặp Tây Ngun Rừng Săng đá (Hopea ferrea), Sao mạng Cà Ná (Hopea reticulata) vùng khô Phan Rang dạng rừng đặc biệt.Bên cạnh hai loài họ Dầu thường xanh Săng đá Sao mạng, cịn có Cẩm lien rụng mùa khơ, lồi họ Đậu đặc trưng cho vùng khô * Vùng rừng thường xanh/nửa rụng mùa khơ Các lồi chủ yếu thường xanh rụng rụng phần Ven biển miền Trung tới Đơng Nam Bộ cịn có loài rừng họ Dầu mọc loại hỗn giao đất cát ven biển Cây họ Dầu ưu Dầu cát (D.caudatus aff condorencis) tái sinh tự nhiên tốt, bên cạnh Sến cát (Shorea roxburghii) mọc thành quần thụ dải rác cây, Dầu cịn có Dầu nước (D.alatus), Vên vên (A.costata), Cẩm liên (S.siamensis), Táu duyên hải (Vatica mangachapoi) Có thể gặp kiểu rừng khu bảo tồn Bình Châu – Phước Bửu (Bà Rịa – Vũng Tàu) khu bảo tồn sinh thái Takou (Bình Thuận) đám rừng cịn sót lại dọc bờ biển Ngồi cịn có rừng Chai cong (S.falcata) Sao hình tim (Hopea cordata) Cam Ranh (Khánh Hòa), đám rừng Chai cong cịn sót lại Phú n * Rừng kín ẩm thường xanh mưa mùa: Đây nơi mà hầu hết họ Dầu thường gặp Đông Nam Bộ Lượng mưa thường 2000 mm với mùa khơ dài ngắn tùy theo vùng Khơng có lồi rụng chịu lửa rừng Chúng có khuynh hướng mọc thành đám, thành cum loài Vên vên (A.costata), Dầu mít (D.costatus), Dầu song nang (D.dyeri) mọc thành đám vùng Đông Nam Bộ Sao đen (Hopea odorata) Dầu nước (D.alatus) mọc thành quần thụ lớn gọi “láng dầu”, “láng sao” nơi mực nước ngầm cao ven song, suối hay vùng đất trũng Vùng Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng có lượng mưa 2000 mm mùa khơ ngắn nên có điều kiện cho rừng thường xanh phát triển Nơi có Sao đen mọc thành cụm, Dầu dọt tím (D.grandiflorus), Chị đen (Parashorea stellata) Kền kền (Hopea pierrei) 1.3 Hiện trạng họ Dầu Việt Nam nước nhiệt đới, có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng, lồi rừng chiếm tỷ lệ đáng kể Với 20 triệu rừng đất rừng, khoảng 60% diện tích tồn quốc, nguồn tài nguôn vô quý Tuy nhiên,, năm gần nhiều nguyên nhân khác mà diện tích rừng ngày giảm, ước tính có khoảng 100.000 rừng bị năm Chính mà việc bảo tồn nguồn gen cho loài đặt cấp bách Trong loại rừng, họ Dầu số lồi có ý nghĩa lớn hệ sinh thái rừng chúng cung loài có tỷ lệ phá hủy nhiều.Các lồi họ Dầu (Dipterocarpaceae) tạo nên họ thực vật độc đáo tiếng vùng nhiệt đới Hiện nay, gỗ họ Dầu chimes thị phần lớn thị trường gỗ giới nên chúng đóng vai trị quan trọng nhiều nước, nước châu Á mà đặc biệt nước Đơng Nam Á Ngồi việc cung cấp gỗ, rừng họ Dầu đem lại nhiều sản phẩm có gia trị khác phục vụ đời sống người Rừng tự nhiên có họ Dầu phân bố bị suy giảm mạnh sau nhiều thập niên khai thác chuyển mục tiêu sử dụng đất cho trồng nông nghiệp Vào năm 1972 rừng họ Dầu Philippin chiếm 15 triệu ha, đến năm 1990 giảm xuống 4,148 triệu Nghiên cứu phục hồi rừng tự nhiên cố gắng trồng lại rừng lâu nhiều nước song nhỏ lẻ, chưa khâu nối phạm vi tồn cầu cịn gặp nhiều hạn chế Hiểu biết nhân loại họ Dầu không nhiều hầu hết chưa có nghiên cứu lồi họ Dầu nghiên cứu toàn diện ,sâu sắc Hiện nay, loài chủ yếu khu rừng tự nhiên bảo vệ, khu bảo tồn quy hoạch.Có lồi Chị nâu thấy cá thể đơn lẻ cịn xót lại n Bái, Phú Thọ, Thái Ngun, Bắc Cạn Trong có lồi khơng cịn tìm thấy rừng tự nhiên mà tìm thấy rừng tái sinh Dầu song