Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ HBV – DNA huyết thanh với một số chỉ số hóa sinh về chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI --- LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học HBV – DNA HUYẾT THANH VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ HÓA SINH VỀ CHỨC NĂNG GAN Ở BỆNH NHÂN VIÊ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

HBV – DNA HUYẾT THANH VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ HÓA SINH VỀ

CHỨC NĂNG GAN Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B

HỌC VIÊN THỰC HIỆN: LÊ THỊ THỦY HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TẠ THỊ THU THỦY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

HBV – DNA VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ HÓA SINH VỀ CHỨC NĂNG GAN

Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B

HỌC VIÊN THỰC HIỆN: LÊ THỊ THỦY

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn

Hà Nội, 10/2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của thầy cô, các anh chị, các em và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới :

Ban Lãnh Đạo, Phòng sau đại học, Bộ môn – Công nghệ sinh học – Viện đại học Mở Hà Nội, khoa Vi Sinh - Bệnh viện Đa Khoa Tỉnh Thanh Hóa

TS Tạ Thu Thủy – Trưởng Khoa Công nghệ sinh học – Viện đại học Mở

Hà nội, cô đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tôi hoàn thành luận văn

PGS TS Nguyễn Huy Hoàng – Viện Trưởng – Viện nghiên cứu hệ gen, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, thầy đã dậy bảo, giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Trưởng khoa BS CK1 Vũ Thị Minh Nguyệt và toàn thể anh chị em khoa

Vi Sinh, Hóa Sinh, khoa Huyết Học và khoa Truyền Nhiễm Các anh chị luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình làm việc, học tập và thu thập số liệu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các GS, PGS, TS trong hội đồng chấm luận văn

đã cho tôi nhiều ý kiến xác đáng và quý báu để tôi hoàn thành luận văn này Cuối cùng cho tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè luôn ở cạnh tôi, giúp đỡ động viên tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Hà n ội, Ngày… tháng… năm 2016

Lê Thị Thủy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế Giới và Việt Nam 3

1.2 Một số đặc điểm về virus viêm gan B (HBV) 5

1.2.1 Những đặc điểm sinh học của HBV 5

1.2.2 Cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm gan virus B 9

1.2.3 Đường lây nhiễm HBV 13

1.3 Các Markers của HBV và ý nghĩa lâm sàng 14

1.3.1 HBsAg (Hepatitis B surface Antigen) 14

1.3.2 Anti – HBs ( HBsAb – Hepatitis B surface Antibody) 14

1.3.3 HBcAg ( Hepatitis B core Antigen) 15

1.3.4 Anti – HBc (HBcAb – Hepatitis B core Antibody) 15

1.3.5 HBeAg ( Hepatitis B e Antigen) 15

1.3.6 Anti – HBe (HBeAg – Hepatitis B e Antibody) 16

1.3.7 HBxAg ( Hepatitis B x Antigen) 16

1.3.8 HBV - DNA 16

1.3.9 cccDNA ( Covalently closed cicular DNA) 17

1.4 Biến đổi một số chỉ số hóa sinh chức năng gan và HBV - DNA trong các bệnh do HBV gây ra 18

1.4.1 Viêm gan virus B cấp tính (A cute hepatitis B) 18

1.4.2 Viêm gan virus B mạn tính (Chronic hepatitis B) 19

1.4.3 Xơ gan (Chirrhosis of liver ) 20

1.4.4 Người mang virus viêm gan B 20

1.5 Vai trò của HBV - DNA 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu 23

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 23

2.2.2 Cách lấy mẫu và bảo quản 23

2.2.3 Các chỉ số nghiên cứu 23

2.2.4 Nguyên lý và kỹ thuật xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 24

2.3 Các vật liệu và hóa chất chính 30

2.4 Trang thiết bị chính 30

2.5 Thu nhập và xử lý số liệu 31

2.6 Phương pháp định danh loài 31

2.6.1 Tách chiết DNA tổng số của virus 31

2.6.2 Điện di DNA trên gel agarose 32

2.6.3 Đo quang phổ DNA 33

2.6.4 Kỹ thuật PCR 34

2.6.4.1 Nguyên lí kỹ thuật PCR 34

2.6.4.2 Khuếch đại một phần đoạn gen HBsAg bằng PCR 35

2.6.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 36

2.6.6 Giải và phân tích trình tự đoạn gen HBsAg 36

2.7 Quy trình nghiên cứu 37

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả nghiên cứu sự liên quan giữa độ tuổi, tỷ lệ mắc bệnh và giới tính 38 3.2 Kết quả nghiên cứu của HBV – DNA với tuổi và giới tính bằng

3.3 Kết quả nghiên cứu giữa nhiễm HBV-DNA với chỉ số chức năng

gan của người bệnh 44

3.3.1 Ch ỉ số men gan với kháng nguyên nhân (HBeAg (-) và HBeAg (+) 44 3.3.2 Mối liên quan giữa nồng độ HBV - DNA với một số chỉ số sinh hóa chức năng gan 47

3.4 Kết quả xác định chủng virus bằng giải trình tự gen HBsAg 55

3.4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 55

3.4.2 Kết quả xác định nồng độ và độ tinh sạch mẫu DNA 56

3.4.3 Kết quả khuếch đại gen HBsAg của người mang bệnh viêm gan 57

3.4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR 58

3.4.5 Kết quả giải và phân tích trình tự DNA 58

3.4.6 Kết quả phân loại vùng virus 61

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

4.1 Kết luận 63

4.2 Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 64

B TÀI LIỆU TIẾNG ANH 66

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALT Alanin amino transferase

Anti – HBc Hepatitis B core antibody (Kháng thể kháng kháng nguyên

lõi của virus viêm gan B) Anti – Hbe Hepatitis B e anibody (Kháng thể kháng kháng nguyên e của

virus của viêm gan B) Anti – HBs Hepatitis B surface antibody (Kháng thể kháng nguyên bề

mặt của virus viêm gan B)

