Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và một số đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản tt

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Các bất thường sinh sản gây nhiều hậu nặng nề cho sức khỏe, tâm lý người mẹ, cho gia đình cho xã hội Do việc tìm ngun nhân, cách phịng tránh khắc phục bất thường sinh sản nói ln vấn đề quan tâm, nghiên cứu Cơ chế gây bất thường sinh sản phụ thuộc vào nguyên nhân như: nguyên nhân từ phôi thai thường rối loạn vật chất di truyền, nguyên nhân từ mẹ thường có chế như: rối loạn nội tiết, chế miễn dịch hay chế huyết khối làm tắc mạch máu nuôi dưỡng thai Các yếu tố liên quan đến chế huyết khối biết đến tăng nồng độ homocysteine (Hcy) huyết hay số yếu tố di truyền đa hình gen MTHFR Gen Methylene Tetra Hydro Folate Reductase (MTHFR) gen nằm vùng 36.3 nhánh ngắn nhiễm sắc thể số Đa hình gen MTHFR thường xảy hai vị trí 677 1298 Gen MTHFR sản xuất enzym MTHFR làm chuyển đổi Hcy thành methionine Enzym có tác dụng xúc tác chuyển 5,10-methylene THF thành 5-methyl THF 5-methyl THF hoạt động chất trung gian để chuyển Hcy thành methionine Vì vậy, gen MTHFR bị biến đổi, Hcy khơng chuyển hóa dẫn đến nồng độ tăng cao máu gây tình trạng xơ vữa, hẹp lòng động mạch, gây tắc mạch, huyết khối, tăng hình thành cục máu đơng Việc tăng nguy hình thành huyết khối xảy vi mạch tiếp nối thai thành tử cung gây bất thường thai sản sẩy thai, thai chết lưu Bên cạnh đó, nồng độ Hcy tăng cao hạn chế vai trị folat Folat loại vitamine cần thiết để hình thành nên tế bào giúp cho phân chia tế bào, thiếu folat thường liên quan với bất thường bất thường cấu trúc thể q trình phát triển phơi thai Với lý lợi ích xét nghiệm gen MTHFR, folat homocystein, đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan nồng độ folat, homocystein huyết số đa hình gen MTHFR phụ nữ có bất thường sinh sản”được thực Mục tiêu đề tài Xác định nồng độ homocystein, folat huyết đa hình gen MTHFR phụ nữ có tiền sử thai chết lưu tái diễn Đánh giá mối liên quan nồng độ homocystein, folat huyết tính đa hình gen MTHFR dự báo nguy thai chết lưu 2 Địa điểm thực đề tài Đề tài thực Trung tâm sàng lọc Chẩn đốn trước sinhBộ mơn Y sinh học –Di truyền, Bộ mơn Hóa sinh, trường Đại Học Y Hà Nội; Bệnh viện đa khoa MEDLATEC Ý nghĩa thực tiễn đóng góp đề tài - Đây cơng trình nghiên cứu Việt Nam nồng độ Hcy, folat huyết đa hình gen MTHFR phụ nữ có bất thường sinh sản - Đề tài nêu ý nghĩa, mối liên quan nồng độ Hcy, folat huyết với đa hình gen MTHFR đối tượng phụ nữ có bất thường sinh sản, tập trung vào đối tượng có tiền sử thai chết lưu Đã xác định ngưỡng cắt cho nồng độ Hcy dự đốn nguy có khả dẫn đến thai chết lưu phụ nữ tuổi sinh sản Vì đề tài đáp ứng tính khoa học, tính mới, tính thực tiễn cần thiết việc dự đoán nguy thai chết lưu, từ có hướng xử trí sớm, giúp bà mẹ có hội sinh khỏe mạnh Cấu trúc luận án Luận án trình bày 128 trang (không kể tài liệu tham khảo phụ lục), bao gồm phần: đặt vấn đề (2 trang); tổng quan tài liệu (37 trang); đối tượng phương pháp nghiên cứu (17 trang); kết nghiên cứu (31 trang); bàn luận (37 trang); kết luận (2 trang); Khuyến nghị (1 trang); hướng nghiên cứu (1 trang) Luận án gồm 28 bảng, 13 biểu đồ, sơ đồ, 24 hình Trong 181 tài liệu tham khảo có 11 tài liệu tiếng Việt, 170 tài liệu tiếng Anh Phụ lục gồm bệnh án nghiên cứu, quy