nàng Theo sách đỏ Việt Nam (1996) thơng báo có điểm có lồi Sao hình tim Mỹ Ca, thuộc phạm vi quân tiếp cận Do tính chất chưa Dầu nên họ Dầu thường sức nảy mầm số lượng ngày Vì việc bảo tồn họ Dầu nước ta trở nên cấp thiết, nhằm mục đích cứu giữ lấy nguồn gen vơ phong phú quý giá 1.4 Chi Dipterocarpus 1.5 Đặc điểm sinh học giá trị bảo tồn hai loài thuộc chi Dipterocarpus 1.5.1 Loài Dầu nước (Dipterocarpus alatus) Tên khác: Dầu rái, Dầu rái trắng, Dầu rái Tên khoa học: Dipterocarpus alatus Roxb.ex G.Don Tên đồng nghĩa: D.genopterus Turcz D.incanus Roxb Ex Kurz D.philipinensis Foxw Chi : Dầu (Dipterocarpus) Đặc điểm sinh học - sinh thái Dầu nước gỗ lớn, chiều cao thơng thường 30-35 m, có đạt tới 40-45 m, đường kính ngang ngực đạt tới 250 cm Dầu rái thường chiếm tầng cao, ưu rừng Thân tròn đều, dáng thẳng đẹp Cây trước tuổi thành thục có tán hình chóp trưởng thành già, có tán hình lọng Vỏ mỏng có màu ám trắng nhẵn Lá đơn mọc cách, hình bầu dục trái xoan, dài 10-20 cm, rộng 5-15 cm; đầu nhọn; gốc hình nêm hay hình trịn Phiến có mầu xanh thẫm mặt màu xanh nhạt, có lớp lơng mịn phủ mặt Gân bên 11-18 đôi Lá kèm có lơng màu vàng xám nhạt Quả gần hình cầu, có cạnh rõ, đừng kính 1-1,5 cm Quả có cánh đài nhẵn; hai cánh to, cánh dài từ 10-14 cm, rộng 1,5-2 cm, xếp song song, có màu đỏ tươi non chuyển thành màu vàng chin già; cánh nhở có kích thước 1,2-1,4 cm Mỗi có hạt Mùa chin tháng 3-4 hàng năm, chin tập chung vào cuối tháng đầu tháng Dầu nước thường mọc thành đám gọi “láng dầu” dải rác ven sông suối, khu rừng tự nhiên nhiệt đới Cây thường mọc xen với loài họ Đậu Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa), Gụ mật (Sindora cochinchinensis), loài Cẩm lai (Dalbergia spp) loài rộng khác Cây xếp vào nhóm có tăng trưởng trung bình, 45 tuổi đạt đường kính ngang ngực 0.62 cm/năm chiều cao vut đạt 0.60 m/năm (Phân viện điều tra quy hoạch II, Bộ Lâm nghiệp 1994) Dầu nước có phân bố rộng khắp Đông Nam Á kéo suốt từ Inđônêxia, Malaixia, Philipin, Ấn Độ, Myanma, Thái Lan qua Lào Campuchia sang Việt Nam Hiện trạng Dầu nước gặp nhiều khu bảo tồn quy hoạch năm vừa qua,do chiến tranh tàn phá,khai thác mức, mà diện tích họ Dầu hỗn giao nói chung Dầu nước nói riêng suy giảm nghiêm trọng Theo Nguyễn Duy Chuyên Ngô An, Viện điều tra quy hoạch rừng (1995), thời điểm năm 1959,diện tích rừng có họ Dầu Đơng Nam Bộ chiếm 49% diện tích tồn vùng, đến năm 1968 giảm xuống 36%, năm 1982 18% 1992 cịn 8% Xét quy mơ quốc gia,tài nguyên di truyền loài bị suy kiệt mạnh 1.5.2 Lồi Dầu mít (Dipterocarpus costatus) 1.6 Một số phương pháp phân loại thực vật Hiện nay, phương pháp phân loại thực vật dựa nguyên tắc chung thực vật có chung nguồn gốc có tính chất giống nhau, thực vật gần tính chất giống nhiều Sự giống đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá , số phương pháp thường sử dụng như: 1.6.1 Phương pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc biệt hình thái quan sinh sản, quan biến đổi so với quan sinh dưỡng điều kiện môi trường thay đổi Những thực vật gần có nhiều đặc điểm chung hình thái Đây phương pháp cổ điển dùng phổ biến, hạn chế phương pháp ghi nhận số taxa, thực tế nhiều loài khác có hình thái giống ngược lại Phương pháp