AST Aspartat amino transferase

Bp Base pair (Cặp nucleotide)

Bilirubin TP Bilirubin toàn phần

Bilirubin TT Bilirubin trực tiếp

CccDNA Covalently closed circular DNA

CD4 – CTL Cluster of differention 4 Cytotoxic T lymphocytes (Dấu ấn

CD4 trên tế bào lympho T) CD8 – CTL Cluster of differention 8 Cytotoxic T lymphocytes (Dấu ấn

CD8 trên tế bào lympho T) EDTA Enzym linked immumo sorbent assay (Thử nghiệm miễn

dịch gắn men) GGT γ – Glutamyl transferase

HBcAg Hepatitis B core anigen (Kháng nguyên lõi của virus viêm

gan B) HBeAg Hepatitis B e anigen (Kháng nguyên e của virus viêm gan B) HBsAg Hepatitis B suface anigen (Kháng nguyên bề mặt của virus

viêm gan B) HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)

HIV Human immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn

PCR Polymerase chain reation (chuỗi phản ứng polymerase) pED1 phenol 38%, guanidium thyocianate 0.8M, glycerol 5%, pH 8.0

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tỷ lệ HBsAg (+) ở một số quần thể dân cư nước ta 4

Bảng 3.2: Trung bình HBV - DNA theo nhóm tuổi 41

Bảng 3.3: Trung bình của HBV - DNA theo giới 42

Bảng 3.4: Trung bình HBV - DNA phân theo 2 mức độ nhiễm 43

3.3 Sự tương quan giữa nhiễm HBV-DNA với chỉ số chức năng gan 44

3.3.1 Ch ỉ số men gan với kháng nguyên nhân (HBeAg (-) và HBeAg (+) 44

Bảng 3.5: Trung bình HBV - DNA giữa HBeAg (+) và HBeAg (-) 44

Bảng 3.6: Sự tương quan giữa chỉ số men gan (AST, ALT, GGT) với HBeAg (+) và HBeAg (-) 45

Bảng 3.7: Sự tương quan hàm lượng Bilirubin HBeAg (+) và HBeAg (-) 45

Bảng 3.8: Hàm lượng Albumin giữa 2 nhóm HBeAg (+) và HBeAg (-) 46

Bảng 3.9: So sánh hoạt độ enzyme AST, ALT, GGT; hàm lượng Bilirubin và Albumin với nồng độ HBV - DNA < 105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml 47

Bảng 3.10: So sánh hoạt độ enzyme AST, ALT, GGT, hàm lượng Bilirubin TP, Albumin với nồng độ HBV - DNA < 105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml ở bệnh nhân viêm gan B có HBeAg (+) 49

Bảng 3.11: So sánh hoạt độ Enzym AST, ALT, GGT, hàm lượng Bilirubin , Albumin với nồng độ HBV - DNA < 105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml ở bệnh nhân viêm gan B có HBeAg (-) 50

Bảng 3.12: Mức độ tăng AST với HBV - DNA ở bệnh nhân có HBeAg (+) 52

Bảng 3.13: Mức độ tăng ALT với HBV - DNA ở bệnh nhân có HBeAg (+) 52

Bảng 3.14: Mức độ tăng AST với HBV - DNA ở bệnh nhận có HBeAg (-) 52

Bảng 3.15: Mức độ tăng ALT với HBV - DNA ở bệnh nhân có HBeAg (-) 53

Bảng 3.16: Kết quả đo quang phổ mẫu DNA tổng số 57

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1.1: Diễn biến huyết thanh học của nhiễm cấp tính HBV và khỏi 18

Biểu đồ 1.2: Diễn biến huyết thanh học của nhiễm mạn tính HBV 18

Biểu đồ 3.1: Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi và giới tính 38

Biều đồ 3.2: Phân bố bệnh nhân HBeAg theo nhóm tuổi 39

Biểu đồ 3.3: Phân bố bệnh nhân HBeAg theo giới tính 40

Biểu đồ 3.4: Trung bình HBV - DNA theo nhóm tuổi 41

Biểu đồ 3.5: Trung bình của HBV - DNA theo giới 42

Biểu đồ 3.6: HBV - DNA < 105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml theo giới tính 43

Biểu đồ 3.7: Sự khác biệt về tỉ lệ HBeAg với HBV - DNA < 105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml 44

Biểu đồ 3.8: Mức độ tăng AST, ALT với HBeAg 46

Biểu đồ 3.9: Hoạt độ enzyme AST, ALT ≥ 2 lần với nồng độ HBeAg 47

Biểu đồ 3.10: Mức độ tăng AST với HBV - DNA 51

Biểu đồ 3.11: Mức độ tăng ALT với HBV - DNA 51

Biểu đồ 3.11: So sánh hoạt độ enzyme AST, ALT ≥ 2 lần với nồng độ HBV - DNA < 105 copies/ml và ≥ 105 copies/ml sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) 53

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Tình hình phân bố HBV trên thế giới 3

Hình 1.2: (A) HBV nhìn dưới kính hiển vi điện tử ( Bock CT & Zentgraf, 1992) và (B) Mô hình hóa cấu trúc ( Lee, 1997), (C) Tiểu thể Dane 6

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc bộ gen HBV 7

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng Real time PCR với Taqman Probe 25

Hình 2.3: Các bước tách chiết DNA cơ bản 31

Hình 3.1: Điện di DNA tổng số các mẫu bệnh phẩm 56

Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2% 57

Hình 3.3: Điện di thôi gel sản phẩm PCR 58

Hình 3.4: So sánh trình tự đoạn gen HBsAg giữa các mẫu bệnh phẩm trên phần mềm BioEdit 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu về chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của con người ngày càng cao, có sức khỏe con người có thể làm ra nhiều của cải vật chất, nâng cao chất lượng cuộc sống Vì vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu các tác nhân gây bệnh và cách chữa trị cho con người là việc làm thiết thực có ý nghĩa quan trọng, góp phần vào sự phát triển chung của nhân loại Tồn tại xung quanh chúng ta

có biết bao tác nhân gây bệnh mà mắt thường không nhận biết được Khi cơ thể suy yếu sức đề kháng giảm chúng ta đều có thể bị tấn công