trình phân tích nồng độ Hcy, folat huyết thanh, quy trình phân tích gen MTHFR danh sách bệnh nhân Chương I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bất thường sinh sản Bất thường sinh sản bao gồm vô sinh bất thường thai sản Bất thường thai sản thường biểu dạng bệnh lý sẩy thai sớm sẩy thai muộn, thai chết lưu, thai trứng, chửa tử cung, thai chậm phát triển tử cung, đẻ non, sơ sinh nhẹ cân, thai già tháng, dị tật bẩm sinh, chết sơ sinh, …Trong khuôn khổ luận án chúng tơi đề cập đến tình trạng thai chết lưu 1.1.2 Thai chết lưu Theo TCYTTG, thai chết lưu thai chết trước trục xuất hoàn toàn khỏi người mẹ không phân biệt thời gian mang thai Ba tiêu chuẩn để chẩn đoán thai chết lưu là: trọng lượng thai, tuổi thai chiều dài thể thai 3 TCYTTG chia làm nhóm: thai chết lưu sớm bao gồm: trọng lượng thai tối thiểu 500 gam, tuổi thai ≥ 22 tuần chiều dài thai đo từ đỉnh đầu đến gót chân 25 cm Thai chết lưu muộn có trọng lượng ≥ 1000 gam ≥ 28 tuần tuổi chiều dài thể ≥ 35cm Theo Nguyễn Đức Hinh cộng năm 2013 theo hướng dẫn Bộ Y tế việc chẩn đoán điều trị bệnh sản phụ khoa, thai chết lưu tử cung tất trường hợp thai bị chết mà lưu buồng tử cung 48 1.1.3 Nguyên nhân bất thường sinh sản 1.1.3.1 Bất thường sinh sản rối loạn vật chất di truyền - Do đột biến nhiễm sắc thể - Do đột biến đơn gen - Do rối loạn di truyền đa nhân tố 1.1.3.2 Bất thường sinh sản tác nhân môi trường - Do tác nhân vật lý - Do tác nhân hóa học - Do tác nhân sinh vật học 1.1.3.3 Bất thường sinh sản bất thường thể bố mẹ - Bất thường thể tử cung mẹ - Các bệnh lý bố mẹ 1.1.4 Hậu bất thường sinh sản Theo Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng 7,7% cặp vợ chồng vô sinh muộn, tương đương triệu đơi Ước tính khoảng 50% cặp vợ chồng vơ sinh độ tuổi 30 Tỷ lệ sẩy thai, thai chết lưu chiếm 2-3% sinh dị tật bẩm sinh khoảng 3% Tổng bất thường sinh sản chiếm >10% cặp vợ chồng 1.2 Vai trò homocystein, folat đa hình gen MTHFR 1.2.1 Vai trị homocystein Homocystein (Hcy) axit amin có chứa lưu huỳnh hình thành q trình chuyển hóa methionine (Met) thành cysteine (Cys) Cơng thức hóa học C4H9NO2S, trọng lượng phân tử 135,181 g/mol Homocystein chuyển hóa chủ yếu gan thận, có khoảng 1% lọc qua cầu thận nước tiểu Hcy toàn phần huyết bao gồm: Hcy chuyển hóa theo đường: tạo thành Met (con đường remethylation) chuyển hóa thành Cys (con đường chuyển hóa transsulfuration) chuyển hóa thành Hcy thiolactone (HTL) 4 Khi nồng độ Hcy tăng cao máu gây tổn thương mạch máu thông qua chế: (1) stress oxy hóa gây độc tế bào; (2) Nồng độ Hcy tăng cao làm kích hoạt chuỗi phản ứng đơng máu dẫn tới tình trạng huyết khối tăng cường đường tiền đông máu và/hoặc ức chế đường chống đông; (3) Nồng độ Hcy tăng cao gây nên xơ vữa mạch máu Vì nồng độ Hcy máu người mẹ mang thai tăng cao gây tổn thương mạch máu thai, dẫn đến giảm tưới máu cho thai, gây nên tượng mát thai sớm sẩy thai, thai chết lưu 1.2.2 Vai trò folat Folat vitamin nhóm B tan nước, cịn gọi vitamin B9 folacin Folat tự nhiên tồn nhiều dạng hóa học, folat tìm thấy thực phẩm, hình thức hoạt động trao đổi chất thể người 1.2.2.1 Vai trò folat sức khỏe bệnh tật Folat đóng vai trị quan trọng hình thành, phục hồi góp phần bảo vệ tổng hợp DNA nên đóng vai trị thiết yếu trình phân chia tế bào giúp cho tế bào đảm nhận chức di truyền Folat sở nhiều coenzym Trong nhiều phản ứng