phân loại hình thái thực gặp khó khăn phân loại đơn vị taxon loài Phân loại học truyền thống sử dụng chủ yếu đặc điểm hình thái tính trạng hình thái thường biến đổi phức tạp, nên việc xác định tương đồng khó Hiện tượng tiến hoá hội tụ, tiến hoá song song tiến hoá ngược dẫn đến đặc điểm tương tự lồi có họ hàng xa nhau, nghĩa đặc điểm giống tiến hoá độc lập từ nguồn gốc khác để thích nghi với điều kiện môi trường giống phổ biến sinh giới Việc phân biệt đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự hệ thống học truyền thống không dễ dàng, bậc phân loại thấp Ngoài ra, việc so sánh trực tiếp bậc phân loại cao khó, nhiều đặc điểm khơng cịn khả xác định tương đồng Vì hệ thống học truyền thống phải sử dụng đặc điểm, khoá định loại riêng cho nhóm sinh vật định Ưu điểm lớn hệ thống học truyền thống có lịch sử phát triển lâu dài xây dựng hệ thống phân loại sinh vật tương đối đầy đủ, tiện lợi nghiên cứu ứng dụng Nhưng hệ thống học truyền thống có nhược điểm thiếu tính thống nhất, phải sử dụng nhiều tiêu chuần nhiều khoá phân loại khác nhau, nên bị hạn chế nghiên cứu biến đổi tiến hoá nhỏ, khó xác định xác mối quan hệ nhóm sinh vật bậc phân loại thấp lồi loài 1.6.2 Phương pháp giải phẫu so sánh Đến kỷ IXX, nhờ phát triển kính hiển vi mà giải phẫu học thực vật có điều kiện phát triển Ngồi đặc điểm hình thái bên ngồi, nhà phân loại học cịn sử dụng đặc điểm hình thái giải phẫu hay vi hình thái (micromorphologie), tức hình thái cấu trúc bên thể, mô, tế bào, kể cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại Việc sử dụng phương pháp nhận kết nghiên cứu xác khách quan cho phân loại thực vật Các đặc điểm giải phẫu so sánh cho phép xác lập mối quan hệ gần gũi nhóm lớn, mà bậc taxon nhỏ, xây dựng tiêu chuẩn phân loại cho chi, loài thuộc họ Labiaceae Phương pháp giải phẫu so sánh khơng địi hỏi kỹ thuật q phức tạp cho kết xác Đối với loài gỗ thường sử dụng đặc điểm giải phẫu thân gỗ để định loại, ngược lại loài thân thảo thường sử dụng đặc điểm cấu trúc biểu bì Phương pháp sử dụng để định loại gỗ gỗ thành phẩm dùng để xuất 1.6.3 Phương pháp hóa học Có nhiều phương pháp phân tích hố học khác sử dụng nghiên cứu kiểm định mẫu chứa nhóm chất có hoạt tính sinh học, chứa tinh dầu (Trầm hương, Xá xị, Pơ mu ) dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cao áp, điện di mao quản, sắc kí khí - khối phổ… đặc điểm chung phương pháp hóa học cho kết nhanh, xác cho thơng số cấu trúc hoá học Ưu điểm phương pháp yêu cầu tính ngun vẹn mẫu vật khơng cao Trên giới, phương pháp sử dụng nhiều Ở nước ta, phương pháp bắt đầu nghiên cứu vài sở 1.6.4 Phương pháp phân loại học phân tử Phân loại học phân tử phương pháp phân loại sử dụng khác biệt cấu trúc phân tử để đạt thơng tin mối quan hệ tiến hố lồi Kết phân tích hệ thống phân tử thể phát sinh loài Phương pháp phân loại phân tử đời vào năm 1960 với nghiên cứu Emile công (1999), Zuckerkandl , Emanuel Margoliash , Linus Pauling Walter M Fitch Những nghiên cứu hệ thống học phân tử thực tác giả Charles G Sibley (nghiên cứu chim), Herbert cộng (nghiên cứu lưỡng cư) Morris Goodman (nghiên cứu linh trưởng) phát triển tiếp nhà nghiên cứu Allan C Wilson, Robert K Selander, John C Avise thu thành công