Hiện nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của khoa học cũng như y học người ta đã phát hiện ra rất nhiều loại virut có khả năng lây bệnh trong đó có vi rút viêm gan B Viêm gan virus (VGVR) là bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất trên thế giới Tỷ lệ lưu hành VGVR ở các nước rất khác nhau, nhưng đặc biệt cao ở các nước đang phát triển VGVR ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe, đời sống tuổi thọ của cộng đồng Đến nay, người ta đã xác định có ít nhất 6 loại virus gây viêm gan mang tên

A, B, C, D, E và G Viêm gan do HBV có mặt ở mọi vùng địa lý và đang là mối quan tâm của y tế toàn cầu Theo tổ chức thế giới (WHO), viêm gan B là 1 trong 10 bệnh gây tử vong nhiều nhất (Khoảng 1 triệu ca tử vong mỗi năm) và có khả năng lây nhiễm mạnh mẽ gấp 100 lần so với virus HIV, hiện nay có khoảng 2 tỷ người nhiễm HBV, trong đó trẻ em là 500 triệu người và có khoảng 400 triệu người nhiễm HBV mãn tính Tỷ lệ nhiễm HBV trong quần thể rất khác nhau giữa các nước: Ở Bắc Mỹ và Châu Âu tỉ lệ Anti – HBs (+) là 20% dân số, trong khi đó ở Đông Nam

Á và Châu Phi tỉ lệ Anti – HBs (+) là 60% dân số [50]

Tại Việt Nam, các tác nhân gây viêm gan virus hiện đã được xác định và có mặt

đủ nhưng hai loại đáng chú ý hơn cả là B và C Theo điều tra tỷ lệ viêm gan B là 15-20%

và hàng năm khoảng 300 – 500 bệnh nhân vào điều trị do viêm gan virus, trong đó 42,8% có HbsAg (+), điều đó chứng tỏ viêm gan B là căn nguyên chính trong các căn nguyên gây bệnh viêm gan virus ở Việt Nam

Hiện nay, HbsAg (+) là tiêu chuẩn chính yếu để chẩn đoán nhưng nếu HBsAg (-) thì Anti – HBs cũng đủ để chứng minh bệnh đã từng bị nhiễm HBV Sau khi đã xác định bị nhiễm HBV, nếu muốn bệnh nhân đang ở giai đoạn nào của bệnh thì mới cần kết hợp thêm các dấu ấn còn lại Khi bệnh cảnh lâm sàng rất gợi ý đến

viêm gan siêu vi mà tất cả các dấu hiệu huyết thanh còn lại đều âm tính, đặc biệt là HBsAg, các bác sỹ thường yêu cầu làm thêm xét nghiệm phát hiện dấu ấn HBV – DNA có thể phát hiện tất cả các trường hợp Bệnh nhân vì nhiễm HBV vì rất dễ dàng tái phát sau khi ngưng điều trị, vì HBV luôn tồn tại trong nhân tế bào gan dưới dạng cccDNA (Covalently closed circular DNA) để làm nguồn gốc di truyền của virus, và dạng này không hề bị tác động bởi các thuốc kháng virus là các nucleosides analogs Nhiều bằng chứng cho thấy nếu không kiểm soát mà để lượng HBV hoàn chỉnh trong máu lên quá cao thì bệnh viêm gan mạn tính sẽ có nguy cơ diễn tiến đến suy gan mất bù, hay sơ gan tiến triển hoặc ung thư gan

Những năm gần đây với sự phát triển của công nghệ Taqman Probe ra đời phương pháp sinh học phân tử mới – Phương pháp Realtime PCR Phương pháp này cho phép xác định chính xác số lượng tuyệt đối mầm bệnh, đồng thời cho phép ngưỡng phát hiện thấp hơn và giới hạn xác định rộng hơn Việc kết hợp định lượng nồng độ HBV – DNA bằng phương pháp Realtime PCR với xét nghiệm một số chỉ số hóa sinh chức năng gan đã giúp đỡ rất nhiều cho việc đưa ra phác đồ điều trị của thầy thuốc Đã

có nghiên cứu chỉ số hóa sinh chức năng gan hay các dấu ấn của virus viêm gan B với nồng độ HBV – DNA ở những bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B Tuy nhiên những nghiên cứu đề cập đến mối liên quan này còn ít và chưa hệ thống Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ HBV – DNA với một số chỉ số

hóa sinh về chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan B”

Với các mục tiêu sau:

1 Xác định nồng độ HBV – DNA ở bệnh nhân viêm gan B

2 Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ HBV – DNA với một số chỉ số hóa sinh về chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan B

3 Giải trình tự gen và xác định loài

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nhiễm HBV trên Thế Giới và Việt Nam

* Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự phục hồi đến viên gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan [4], [5] HBV có thể lây qua đường tình dục, đường máu, từ mẹ sang con Ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV, trong đó gần 350 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính [47] Tỷ lệ lưu hành HBV ở mức trung bình tại vùng Địa Trung Hải, Nhật Bản và một phần Đông Âu Trong khi đó

tỷ lệ này tương đối thấp dưới 2% dân số tại phần lớn các nước Tây Âu, Châu Úc và Bắc

Mỹ Trung bình mỗi năm có hơn 1 triệu người chết do nhiễm HBV gây nên [4], [5] Sự khác nhau về tỷ lệ lưu hành toàn cầu có khả năng là do có sự khác biệt về các đường lây truyền HBV chính, điều kiện kinh tế và khả năng chăm sóc y tế Ở các vùng bệnh lưu hành địa phương như Châu Á và Tây Phi, lây truyền HBV thường xẩy ra trong thời kỳ chu sinh, với tỷ lệ lây truyền cho trẻ sơ sinh cao đến 90% từ các bà mẹ có HBsAg và HBeAg (+) Người ta thấy rằng có trên 95% các trường hợp trẻ lây nhiễm HBV từ mẹ trở thành người mang HBV mạn tính [4], [5]

