Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ HBV – DNA huyết thanh với một số chỉ số hóa sinh về chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 60420201 ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA NỒNG ĐỘ HBV – DNA HUYẾT THANH VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ HÓA SINH VỀ CHỨC NĂNG GAN Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B HỌC VIÊN THỰC HIỆN: LÊ THỊ THỦY HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TẠ THỊ THU THỦY Hà Nội, 10/2016 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 60420201 ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA NỒNG ĐỘ HBV – DNA VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ HÓA SINH VỀ CHỨC NĂNG GAN Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B HỌC VIÊN THỰC HIỆN: LÊ THỊ THỦY Xác nhận giáo viên hướng dẫn Hà Nội, 10/2016 ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập hồn thành luận văn này, nhận hướng dẫn, giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị, em bạn Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới : Ban Lãnh Đạo, Phòng sau đại học, Bộ môn – Công nghệ sinh học – Viện đại học Mở Hà Nội, khoa Vi Sinh - Bệnh viện Đa Khoa Tỉnh Thanh Hóa TS Tạ Thu Thủy – Trưởng Khoa Công nghệ sinh học – Viện đại học Mở Hà nội, cô trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tơi hồn thành luận văn PGS TS Nguyễn Huy Hoàng – Viện Trưởng – Viện nghiên cứu hệ gen, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, thầy dậy bảo, giúp đỡ nhiều để tơi hồn thành luận văn Trưởng khoa BS CK1 Vũ Thị Minh Nguyệt toàn thể anh chị em khoa Vi Sinh, Hóa Sinh, khoa Huyết Học khoa Truyền Nhiễm Các anh chị tạo điều kiện tốt cho tơi q trình làm việc, học tập thu thập số liệu để hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn GS, PGS, TS hội đồng chấm luận văn cho nhiều ý kiến xác đáng q báu để tơi hồn thành luận văn Cuối cho gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ln cạnh tơi, giúp đỡ động viên tơi q trình thực hoàn thành luận văn Hà nội, Ngày… tháng… năm 2016 Lê Thị Thủy i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm HBV Thế Giới Việt Nam 1.2 Một số đặc điểm virus viêm gan B (HBV) 1.2.1 Những đặc điểm sinh học HBV 1.2.2 Cơ chế bệnh sinh bệnh viêm gan virus B 1.2.3 Đường lây nhiễm HBV 13 1.3 Các Markers HBV ý nghĩa lâm sàng 14 1.3.1 HBsAg (Hepatitis B surface Antigen) 14 1.3.2 Anti – HBs ( HBsAb – Hepatitis B surface Antibody) 14 1.3.3 HBcAg ( Hepatitis B core Antigen) 15 1.3.4 Anti – HBc (HBcAb – Hepatitis B core Antibody) 15 1.3.5 HBeAg ( Hepatitis B e Antigen) 15 1.3.6 Anti – HBe (HBeAg – Hepatitis B e Antibody) 16 1.3.7 HBxAg ( Hepatitis B x Antigen) 16 1.3.8 HBV - DNA 16 1.3.9 cccDNA ( Covalently closed cicular DNA) 17 1.4 Biến đổi số số hóa sinh chức gan HBV - DNA bệnh HBV gây 18 1.4.1 Viêm gan virus B cấp tính (A cute hepatitis B) 18 1.4.2 Viêm gan virus B mạn tính (Chronic hepatitis B) 19 1.4.3 Xơ gan (Chirrhosis of liver ) 20 ii 1.4.4 Người mang virus viêm gan B 20 1.5 Vai trò HBV - DNA 21 