lớn, làm sáng tỏ nhiều vấn đề phân loại tiến hoá Phân loại học phân tử sử dụng ban đầu phân tử protein, với kỹ thuật điện di protein Mặc dù thực cách không đem lại nhiều hiệu xong thúc đẩy phát triển phân loại học phân tử Giai đoạn từ 1974 – 1986, phân loại học phân tử chuyển sang sử dụng đặc điểm vật chất di truyền (DNA) với kỹ thuật ứng dụng lai DNA – DNA, tiếp đến kỹ thuật phân tích enzyme giới hạn cuối kỹ thuật đọc trình tự DNA Nguyên lý phân loại học phân tử: Phân loại học phân tử dựa nguyên lý sinh vật sống mang phân tử DNA, ARN protein, sinh vật có họ hàng gần gũi có mức độ tương đồng cao cấu trúc phân tử chất này, ngược lại sinh vật có họ hàng xa cho thấy đặc điểm cấu trúc khác Hiện nay, phân tử có tính bảo thủ DNA ty thể, DNA lục lạp sử dụng nhiều cho phân loại coi tích luỹ đột biến theo thời gian Thêm vào coi tốc độ đột biến không đổi, tạo đồng hồ phân tử cho biết thời gian diễn đột biến, nói cách khác ước lượng thời gian hình thành lồi Mặc dù phân loại học phân tử phương pháp phân loại sử dụng đặc điểm cấu trúc phân tử để xây dựng hệ thống phát sinh chủng loại, nhiên thập kỷ gần đây, người có khả tách chiết xác định cấu trúc phân tử chất Sự đời kỹ thuật giải trình tự DNA Maxam – Gilbert (1977, 1980) Singer (1977) mở ứng dụng to lớn cho phân loại học phân tử Hiện phân tích hay sử dụng phân loại học phân tử so sánh trình tự DNA, sử dụng kỹ thuật xếp phân tử (alignment) để xác định mức độ giống Các biến đổi phân tử đơn giản nhiều so với biến đổi hình thái, vật chất di truyền DNA cấu thành từ loại nucleotide (adenine, guanine, thymine cytosine) Mặc khác, biến đổi phân tử bị ảnh hưởng điều kiện môi trường Ưu lớn hệ thống học phân tử phân biệt rõ ràng đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự (Avise, 1994) Ngoài ra, nhiều phần vật chất di truyền có nguồn gốc kiểu biến đổi chung cho sinh vật, nên so sánh trực tiếp nhóm sinh vật với Các biến đổi tiến hoá nhỏ (microevolution), hay đa dạng di truyền quần thể sinh vật thể qua biến đổi phân tử rõ so với biến đổi hình thái Tính thống cao ưu điểm hệ thống học phân tử, sử dụng tiêu chuẩn phân tử chung cho sinh giới, có lợi nghiên cứu biến đổi tiến hoá nhỏ, nên số liệu phân tử có giá trị cao phân tích quan hệ phát sinh chủng loại taxon bậc phân loại thấp, đa dạng di truyền quần thể Nhược điểm hệ thống học phân tử không tiện dụng nghiên cứu ứng dụng tự nhiên chưa hình thành hệ thống phân loại riêng Sự kết hợp hai hệ thống phân loại phân tử phân loại truyền thống đem lại kết tốt Thực tế chứng minh hầu hết hệ thống học truyền thống giải tốt, không mâu thuẫn với kết nghiên cứu hệ thống học phân tử (Avise, 1994) Phân tích phân tử thường sử dụng để giải số vấn đề mà hệ thống học truyền thống cịn gặp khó khăn, thị phân tử có lợi Hiện tại, hệ thống học phân tử phương pháp hữu hiệu hỗ trợ cho phương pháp phân loại truyền thống cho kết tin cậy 1.7 Hệ gen sử dụng nghiên cứu phân loại phân tử thực vật 1.7.1 Cấu trúc hệ gen lục lạp Lục lạp bào quan nằm tế bào chất thực vật tảo (algae), chúng có chứa DNA riêng DNA lục lạp có từ 10 – 104 tế bào Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyll) nơi thực trình quang hợp Genome lục lạp thường sử dụng cho phân loại thực vật