Hình 1.1: Tình hình phân bố HBV trên thế giới

* Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Ở Việt Nam rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV đứng hàng cao nhất thế giới Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21% thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người mang HBV mạn tính [1], [5], [6], [7] Tỷ lệ mang anti – HBs trên 60% Tuy vậy, tỷ lệ nhiễm HBV ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng tác giả cũng khác nhau Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam được các nghiên cứu công bố gần đây tóm tắt ở bảng 1.1

Bảng 1.1: Tỷ lệ HBsAg (+) ở một số quần thể dân cư nước ta

Địa

Hà Nội Lê Vũ Anh và CS

Dân cư

35 – 59 tuổi Người lớn khỏe mạnh

11,35 14,4 13,9

1995

1995 Những người mang HBV mạn tính không triệu chứng tuy bề ngoài khỏe mạnh bình thường, nhưng họ vẫn có khả năng truyền bệnh và là ổ chứa HBV trong

tự nhiên – về phương diện dịch tễ học họ là mối nguy cơ lớn trong cộng đồng

Viêm gan virus B lây truyền chủ yếu qua đường truyền máu và tiêm chích, tuy nhiên lây truyền từ mẹ sang con trong thời kỳ chu sinh cũng đóng vai trò quan trọng Bằng kỹ thuật ELISA, Phạm Song, Đào Đình Đức, Đỗ Trung Phấn và cộng

sự đã xét nghiệm trên 1.865 bà mẹ khỏe mạnh trước đẻ thấy 12,7% mang HBsAg (+) trong số này có 36,3% có cả HBeAg (+) Xét nghiệm máu cuống rốn của các trẻ

sơ sinh có mẹ mang HBsAg (+) thấy có 44,7% có HBsAg (+) Các bà mẹ có cả 2 marker HBsAg (+) và HBeAg (+) thì máu cuống rốn của con họ có tới 96,4% có HBsAg (+) Vì khi có HBeAg (+) là lúc virus đang nhân lên và sự lây nhiễm cũng rất mạnh Tình trạng này dẫn tới nguy cơ là ở Việt Nam số người bệnh gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát (UTGNP) cao

Về giới trong công trình nghiên cứu của Châu Hữu Hầu tỷ lệ HBsAg (+) ở nam giới cao gần gấp đôi nữ giới với tỷ suất chênh là 1,7 Theo Lê Khắc Thọ thì tỷ

lệ này ở nam giới là 21,3% nữ giới là 15% Theo Lê Vũ Anh thì lại không có sự khác biệt về tỷ lệ HBsAg (+) giữa nam (12,5%) và nữ (10,1%)

1.2 Một số đặc điểm về virus viêm gan B (HBV)

1.2.1 Những đặc điểm sinh học của HBV

a Đặc điểm hình thể cấu trúc virus HBV

HBV là một thành viên thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại virus hướng gan (Hepatotropic) có bộ gen (genome) là chuỗi xoắn kép DNA đóng vòng không kín, có Capside và quá trình nhân lên không gây tan tế bào gan nhiễm virus [4], [5] Dưới kính hiển vi điện tử (Hình 1.1A) quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau:

+ Tiểu thể hình cầu nhỏ (Small particle) có đường kính 22nm

+ Tiểu thể hình ống (Tubular particle) kích thước 22nm dài 40 – 400nm + Tiểu thể hình cầu lớn (Large particle) có kích thước 42 – 45nm Đây chính

là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp:

- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein Lớp này có các kháng nguyên bề mặt (HBsAg)

- Lớp lõi: Capside đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi HBcAg Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng không kín, Enzym phiên mã ngược Polymerase và protein kinas

(A) (B)

(C)

Hình 1.2: (A) HBV nhìn dưới kính hiển vi điện tử ( Bock CT & Zentgraf, 1992) và (B)

Mô hình hóa cấu trúc ( Lee, 1997), (C) Tiểu thể Dane

b C ấu trúc bộ gen của HBV

Bộ gen của HBV là một phân tử DNA đóng vòng không kín gồm 2 sợi có kích thước khác nhau Sợi dài nằm bên ngoài mang điện tính âm tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3200 cặp base và mã hóa cho toàn bộ thông tin

di truyền của HBV Sợi ngắn nằm bên trong điện tính dương có chiều dài thay đổi bằng 50 – 80% so với sợi âm [4], [5], [7]

Cấu trúc vòng của DNA được đảm bảo là nhờ sự ghép nối 2 đầu 5’ của 2 sợi DNA trên một đoạn có chiều dài là 200 nucleotide (Nu), được gọi là vùng liên kết (cohesive region) Vùng này nằm giữa 2 trình tự DR1 và DR2 (Directly repeated sequence) gồm 10 – 11 Nu, trong đó DR1 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA âm và cũng

sợi DNA dương Hai trình tự này có vai trò chủ yếu trong việc khởi phát quá trình tổng hợp các chuỗi DNA tương ứng Thứ tự của các Nu được đánh số bắt đầu từ 1 tương ứng ở các vị trí cắt trên bộ gen HBV của enzyme EcoRI (Hình 1.2) Chiều dài của bộ gen thay đổi tùy theo từng kiểu gen khác nhau [7], [70]