tổng hợp, coenzym tham dự vào trình trưởng thành phân chia tế bào Nó có vai trị quan trọng nhiều mức khác : - Tạo thành tế bào máu, thiếu folat dẫn đến thiếu máu hồng cầu to - Hệ thần kinh trung ương: thiếu folat gây trầm cảm suy giảm nhận thức - Tổng hợp acid nucleic (DNA, RNA) tạo nên gen - Trong methyl hóa acid nucleotide, điều quan trọng ngăn ngừa ung thư - Tổng hợp methionin, acid amin đồng thời tăng cường chuyển hóa Hcy làm giảm huyết khối xơ vữa động mạch - Tổng hợp protein 1.2.3 Đa hình gen MTHFR Gen MTHFR nằm nhánh ngắn NST số vị trí p36.3, vị trí phân tử từ cặp base số 11,785,730 đến cặp 11,806,103 Gen MTHFR mã hóa tổng hợp enzym MTHFR, emzyme xúc tác trình chuyển đổi 5,10methylenetetrahydrofolate thành 5-methyltetrahydrofolate, đồng chất để tái methyl hóa Hcy thành methionine Biến thể 677C→T (A222V) 1298 A→C (E429A) gen MTHFR ý cơng nhận nguyên nhân di truyền phổ biến gây chứng tăng Hcy máu Vị trí 677 nằm trình tự mã hóa vùng xúc tác (khử) enzym Đa hình làm giảm lực enzym với cofactor FAD, làm giảm 50% hoạt tính enzym, làm tăng 25% nồng độ Hcy huyết Sự biến đổi A thành C vị trí 1298 gen MTHFR làm ảnh hưởng tới vùng điều hòa enzym Hoạt tính enzym mã hóa gen đa hình bị giảm (xuống 68% so với enzym loại kiểu dại) Đa hình gen MTHFR tăng nồng độ Hcy huyết liên quan đến biến chứng thai sản đặc biệt tình trạng thai chết lưu 1.3 Các phương pháp định lượng nồng độ homocystein, folat xác định đa hình gen MTHFR 1.3.1 Các phương pháp định lượng nồng độ Hcy - Phương pháp miễn dịch hóa phát quang - Phương pháp điện hóa phát quang - Phương pháp sắc kí khối phổ 1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm folat - Phương pháp miễn dịch hóa phát quang - Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang - Phương pháp sắc kí khối phổ 1.3.3 Các phương pháp phát đa hình gen MTHFR - Phương pháp realtime PCR - Phương pháp sequencing 1.4 Các nghiên cứu mối liên quan homocystein, folat đa hình gen MTHFR 1.4.1 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ homocystein, folat huyết đa hình gen MTHFR người khỏe mạnh Để khảo sát mối liên quan nồng độ Hcy, folat huyết đa hình gen MTHFR có nhiều nghiên cứu báo cáo liên quan cộng đồng làm sở cho nghiên cứu bệnh lý khác Alessio cộng năm 2008 nghiên cứu thấy đa hình 677T A1298C gen MTHFR có liên quan có ý nghĩa thống kê với tăng nồng độ Hcy huyết Nồng độ folat khơng có khác biệt đáng kể nhóm đa hình Nghiên cứu gợi ý có yếu tố di truyền (gen MTHFR) ảnh hưởng đến nồng độ Hcy, mà không liên quan tới folat huyết Juan Ni cs năm 2017 Trung Quốc nghiên cứu đối tượng người khỏe mạnh Tác giả khảo sát mối liên quan nồng độ Hcy, folat huyết đa hình gen MTHFR vị trí 677 C→T đối tượng nghiên cứu nhận thấy: có mối tương quan nghịch nồng độ Hcy folat huyết Nam giới có nồng độ Hcy huyết cao đáng kể so với nữ giới Các cá thể có kiểu gen MTHFR 677TT có nồng độ Hcy huyết cao đáng kể so với cá thể có kiểu gen CC CT 1.4.2 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ Hcy, folat đa hình gen MTHFR phụ nữ có bất thường sinh sản Manju Puri (2013) phân tích đa hình gen MTHFR C677T, nồng độ folat, vitamine B12 Hcy huyết nhóm phụ nữ có tiền sử thai tái phát Kết cho thấy khơng có khác biệt tính đa hình gen nhóm bệnh nhóm chứng Tuy nhiên, đa hình gen MTHFR có liên quan đến tăng Hcy nhóm bệnh Sự tăng nồng độ Hcy có liên