đặc tính di truyền theo dịng me, khơng bị tái tổ hợp di truyền cho hệ sau tốc độ đột biến cao Hệ gen lục lạp nhà phân loại học phân tử đánh giá chúng tích luỹ đột biến theo thời gian, phản ánh mức độ tiến hố lồi Hình : Hệ gen lục lạp Arabidopsis Thaliana (Theo Sato et al., 1999) Genome lục lạp (cpDNA) thực chất phân tử DNA vòng, sợi đơn, gen thường không lặp lại Không giống gen nhân, gen lục lạp mã hoá cho protein cần thiết cho chức quang hợp máy biểu protein Vùng DNA khơng mã hố hệ gen lục lạp Genome lục lạp (cpDNA) có kích thước từ 120 kb – 220 kb (hình 1.1), kích thước thay đổi có tồn vùng lặp lại ngược chiều (Inverted repeat), tách genome lục lạp thành hai vùng (vùng lớn LSC vùng nhỏ SSC) Mặc dù phần lớn DNA lục lạp mang số lượng gen nhau, nhiên số gen di trú vào DNA nhân biến khỏi hệ gen lục lạp Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp từ – lần so với gen nhân, nhanh khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật thường xuyên sử dụng nghiên cứu phân loại Hiện nay, gen lục lạp thường sử dụng nghiên cứu hệ thống học phân tử thực vật bao gồm: gen matK, gen trnL, vùng đệm psbA - trnH, tất gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi khơng lớn 2% loài lân cận Vùng đệm psbA - trnH: thường sử dụng cho nghiên cứu phân loại (Shaw et al, 2005) Vùng có kích thức xấp xỉ 450bp, xác suất nhân thành công cao (100% với loài nghiên cứu) Mức độ khác biệt trình tự nucleotide lồi 1,24% khác biệt bên loài thấp từ 0.00 – 0.08% (Kress et al, 2005) Trình tự psbA - trnH công bố ngân hàng gen với nhiều loài khác thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu rêu tản (liverwort) Gen matK: với vùng đệm psbA - trnH đề xuất làm DNA barcoding cho nhóm thực vật có hoa Kết sử dụng gen matK cho phân loại thu tương đồng cao với phân loại hình thái cho giá trị bootstrap từ 92 – 100% (Mort et al., 2001) Gen trnL: Là gen mã hoá cho tRNA vận chuyển Leucine lục lạp, có kích thước từ 452bp đến 528bp với loài thuộc họ đâu Gen sử dụng nhiều nghiên cứu phân loại phân tử Các kết thu nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy vùng DNA hữu ích cho phân loại Ngoài locus nêu trên, vùng DNA: gen rbcL, vùng đệm trnL – trnF, trnT – trnL thuộc hệ gen lục lạp thường sử dụng cho phân tích Việc sử dụng đoạn gen cho ưu nhược điểm khác nhau, kết phân loại xác phân tích tổ hợp nhiều gen 1.7.2 Vùng ITS nhân Vùng gen ITS: vùng ITS (internal transcribed spacer) gen mã hoá cho ribosome nhân gồm đơn vị gen 18S, 5,8S 26S (hình 1.2) Giữa đơn vị gen có đoạn ITS-1 ITS-2, thành phần tạo thành nhóm gen Các nhóm gen lặp lại liên tục hàng nghìn hệ gen nhân chúng ngăn cách vùng NTS (nontranscribed spacer) Hình: Sơ đồ vùng gen ITS Trong nghiên cứu phân loại thực vật mức độ loài, vùng ITS locus giải mã phổ biến (Alvarez et al, 2003) Vùng ITS cho thấy có hiệu cao nghiên cứu phân loại nhiều đối tượng thực vật nấm (ngoại trừ dương xỉ), locus kiến nghị làm vùng DNA barcode cho thực vật (kỹ thuật nhận biết lồi sử dụng trình tự DNA ngắn) (Stoeckle et al, 2003) Ở mức độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% loài gần gũi) chứng minh hầu hết nghiên cứu Thuận lợi vùng ITS nhân theo hai đoạn nhỏ (ITS1 ITS2) nằm hai bên với locus 