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc bộ gen HBV

Bộ gen của HBV được tổ chức thành 4 đơn vị sao dịch mã dưới sự điều khiển của 4 vùng khởi động độc lập (Promoter) tạo ra 4 chuỗi RNA thông tin (mRNA) với kích thước tương ứng là 3,5; 2,4; 2,1 và 0,7 Kilobase (Kb) Quá trình đọc mã bắt đầu từ bộ ba nucleotide ATG được gọi là codon mở đầu (start codon) và chấm dứt bằng codon kết thúc (stop codon) là TAG Những phân tử mRNA tạo thành sẽ được vận chuyển ra bào tương tế bào và sẽ dịch mã tạo ra các protein tương ứng là capside, polymerase, protein bề mặt và HBx, cuối cùng các protein này được lắp gép với gregenomic HBV – RNA và tiếp tục hoàn thành chu trình nhân lên của HBV [70]

* Gen S (Surface)

Có mã số AB937799.1 trên Genbank gồm 3 vùng: Vùng S, preS1, PreS2 có chức năng mã hóa tổng hợp protein bề mặt của HBV hay HBsAg bao gồm HBsAg nhỏ (small HBsAg – SHBsAg), HBsAg trung bình (medium HBsAg – SHBsAg) và HBsAg lớn (Large HBsAg – SHBsAg)

+ Vùng S có chiều dài 2,4 Kb gồm 226 Acid amin (aa), mã hóa tổng hợp SHBsAg Protein này gồm 2 thành phần là gp24 và gp27 (gp: Glycoprotein)

SHBsAg là thành phần chủ yếu của SHBsAg dư thừa trong huyết thanh và chiếm tới 80% cấu trúc vỏ lớp virus Vai trò của SHBsAg thực sự còn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ Nhiều nhà khoa học co rằng SHBsAg đóng vai trò trong việc giúp HBV trốn tránh miễn dịch Ở vùng S có quyết định kháng nguyên (Antigennic determinant) “a” chung và các kháng phụ nguyên “d”,“y”,“w”,“r”,“q” Sự kết hợp giữa kháng nguyên “a” và các kháng nguyên phụ đã tạo ra 9 phân típ

“ayw1”,“ayw2”,“ayw3”,“ayw4”,“ayr”,“adw2”,“adw4”,“adrq+”,“adrq-” [58],[68] Cho đến nay có rất ít nghiên cứu nói tới ảnh hưởng của kiểu kháng nguyên tới biểu hiện lâm sàng nhiễm HBV mà chỉ dừng ở khía cạnh dịch tễ học cũng như đáp ứng miễn dịch chủ động thông qua việc tiêm vaccine phòng bệnh viêm gan B

+ Vùng S, PreS2 mã hóa tổng hợp phân tử MHBsAg Protein này bao gồm 2 thành phần gp33 và gp36 và là thành phần ít nhất có mặt trong cấu trúc lớp voe của HBV Người ta cho rằng vùng PreS2 có vai trog giúp cho virus HBV bám dính và xâm nhập vào trong tế bào theo cơ chế nhập bào thông qua mối liên kết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh người có tên gọi là Polymerized Human Serum Albumin – pSHA Thiếu hụt pSHA, hoặc thụ thể dành cho pSHA trên tế bào gan, sẽ làm cho HBV khó có thể xâm nhập vào tế bào gan [4], [17], [72]

+ Vùng S, Pre S1, Pre S2 mã hóa tổng hợp phân tử LHBsAg Phân tử LHBsAg chiếm khoảng 20% cấu trúc vỏ bọc của HBV Vùng Pre S1 có chiều dài thay đổi ở các phân típ khác nhau Đây là vùng kết dính đầu tiên của HBV vào tế bào gan, cho dù việc xác định thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào gan còn chưa biết được [4], [72]

* Gen C (Core)

Có mã số AB937799.1 trên Genbank có 2 vùng mã hóa

+ Vùng C có chiều dài 181 – 183 codon, mã hóa tổng hợp HBcAg Đây là protein cấu trúc nucleocapside Phân tử HBcAg được tổng hợp trong bào tương tế bào gan Phân tử HBcAg không có mặt trong huyết thanh bởi vì nó không có đoạn peptid tín hiệu (Sinnal peptid) pre –C, do vậy nó không thể bài tiết ra khỏi tế bào gan dưới dạng tự do [6]

+ Vùng Pre – C, C có chiều dài 212 – 214 codon, mã hóa tổng hợp HBeAg

cấu trúc có chứa đoạn peptid tín hiệu pre – C HBeAg không tham gia cấu trúc của HBV [60]

và LHBsAg lên vỏ [72]

+ Vùng Ribonuclease H (Rnase – H) Vùng này mã hóa tổng hợp enzyme ribonuclease H, enzyme có chức năng thoái biến khuôn mã mRNA sau khi kết thúc tổng hợp DNA nhánh âm

Gen P mã hóa tổng hợp DNA polymerase, đây là một enzyme phụ thuộc RNA và DNA, có nhiệm vụ xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA nhánh âm từ pregenomic mRNA và nhánh dương từ DNA nhánh âm

* Gen X

Có mã số AB937799.1 trên Genbank Gen X mã hóa tổng hợp HBxAg Phân

tử HBxAg có 154 acid amin, trọng lượng phân tử 16,5 Kb, có thời gian bán hủy là

30 – 120 phút [72] Cho đến nay chức năng của HBxAg thực sự còn nhiều bí ẩn Tuy vậy, các nhà khoa học cho rằng HBxAg là một protein đa chức năng có vai trò trong cơ chế điều hòa tăng trưởng tế bào và cơ chế gây ung thư gan [36], [57]

1.2.2 Cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm gan virus B

a Vòng đời của HBV (The viral of life cycle)

Vòng đời của HBV chia làm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn sớm (The erly stage) bao gồm các bước: Gắn kết (attachement),

xâm nhập (penetratinon), phóng thích lõi (uncoating) DNA virus gắn kết với DNA

tế bào gan Chuỗi dương được tổng hợp bổ sung chiều dài bằng chuỗi âm nhờ DNA – polymerase có chức năng sửa chữa của tế bào gan DNA virus xoắn vòng khép

kín bởi liên kết đồng hóa trị tạo ra cccDNA (covalently closed circular DNA) [9], [63] cccDNA kết hợp với histone của nhân tế bào gan để tạo thành thể nhiễm sắc ngoại thể (minichromosome) và trở thành khuôn mẫu cho việc tổng hợp các mRNA virus cccDNA tồn tại suốt cùng với sự tồn tại của tế bào gan, chỉ bị mất đi khi tế bào gan nhiễm bị phá hủy hoặc chết theo chương chình [46]