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu 23 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 23 2.2.2 Cách lấy mẫu bảo quản 23 2.2.3 Các số nghiên cứu 23 2.2.4 Nguyên lý kỹ thuật xác định tiêu nghiên cứu 24 2.3 Các vật liệu hóa chất 30 2.4 Trang thiết bị 30 2.5 Thu nhập xử lý số liệu 31 2.6 Phương pháp định danh loài 31 2.6.1 Tách chiết DNA tổng số virus 31 2.6.2 Điện di DNA gel agarose 32 2.6.3 Đo quang phổ DNA 33 2.6.4 Kỹ thuật PCR 34 2.6.4.1 Nguyên lí kỹ thuật PCR 34 2.6.4.2 Khuếch đại phần đoạn gen HBsAg PCR 35 2.6.5 Tinh sản phẩm PCR 36 2.6.6 Giải phân tích trình tự đoạn gen HBsAg 36 2.7 Quy trình nghiên cứu 37 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết nghiên cứu liên quan độ tuổi, tỷ lệ mắc bệnh giới tính 38 3.2 Kết nghiên cứu HBV – DNA với tuổi giới tính phương pháp sinh học phân tử 41 iii 3.3 Kết nghiên cứu nhiễm HBV-DNA với số chức gan người bệnh 44 3.3.1 Chỉ số men gan với kháng nguyên nhân (HBeAg (-) HBeAg (+) 44 3.3.2 Mối liên quan nồng độ HBV - DNA với số số sinh hóa chức gan 47 3.4 Kết xác định chủng virus giải trình tự gen HBsAg 55 3.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số 55 3.4.2 Kết xác định nồng độ độ tinh mẫu DNA 56 3.4.3 Kết khuếch đại gen HBsAg người mang bệnh viêm gan 57 3.4.4 Kết tinh sản phẩm PCR 58 3.4.5 Kết giải phân tích trình tự DNA 58 3.4.6 Kết phân loại vùng virus 61 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1 Kết luận 63 4.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 64 B TÀI LIỆU TIẾNG ANH 66 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALT Alanin amino transferase Anti – HBc Hepatitis B core antibody (Kháng thể kháng kháng nguyên lõi virus viêm gan B) Anti – Hbe Hepatitis B e anibody (Kháng thể kháng kháng nguyên e virus viêm gan B) Anti – HBs Hepatitis B surface antibody (Kháng thể kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) AFP Alpha – fetoprotein AST Aspartat amino transferase Bp Base pair (Cặp nucleotide) Bilirubin TP Bilirubin toàn phần Bilirubin TT Bilirubin trực tiếp CccDNA Covalently closed circular DNA CD4 – CTL Cluster of differention Cytotoxic T lymphocytes (Dấu ấn CD4 tế bào lympho T) CD8 – CTL Cluster of differention Cytotoxic T lymphocytes (Dấu ấn CD8 tế bào lympho T) EDTA Enzym linked immumo sorbent assay (Thử nghiệm miễn dịch gắn men) GGT γ – Glutamyl transferase HBcAg Hepatitis B core anigen (Kháng nguyên lõi virus viêm gan B) HBeAg Hepatitis B e anigen (Kháng nguyên e virus viêm gan B) HBsAg Hepatitis B suface anigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C) HIV Human immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn dịch người) v PCR Polymerase chain reation (chuỗi phản ứng polymerase) pED1 phenol 38%, guanidium thyocianate 0.8M, glycerol 5%, pH 8.0 pEX2 Chloroform pEX3 Isopropanol tuyệt đối có chất trợ tủa pEX4 Ethanol 70% pEX5 Dung dịch TE 1X ( Tris 0.1M – EDTA 0.001M) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tỷ lệ HBsAg (+) số quần thể dân cư nước ta .4 Bảng 3.2: Trung bình HBV - DNA theo nhóm tuổi 41 Bảng 3.3: Trung bình HBV - DNA theo giới 42 Bảng 3.4: Trung bình HBV - DNA phân theo mức độ nhiễm 43 3.3 Sự tương quan nhiễm HBV-DNA với số chức gan 44 3.3.1 Chỉ số men gan với kháng nguyên nhân (HBeAg (-) HBeAg (+) 44 Bảng 3.5: Trung bình HBV - DNA HBeAg (+) HBeAg (-) 44 Bảng 3.6: Sự tương quan số men gan (AST, ALT, GGT) với HBeAg (+) HBeAg (-) 45 Bảng 3.7: Sự tương quan hàm lượng Bilirubin HBeAg (+) HBeAg (-) 45 Bảng 3.8: Hàm lượng Albumin nhóm HBeAg (+) HBeAg (-) 46 Bảng 3.9: So sánh hoạt độ enzyme AST, ALT, GGT; hàm lượng Bilirubin Albumin với nồng độ HBV - DNA < 105 copies/ml ≥ 105 copies/ml 47 Bảng 3.10: So sánh hoạt độ enzyme AST, ALT, GGT, hàm lượng Bilirubin TP, Albumin với nồng độ HBV - DNA < 105 copies/ml ≥ 105 copies/ml bệnh nhân viêm gan B có HBeAg (+) 49 Bảng 3.11: So sánh hoạt độ Enzym AST, ALT, GGT, hàm lượng Bilirubin , Albumin với nồng độ HBV - DNA < 105 copies/ml ≥ 105 copies/ml bệnh nhân viêm gan B có HBeAg (-) 50 Bảng 3.12: Mức độ tăng AST với HBV - DNA bệnh nhân có HBeAg (+) 52 Bảng 3.13: Mức độ tăng ALT với HBV - DNA bệnh nhân có HBeAg (+) 52 Bảng 3.14: Mức độ tăng AST với HBV - DNA bệnh nhận có HBeAg (-) 52 Bảng 3.15: Mức độ tăng ALT với HBV - DNA bệnh nhân có HBeAg (-) 53 Bảng 3.16: Kết đo quang phổ mẫu DNA tổng số 57 vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1: Diễn biến huyết học nhiễm cấp tính HBV khỏi 18 Biểu đồ 1.2: Diễn biến huyết học nhiễm mạn tính HBV 18 Biểu đồ 3.1: Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi giới tính 38 Biều đồ 3.2: Phân bố bệnh nhân HBeAg theo nhóm tuổi 39 Biểu đồ 3.3: Phân bố bệnh nhân HBeAg theo giới tính 40 Biểu đồ 3.4: Trung bình HBV - DNA theo nhóm tuổi 41 Biểu đồ 3.5: Trung bình HBV - DNA theo giới 42 Biểu đồ 3.6: HBV - DNA < 105 copies/ml ≥ 105 copies/ml theo giới tính 43 Biểu đồ 3.7: Sự khác biệt tỉ lệ HBeAg với HBV - DNA < 105 copies/ml ≥ 105 copies/ml 44 Biểu đồ 3.8: Mức độ tăng AST, ALT với HBeAg 46 Biểu đồ 3.9: Hoạt độ enzyme AST, ALT ≥ lần với nồng độ HBeAg 47 Biểu đồ 3.10: Mức độ tăng AST với HBV - DNA 51 Biểu đồ 3.11: Mức độ tăng ALT với HBV - DNA 51 Biểu đồ 3.11: So sánh hoạt độ enzyme AST, ALT ≥ lần với nồng độ HBV DNA < 105 copies/ml ≥ 105 copies/ml khác biệt có ý nghĩa thống kê (pC, g.326T>C g.485T>G dạng dị hợp tử kí hiệu Y, Y K kết giải trình tự Ba thay đổi nucleotide gây ba thay đổi amino acid sau: p.L88P, p.L109P p.L162R Những đột biến gen HBsAg khiến cho tăng giảm độc lực gây bệnh virus cần kiểm chứng thông qua biểu lâm sàng bệnh nhân 464 so với bệnh nhân 472 mắc chủng HBV để rút nhận định phù hợp 62 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Nồng độ trung bình HBV - DNA cao nhóm tuổi 31 – 40 (3,46 x 108 ± 1,03 x 108) chiếm 36,0% thấp nhóm tuổi 61 – 70 chiếm 3,3% Nồng độ trung bình cua HBV - DNA nhóm Nam (3,41 x 108 ± 1,05 x 108) cao so với nữ (1,71 x 108 ± 7,43x 107) khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Nồng độ trung bình HBV - DNA mức ≥ 105 copies/ml chiếm tỷ lệ (71,3%) có giá trị 3,40 x 108 ± 1,32 x 108, cao rõ ràng so với nhóm mức < 105 copies/ml với p