5,8S, điều có ý nghĩa nhân mẫu bị hư hại Vùng ITS chứng minh có mức độ biến đổi thấp bên loài (Baldwin et al, 1995) Ngày với diện 60.000 trình tự ITS (tính đến 8/2010) cơng bố ngân hàng Genbank, nguồn tư liệu có giá trị, mở triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại giám định, số lượng trình tự tiếp tục bổ sung hàng ngày 1.8 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng nghiên cứu phân loại 1.8.1 Kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Karry Mullis cộng mơ tả lần năm 1985 góp phần tạo nên cách mạng sinh học phân tử Đây phương pháp invitro để nhân nhanh đoạn ADN mà cần lượng mẫu ban đầu hạn chế (cỡ 10 -3µg) Kỹ thuật có độ nhạy cảm cao ứng dụng nhiều lĩnh vực sinh học phân tử, chẩn đoán bệnh, di truyền quần thể phân tích pháp y Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, chu kỳ gồm giai đoạn: + Giai đoạn biến tính: ADN biến tính nhiêt độ khoảng 92 0C-950C khoảng thời gian từ 1-5 phút Khi liên kết hydro bị đứt sợi ADN kép tách thành sợi đơn + Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 30 0C - 650C khoảng 30 giây đến phút, cặp mồi bắt cặp với sợi ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung đầu đoạn ADN cần nhân Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào loại mồi cụ thể, tính tốn dựa vào nhiệt độ nóng chảy Tm (Melting Temperature) đoạn mồi Cơng thức tính nhiệt độ nóng chảy đoạn mồi: Tm = [4(G + C) + 2(A +T)]0C Trong đó: (G+C) số nucleotit Guanine Cytosine trình tự mồi (A+T) số nucleotit Adenine Thymine trình tự mồi + Giai đoạn tổng hợp ADN: Ở nhiệt độ 72 0C khoảng thời gian từ 30 giây đến vài phút, tùy thuộc đoạn ADN cần nhân Khi enzyme Taq polymerase hoạt động q trình tổng hợp diễn đoạn vị trí cặp mồi theo chiều từ 5’-3’ Trong nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotit đoạn ADN nhân, sử dụng PCR để tách dịng đặc hiệu, giúp phát đột biến, cho phép phân tích gen từ tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu q trình tiến hóa mức độ phân tử Thậm chí giúp phục hồi gen tồn cách hàng chục triệu năm 1.8.2 Kỹ thuật gel tinh sản phẩm PCR Tinh sản phẩm PCR kít tinh QIAEX II hãng QIAGEN Quy trình thiết kế để tách chiết đoạn ADN có chiều dài từ 40bp đến 50kb từ Gel agarose 1.8.3 Đọc trình tự nucleotide Phương pháp giải trình tự dùng phổ biến phương pháp Dideoxy hay gọi phương pháp gián đoạn chuỗi (chain-determination method) phương pháp xác định trình tự ADN Frederick Sanger phát triển vào năm 1975 Nguyên tắc phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động enzyme ADN polymerase trình tổng hợp ADN Enzyme ADN polymerase xúc tác gắn nucleotit vào mạch đơn DNA tổng hợp vị trí 3' có chứa nhóm -OH tự do, gặp nucleotit khơng có nhóm 3'-OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng phương pháp sử dụng loại dideoxynucleotit để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN cách ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng đoạn ADN mồi đoạn ADN mạch đơn có kích thước 20 nucleotit Phương pháp chia làm phản ứng thực riêng rẽ có ADN khn, ADN mồi, đầy đủ loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho phản ứng khác Các dideoxynucleotit bị nguyên tử oxy carbon thứ carbon thứ Do mạch ADN tổng