- Giai đoạn trung gian (The middle stage): gồm 2 giai đoạn:

+ Giai đoạn sao chép: Từ cccDNA, sợi mRNA tiền goneme (pregenomic mRNA- pg mRNA) và các sợi mRNA bán phần genome được tạo ra nhờ sự xúc tác của RNA - polymerase của tế bào gan

+ Giai đoạn tạo encapsidation và dịch mã: Sau khi tổng hợp pg mRNA, HBcAg, HBV – polymerase Dưới sự kích thích của tín hiệu tạo vỏ epsilon, phân tử HBcAg gói Pg RNA, HBV – polymerase để tạo ra nucleocapside Trong phân tử nucleocapside dưới kích thích của tín hiệu epsilon và tín hiệu sao chép ngược quá trình sao chép ngược từ Pg mRNA tạo DNA nhánh âm được thực hiện DNA nhánh dương được tổng hợp từ nhánh âm

- Giai đoạn muộn (the late stage): là giai đoạn tao virion mới và phóng thích

vào máu Các virion tuần hoàn trong máu có T1/2 là 1 ngày, tiếp tục xâm nhập vào gan (turnover) để tiếp tục các chu trình mới không ngừng, liên tục Quá trình HBV phát triển trong tế bào gan không gây phá vỡ tế bào gan

b Đáp ứng miễn dịch với HBV

Cho đến nay, phải khẳng định rằng cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm gan virus

B vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ Tuy nhiên, hầu hết các nhà khoa học đều cho rằng cơ chế bệnh sinh của bệnh chính là cơ chế miễn dịch, hậu quả của bệnh hoàn toàn phụ thuộc vào số lượng, chất lượng, động học của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thu nhân [28], [46]

Cơ chế đào thải HBV ra khỏi cơ thể bao gồm cơ chế gây hủy tế bào (cytolytic) và không gây hủy (non cytolytic) được thực hiện bởi đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch thu nhận

Với bệnh nhân viêm gan virus B cấp tính tự giới hạn, việc đào thải HBV ra khỏi cơ thể nhiễm là sự kết hợp của 3 cơ chế:

- Lý giải tế bào gan nhiễm thông qua đáp ứng miễn dịch gây độc tế bào của các tế bào CD4 – CTL, CD8 – CTL đặc hiệu HBV, đây là cơ chế chính đào thải HBV và gây tổn thương tế bào gan

- Vai trò của các cytokin không gây ly giải tế bào do các CTL sản sinh ức chế sự sao chép của HBV và giảm biểu hiện gen của HBV lên bề mặt tế bào nhiễm, đây là cơ chế chính có tác dụng ức chế sao chép của HBV dẫn tới tải lượng virus giảm trước khi CLT hoạt hóa và enzyme ALT tăng

- Vai trò của các tế bào miễn dịch bẩm sinh làm gia tăng phá hủy tế bào gan

và các cytokin INFα/β, INFγ ức chế sao chép của HBV

- Vai trò của HBcAb và HBsAb trong việc làm sạch HBV ở bệnh nhân viêm gan virus cấp tự giới hạn vẫn còn bàn cãi Hầu hết các nhà khoa học cho rằng: HBcAb không có vai trò nào trong cơ chế đào thải HBV HBsAb được gọi là kháng thể chống tái nhiễm và lây nhiễm

Tuy nhiên, nhiễm HBV tế bào gan thường có chiều hướng dai dẳng do:

- HBV lây nhiễm hầu như tất cả tế bào gan trong khi đó số lượng CD8 – CTL chỉ bằng 1/1000 tế bào gan đã cản trở đáp ứng miễn dịch thải loại HBV

- Nồng độ HBsAg, HBeAg trong máu cao đã làm dung nạp đáp ứng miễn dịch thu được, cản trở đào thải HBV [46], [59], [66] Điều này đã được chứng minh

ở những người nhiễm HBV chu sinh HBeAg có trọng lượng phân tử thấp từ máu

mẹ đã xâm nhập được qua hàng rào nhau thai vào thai nhi đã gây ra hiện tượng dung nạp HBeAg của hệ thống miễn dịch, từ đó các tế bào CD8 – CTL đã không nhận biết được kháng nguyên HBc trên bề mặt tế bào gan nhiễm, từ đó làm giảm khả năng phá hủy tế bào [56], [71]

- HBxAg ức chế hoạt động của proteasome từ đó làm giảm khả năng trình diện kháng nguyên HBV của phân tử MHCI và MHCII của các tế bào gan nhiễm HBV Do vậy khả năng nhận biết tế bào gan nhiễm HBV của tế bào lympho T CD8

và T CD4 suy giảm dẫn đến giảm hủy hoại tế bào nhiễm [45], [72]

- Đột biến polymerase trước áp lực thuốc có bản chất là các ncleot(s)ide đã tạo ra các chủng virus kháng thuốc có khả năng trốn tránh tác dụng thuốc để tồn tại kéo dài

- Sự tồn tại cua HBV trong các tế bào mono và tủy xương có thể là nguồn dự trữ HBV ngoài gan [9], [46]

+ Vai trò thuộc về ký chủ:

- Vai trò của các dòng tế bào lympho T: các dòng tế bào lympho T suy nhược (anergy) hoặc bị ức chế và hiếm hơn là các dòng tế bào lympho T bị phá hủy (deletion) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tồn tại dai dẳng của HBV [46]