quan đến tình trạng thai tái phát với tỷ suất chệnh OR 7,02 Việc thiếu folat không rõ ràng nhóm bệnh nhóm chứng Zhong Lin (2019) nghiên cứu 403 phụ nữ có tiền sử thai tái phát 342 phụ nữ khỏe mạnh chọn ngẫu nhiên Trung Quốc Kết cho thấy khơng có khác biệt nồng độ folat nhóm bệnh nhóm chứng có khác biệt nồng độ Hcy huyết Tần suất xuất alen T SNP 677 alen C SNP 1298 gen MTHFR nhóm bệnh so với nhóm chứng có khác biệt rõ rệt Các nghiên cứu có mối liên quan nồng độ Hcy huyết đa hình gen MTHFR đối tượng thai chết lưu tái diễn Nồng độ Hcy tăng, đa hình gen vị trí 677 1298 yếu tố dự đốn có giá trị cao cho phụ nữ có nguy gặp tình trạng thai chết lưu 1.4.3 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ Hcy, folat đa hình gen MTHFR bệnh lý khác Đây nghiên cứu đánh giá mối liên quan Việt Nam Trước đó, Dương Thị Tuyết năm 2006 có đánh giá nồng độ Hcy huyết đối tượng đái tháo đường type Năm 2015 Lư Thị Thu Huyền nghiên cứu nồng độ folat huyết phụ nữ mang thai Nguyễn Văn Tuấn nghiên cứu mối liên quan nồng độ homocystein huyết với đặc điểm lâm sàng hình ảnh cắt lớp vi tính sọ não đột quỵ nhồi máu não lều giai đoạn cấp Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu phụ nữ độ tuổi sinh sản từ 18-45 tuổi, có tiền sử thai chết lưu liên tiếp hai lần trở lên loại trừ nguyên nhân gây thai chết lưu thường gặp bao gồm: Có kết âm tính với hội chứng antiphospholipid; khơng có bất thường tử cung, buồng trứng; nội tiết tố bình thường (FSH, LH) bình thường; Rh (+); NST đồ hai vợ chồng bình thường; tinh dịch đồ chồng bình thường, tỷ lệ đứt gẫy DNA tinh trùng < 15%; loại trừ thai chết lưu dùng thuốc; chiều cao ≥ 150cm cân nặng ≥ 40kg có BMI từ 18,5 đến 25 Đối tượng nghiên cứu nhóm chứng phụ nữ độ tuổi 18-45 sinh khỏe mạnh lần có thai đầu tiên, khơng có tiền sử sẩy thai, thai chết lưu khơng có tiền sử mang thai dị tật 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân có bệnh lý tâm thần; Bệnh nhân có bệnh lý suy giảm miễn dịch HIV/AIDS; Bệnh nhân mắc bệnh lý mạn tính: đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh lý tim mạch; suy gan, suy thận 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng năm 2017 đến tháng năm 2020 Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường Đại Học Y Hà Nội Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thiết kế theo phương pháp nghiên cứu bệnh – chứng 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu tính theo cơng thức 240 mẫu cho nhóm nghiên cứu bệnh : chứng với tỷ lệ 1:1 2.3.Biến số nghiên cứu - Tuổi phụ nữ: 18-45 tuổi cho hai nhóm bệnh chứng - Chiều cao, cân nặng: chiều cao ≥ 150cm cân nặng ≥ 40kg có BMI từ 18,5 đến 25 - Số lần thai chết lưu: theo Hiệp hội Y học sinh sản Hoa Kì (ASRM), sẩy thai, thai chết lưu tái diễn (Recurrent Pregnancy Loss - RPL/ gọi chung thai tái diễn) định nghĩa thai từ hai lần trở lên (thai kỳ ghi nhận siêu âm kiểm tra mô bệnh học) không thiết xảy “liên tiếp” - Nồng độ Hcy, folat huyết thanh; - Các dạng đa hình gen MTHFR 2.4.Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 2.4.