hợp bị gắn ddNTP khơng có nhóm 3'-OH nucleotit cuối nên mạch tổng hợp không kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp dừng lại Chính lượng ddNTP đưa vào với lượng nhỏ so với lượng dNTP nên có ddNTP sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp ADN dừng lại Kết tổng hợp đoạn nucleotit có kích thước dài ngắn khác Để xác định trình tự, người ta điện di kết thu gel polyacrylamit Các đoạn oligonucleotit có kích thước khác di chuyển với tốc độ khác gel Lúc thực phản ứng hình phóng xạ quan sát đoạn mạch đơn ADN vạch gel Tổng hợp kết thu trình tự xếp nucleotit đoạn gen Giải trình tự máy phần lớn tuân thủ theo bước sau: 1) Chạy PCR để khuếch đại gen đoạn ADN mong muốn từ hệ gen sinh vật 2) Làm sản phẩm PCR thu được, thường dùng kít 3) Chạy phản ứng Sequencing theo kit hỗ trợ hãng bán máy 4) Làm sau phản ứng Sequencing cồn theo phương pháp truyền thống kít hãng 5) Chạy giải trình tự máy giải trình tự tự động 1.9 Một số thành tựu nghiên cứu phân loại học phân tử Ngoài nước: năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng rộng rãi, có hiệu nghiên cứu tiến hoá, phân loại đa dạng di truyền quần thể sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa kỹ thuật phân tích DNA Các thị AFLP (đa hình đoạn nhân chọn lọc), RFLP (đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn), RAPD (đa hình đoạn nhân ngẫu nhiên), SSR (DNA vệ tinh hay trình tự lặp lại đơn giản), cpSSR (trình tự lặp lại đơn giản genome lục lạp), gen mã hoá 18S rRNA,… hay sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng đoạn DNA trình tự đặc trưng cho lồi Với số lượng lớn hệ gen điều kiện thuận lợi cho kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) với cặp mồi (primers) thích hợp Vì vài thập kỷ, sở liệu gen (Genbank, 2007) lưu giữ 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotit Đây nguồn liệu có giá trị sinh học bảo tồn (Conservation biology) bốn lý (1) số liệu trình tự nucleotit có giá trị việc xác định đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá xếp phân loại, bậc loài lồi; (2) số liệu trình tự nucleotit đảm bảo độ xác cao nên tạo sở khoa học tốt cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), bộc lộ rõ biến đổi di truyền quần thể, cá thể, cha mẹ ; (3) kết phân tích DNA cho phép xác định xác lồi, quần thể tận cá thể từ mẫu vật khơng cịn ngun vẹn mà xác định thấy tượng tạp lai loài, quần thể địa lý…; (4) kết nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào yếu tố khách quan mơi trường hay người gây Vì giá trị khoa học nêu trên, đến kỹ thuật sinh học phân tử công cụ hỗ trợ đắc lực cho nhà nghiên cứu việc phát loài mới, giải nghi ngờ vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại mức độ tiến hố nhiếu lồi động thực vật vi sinh vật (Avise, 1994) Các kết nghiên cứu mức độ DNA góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn khai thác cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật giới Việt Nam (Phillip, 1997) Do có giá trị sử dụng thương mại lớn, nên nghiên cứu đa dạng di truyền số loài gỗ quý chi Dalbergia sử dụng thị RAPD, cpSSR, AFLP nhiều quốc gia quan tâm nghiên cứu Chẳng hạn, Olivarimbola cộng (2004) dựng mối quan hệ di truyền 122 cá thể loài Dalbergia