- Vai trò của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh: Thất bại của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh trong thải loại HBV do nhiều nguyên nhân gây ra: Thứ nhất phải tính đến yếu tố khách quan là HBV là virus tự che dấu, không gây kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh, thứ hai là khiếm khuyết chức năng của tế bào tua không thể xử lý và trình diện kháng nguyên HBV, thứ ba là thiếu hụt các thụ thể giống toll nhất là TLR -2 và protein gắn gốc manose, thứ tư là thiếu hụt các yếu tố hóa ứng động bạch cầu như: MCP -1 (Monocyte chemotactic protein 1), thứ năm là sự gia tăng quá mức của thụ thể 5 dành cho các cytokin có bản chất hóa học (chemokine receptor 5) đã làm tăng hoạt động của TCD4,… và yếu tố quan trọng nhất là sự suy giảm cả về số lượng và chất lượng tế bào NK và NKT [15], [46]

- Vai trò của đáp ứng miễn dịch thu được: Đồng kích thích các phối tử của tế bào trình diện kháng nguyên đã cảm ứng thụ thể CTLA4 trên bề mặt lympho T ức chế, từ đó hoạt hóa lympho T ức chế dẫn tới giảm khẳ năng đáp ứng của các tế bào

lympho T có thẩm quyền miễn dịch → HBV trốn tránh đáp ứng miễn dịch, tồn tại dai dẳng trong ký chủ

- Vai trò của các gen di truyền: Bệnh nhân có các phân tử MHC I có alen DRBI – 1302, 02, 04 đề kháng cao với HBV trong khi đó alen DRBI – 07 Thì làm gia tăng sự tồn tại dai dẳng của HBV, sự thiếu hụt MHC I cũng là nguyên nhân giúp HBV tồn tại dai dẳng

- Vai trò của INF: Thiếu hụt INF làm tăng khả năng sao chép của HBV, giảm khẳ năng biểu hiện gen HBV phụ thuộc MHC I lên bề mặt tế bào nhiễm cũng là nguyên nhân quan trọng dẫn tới sự tồn tại dai dẳng của HBV

- Vai trò của giới tính: Nam giới thường nhiễm HBV mạn tính nhiều hơn nữ giới, cơ chế thì chưa sáng tỏ, có lẽ liên quan đến hormone giới tính và phần tử đáp ứng glucorticoide (GRE) kích hoạt sao chép từ cccDNA [4]

+ Với bệnh viêm gan ác tính, nhiều nhà khoa học nhấn mạnh đến vai trò quá mức của quần thể tế bào có trách nhiệm trong cơ chế hủy hoại tế bào gan nhiễm, đặc biệt nhấn mạnh vạ trò của tế bào lympho TCD8

+ Với bệnh viêm gan mạn bùng phát là do sự thoát ức chế của CD4 – CTL, CD8 – CTL với HBeAg đã gây lên phản ứng chéo với HBcAg

1.2.3 Đường lây nhiễm HBV

HBV có ở trong máu và các chế phẩm từ máu, các dịch tiết như tinh dịch, dịch âm đạo, nước bọt, nước mắt, sữa mẹ… Khi tiếp xúc với các nguồn bệnh trên sẽ

có nguy cơ cao nhiễm HBV

Có 3 con đường lây nhiễm HBV cơ bản:

+ Lây truyền từ máu và các chế phẩm từ máu thông qua tiêm, truyền, các thủ thuật, phẫu thuật, lọc máu… Hiện nay, những người sử dụng ma túy đường tiêm chích chính là đối tượng có nguy cơ nhiễm HBV cao nhất

+ Lây truyền từ mẹ sang con: Đây là đường truyền bệnh nguy hiểm bởi vì có đến 90 – 95% số trẻ bị nhiễm theo con đường này có nguy cơ tiến triển thành nhiễm HBV mạn tính Tỷ lệ lây nhiễm cho trẻ cao khi người mẹ nhiễm HBV cấp ở 3 tháng cuối của thai kỳ và gần thời gian đẻ đối với người mẹ nhiễm HBV mạn tính Nếu người mẹ đồng thời HBsAg (+) và HBeAg (+) thì nguy cơ nhiễm cho con lên tới 90% [4]

+ Lây truyền qua đường tình dục: sinh hoạt tình dục với người nhiễm HBV,

dù khác giới hay đồng giới bằng các đường âm đạo, hậu môn hay đường miệng đều

có khả năng nhiễm bệnh Khả năng lây bệnh cao khi người nhiễm HBeAg (+), hoặc nồng độ HBV - DNA ≥ 105 copies/ml

Không lây qua đường tiếp xúc thông thường như: Hôn lên má, ho hoặc hắt hơi, ôm hoặc nắm tay nhau, ăn thực phẩm từ một người nhiễm bệnh nấu, chia sẻ đồ dùng ăn uống như đũa hoặc muỗng

1.3 Các Markers của HBV và ý nghĩa lâm sàng

1.3.1 HBsAg (Hepatitis B surface Antigen)

HBsAg là kháng nguyên bề mặt của HBV HBsAg xuất hiện sớm nhất trong huyết thanh sau khi nhiễm HBV HBsAg còn có trong các dịch tiết như dịch âm đạo, tinh dịch, sữa mẹ, nước mắt… [13], [17]

HBsAg (+) cho phép khẳng định chắc chắn bệnh nhân nhiễm HBV, với các test rất nhạy có thể phát hiện HBsAg (+), nhưng thời gian tồn tại của HBsAg không quá 2 tuần [40], [72] HBsAg kéo dài trên 6 tháng thì khẳng định nhiễm HBV mạn tính [19], [37]

1.3.2 Anti – HBs ( HBsAb – Hepatitis B surface Antibody)

Anti – HBs là kháng thể trung hòa HBsAg Anti – HBs xuất hiện sau khi HBsAg mất đi sau 2 – 16 tuần, Anti – HBs (+) ở bệnh nhân đang điều trị cho phép khẳng định bệnh hồi phục, cơ thể loại trừ được HBV và bệnh nhân đã có đáp ứng miễn dịch, nhưng thực tế ở một số bệnh nhân Anti – HBs chỉ xuất hiện thoáng qua hoặc không bao giờ xuất hiện [12], [38], [41]