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất cho xét nghiệm Hcy folat - Hệ thống phân tích tự động Abbott (modul I2000 Architech plus) 2.4.2 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất cho xét nghiệm real time PCR giải trình tự gen 8 - Máy real time CFX 960 - Máy giải trình tự Analyzer ABI3500 1.5 Quy trình tiến hành nghiên cứu Lựa chọn đối tượng đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu, thu thập thông tin theo mẫu bệnh án nghiên cứu Lấy 4ml máu đối tượng tham gia nghiên cứu chia thành ống, ống serum để làm xét nghiệm Hcy folat huyết thanh, ống EDTA để phân tích gen MTHFR 2.6 Xử lý phân tích số liệu - Phần mềm dùng để xử lý số liệu R language version 3.6.3 2.7 Xây dựng mơ hình tiên lượng Phương pháp suy luận Bayes áp dụng để xác định mô hình tối ưu dựa vào xác xuất hậu định mơ hình số BIC (Bayesian Information Criterion) Đánh giá chất lượng mơ hình độ nhạy, độ đặc hiệu, đánh giá dao động dư mơ hình cook’s distance, hat-values, studentized residuals 2.8 Vấn đề đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu thông qua hội đồng đạo đức trường Đại học Y Hà Nội theo định số 208/ HĐĐĐĐHYHN ngày 30 tháng 12 năm 2016 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm tuổi nhóm đối tượng nghiên cứu Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi nhóm nghiên cứu Nhóm chứng Nhóm bệnh NNC (n=126) (n=128) Tuổi (năm) Mean SD Mean SD Mean ± SD 31,1 4,67 30,5 5,17 p 0,31 Min- Max 20-40 20- 44 Tuổi trung bình hai nhóm chứng nhóm bệnh 31,1 ± 4,67 30,5 ± 5,17 Khơng có khác biệt độ tuổi trung bình hai nhóm nghiên cứu (p > 0,05) 3.2 Nồng độ Hcy folat huyết nhóm đối tượng nghiên cứu Bảng 3.3 So sánh kết Hcy folat nhóm bệnh nhóm chứng NNC Nhóm chứng Nhóm bệnh p Nồng độ (n=126) (n=128) Hcy (μmol/L) 7,64 ± 1,78 11,73 ± 6,08 < 0,001 Folat (ng/mL) 11,53 ± 3,21 11,45 ± 3,17 0,84 Kết nồng độ trung bình Hcy nhóm chứng nhóm bệnh tương ứng 7,64 ± 1,78 (μmol/L) 11,73 ± 6,08 (μmol/L) có khác biệt rõ rệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Nồng độ folat nhóm chứng 11,53 ± 3,21 (ng/mL) nhóm bệnh 11,45 ± 3,17 (ng/mL) khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với với p=0,84 3.3 Đánh giá đa hình gen MTHFR 3.3.1 Phát đa hình 677 gen MTHFR phương pháp realtime PCR Hình 3.1: Chứng âm khơng có DNA Hình 3.2 Hình ảnh chứng kiểu dại Hình 3.3 Hình ảnh chứng dị Hình 3.4 Hình ảnh chứng đa hợp tử hình đồng hợp tử Kết mẫu bệnh phẩm cho đường tín hiệu màu sắc tương tự mẫu chứng: khơng có đa hình gen có đường tín hiệu màu xanh cây, kiểu dị hợp tử cho đường tín hiệu kiểu đa hình đồng hợp tử cho đường màu xanh lam 3.3.2 So sánh phương pháp giải trình tự gen với kết realtime PCR phát đa hình gen MTHFR Để khẳng định kết kỹ thuật realtime PCR xác định đa hình gen MTHFR so sánh với kết giải trình tự gen máy ABI 3500 Việc lựa chọn ngẫu nhiên 10 mẫu nhóm bệnh 10 mẫu 10 nhóm chứng cho kết tương đồng 100% giữa phương pháp khẳng định kết phương pháp realtime PCR đáng tin cậy 3.3.3 Đánh giá đa hình gen MTHFR đối tượng nghiên cứu Bảng 3.4 Đánh giá tỷ lệ xuất alen C T vị trí 677 Nhóm chứng Nhóm bênh Tổng NNC p n % Alen n % n % C 216 85,71 172 67,19 388 76,38 CT=0,13 *: < 0,05; **: < 0,01; ***: < 0,001 Biểu đồ 3.1 Đánh giá nguy có thai chết lưu theo đa hình MTHFR vị trí 677 11 Việc xuất đa hình C>T có ý nghĩa tiên lượng nguy thai chết lưu tái phát có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Tại vị trí MTHFR 677 đa hình dị hợp tử đa hình đồng hợp tử khơng có khác biệt với p=0,13 Bảng 3.6 Đánh giá tỷ lệ xuất alen C vị trí 1298 Tổng NNC Nhóm chứng Nhóm bênh p Alen n % n % n % A 205 81,35 169 66,02 374 73,62