monticola Madagascar việc phân tích với 60 thị RAPD 03 thị cpSSR, kết nhận cho thấy quần thể vùng trung tâm phía Bắc có nguồn gốc từ vùng Holocene phía Nam Tương tự, nhóm tác giả Pháp, Ấn Độ, Brasil sử dụng thị RAPD, SSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền loài, quần thể xác định trình tự đoạn gen đặc trưng cho số loài thân gỗ thuộc chi Dalbergia (Rout et al., 2003; Benedic et al., 2006; Subhash et al., 2004; Juchum et al., 2007) Vì thế, riêng chi Dalberrgia ngân hàng Genbank lưu hàng trăm trình tự nucleotit đặc trưng cho số loài số quốc gia (trang Web NCBI) Đây nguồn liệu có giá trị để chúng tơi khai thác ứng dụng cho nghiên cứu chi Việt Nam Trong nước: nhìn chung, nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn đa dạng sinh học tái tạo nguồn gen giới quan tâm phát triển Theo hướng này, nhà nghiên cứu nước bước tiếp cận Tuy nhiên, nghiên cứu xây dựng sở liệu DNA có tính hệ thống cao thực Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật cho số loài động vật q Cịn thực vật chưa có, thực tế, tồn phân bố nhiều loài dạng biệt lập, nên chứa đựng tính đa dạng nguồn gen lớn mà chưa nghiên cứu Vài năm trở lại đây, nghiên cứu đa dạng DNA thực vật tiến hành nghiên cứu Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Trường Đại học Lâm nghiệp Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, tập trung vào vài đối tượng trồng (cây lạc, lúa, số loài hoa lan, số loài thuộc chi họ Dầu, Vạn tuế, Bách xanh Giổi) Mặc dù nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền quần thể có giá trị cho nghiên cứu bảo tồn, tiến hoá tái tạo nguồn gen Gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại nhận dạng mẫu sinh vật Việt Nam đạt nhiều kết có giá trị Đối với số lồi động thực vật nhóm nghiên cứu Nơng Văn Hải dùng gen ty thể (18S rRNA) để nghiên cứu phả hệ giám định DNA số loài lan Hài, Bình vơi, chim (gà Lơi), cá (cá Vược) phát mức độ tiến hóa chúng Hay nhóm tác giả Đặng Tất Thế (2003-2006) sử dụng nhóm gen để phân tích tiến hóa phân tử phát sinh chủng loại số lồi thú, bị sát q Việt Nam Nguyễn Thuý Hạnh (2006), Lê Thị Muội cs (2005) dùng thị ISSR cpSSR để nghiên cứu đa dạng di truyền số loài chi họ Dầu Lạc Việt Nam Hay nhóm tác giả Nguyễn Minh Tâm dùng thị SSR để đánh giá đa dạng nguồn gen Vạn tuế Việt Nam làm sở cho công tác bảo tồn đa dạng di truyền Tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần vào việc phân loại mẫu thực vật cịn Đặc biệt nhóm rừng nói chung lồi gỗ quý có nguy truyệt chủng nói riêng nên cần tập trung nghiên cứu có hệ thống CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... Monotoideae (Monotes Marquesia); Pakaraimaeoideae (Pakaraimeae) Pseudomonotoideae (Pseudomonotes) Các nhà khoa học đề thống họ Dầu nhóm Pakaraimaea Nam Mỹ cổ xưa loài Monotoideae châu Phi tiên tiến họ Dầu... châu Mỹ La Tinh chi độc loại khác Pakaraimaca đặt thành phân họ thứ ba Pakaraimoideae, song có nhà khoa học Kostermans khơng trí xếp nhóm vào họ Dầu Về độ cao so với mực nước biển, thong thường loài... tâm Tài Nguyên & Môi Trường, Đại học Quốc Gia Hà Nội Viện Sinh Thái & Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam 2003) danh sách loài họ Dầu nước ta gồm chi sau: Chi Anisotera