Anti – HBs (+) đơn độc chỉ gặp ở người đã tiêm phòng Vaccine phòng bệnh viêm gan virus B Nồng độ Anti – HBs trên 10 UI là có hiệu lực bảo vệ [8], [67]

Anti – HBs (+) và HBsAg (+) gặp trong một số trường hợp viêm gan bùng phát có sự hiện diện của nhiều phân típ khác nhau [30], [59]

Anti – HBs (-) gặp trong giai đoạn cửa sổ của nhiễm HBV cấp và được giải thích là do nồng độ chưa đủ lớn để gây chuyển đảo huyết thanh, hoặc nồng độ dưới ngưỡng của các test phát hiện

1.3.3 HBcAg ( Hepatitis B core Antigen)

HBcAg chỉ có mặt trong tế bào nhiễm HBV và tiểu thể Dane, không có ở dạng tự do trong huyết thanh HBcAg được phân tử MHC 2 trình diện lên bề mặt tế bào gan nhiễm để tế bào CD8 – CTL nhận diện [46]

1.3.4 Anti – HBc (HBcAb – Hepatitis B core Antibody)

Đây là kháng thể hình thành đầu tiên sau khi nhiễm HBV Có 2 lớp HBcAb, lớp IgM – HBcAb xuất hiện sớm nhất, thường vào tuần 5 – 6 kể từ khi nhiễm, đạt đỉnh cao vào tuần 12 – 16 và sau đó giảm dần và mất đi sau 1 năm kể từ khi xuất hiện Lớp IgG – HBcAb cũng xuất hiện sớm ngay từ tuần thứ 5 hoặc 6 kể từ khi nhiễm HBV nhưng với hiệu giá thấp, sau đó tăng dần hoàn toàn thay thế lớp IgM – HBcAb và tồn tại suốt đời Anti – HBc không có khả năng loại trừ HBV ra khỏi cơ thể [25], [59]

1.3.5 HBeAg ( Hepatitis B e Antigen)

HBeAg (+) là maker cho phép xác nhận virus đang sao chép trong cơ thể người bệnh và người bệnh có nguy cơ lây nhiễm cao [29], [42]

HBeAg có mặt sớm ngay sau hoặc cùng khi xuất hiện HBsAg ở pha nhiễm trùng cấp tính HBeAg chỉ tồn tại vài ngày đến vài tuần nhường cho sự xuất hiện của Anti – Hbe và hiện tượng này gọi là chuyển đảo huyết thanh HBeAg (HBeAg seroconversion) Chuyển đảo huyết thanh HBeAg bao giờ cũng xẩy ra trước khi chuyển đảo HBsAg [43], [59] Nếu HBeAg tồn tại kéo dài thì nguy cơ bệnh tiến triển mạn tính

Ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính, việc khám phá HBeAg thường đi cùng với việc khám phá HBV - DNA trong máu Theo dõi diễn tiến tự nhiên của người nhiễm HBV mạn thấy HBeAg (+) ở giai đoạn dung nạp miễn dịch và giai đoạn đào thải miễn dịch, đến giai đoạn hòa nhập thì HBeAg (-) Bệnh nhân viêm gan B mạn

có HBeAg (+) có nguy cơ làm bệnh tiến triển nặng, viêm gan bùng phát, bệnh gan mất bù, xơ gan và ung thư gan

Ở thai phụ nhiễm HBV có HBeAg (+) khẳ năng lây nhiễm cho con >95%, ngược lại ở thai phụ nhiễm HBV có HBeAg (-) chỉ < 5% [22],[48] Mặt khác, vợ hoặc chồng của bệnh nhân viêm gan virus B có HBeAg (+) sẽ bị nhiễm HBV, ngược lại nếu bệnh nhân có Anti – Hbe (+) chỉ là 30% [48]

Những trường hợp đột biến tiền nhân và chuyển đảo huyết thanh HBeAg luôn âm tính Trong trường hợp đột biến tiền nhân để xác định virus có sao chép hay không thì xét nghiệm HBV - DNA là chỉ định bắt buộc Trong thực hành điều trị, HBeAg không những có giá trị phân nhóm điều trị mà còn là chỉ tiêu theo dõi điều trị Ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn có HBeAg (+) điều trị bằng Analogue nucleot(s)ide nếu xuất hiện chuyển đảo huyết thanh HBe sẽ báo hiệu sự tiến triển tốt của bệnh và có thể xem xét việc ngưng thuốc ở thời điểm HBV - DNA (-) ở lần xét nghiệm sau với khoảng thời gian cách lần xét nghiệm trước ít nhất 6 tháng Ngược lại, ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn có HBeAg (-), việc ngưng thuốc chỉ được xem xét ít nhất sau 3 lần xét nghiệm có HBV - DNA (-) với khoảng cách giữa 2 lần xét nghiệm tối thiểu là 6 tháng [60], [69]

1.3.6 Anti – HBe (HBeAg – Hepatitis B e Antibody)

Anti – Hbe xuất hiện vào giai đoạn cuối của pha nhiễm trùng cấp tính, trước khi chuyển đảo HBsAg và tồn tại kéo dài vài tháng đến vài trục năm, thậm chí suốt đời [41],[54] Anti – Hbe xuất hiện đồng thời với việc HBeAg (+) → HBeAg (-), người ta gọi là hiện tượng chuyển đảo huyết thanh Khi đó bệnh tiến triển tốt, virus không sao chép trong cơ thể và có thể bị thải loại, bệnh có thể khỏi Do vậy có thể nói Anti – Hbe là marker tiên lượng bệnh và điều trị [48], [59] Anti – Hbe (+)/HBeAg (-) còn gặp trong thể đột biến tiền nhân, đột biến này thường xẩy ra với bệnh nhân được điều trị bằng Interferon Đây không phải là hiện tượng chuyển đảo huyết thanh Cần điều trị kịp thời để phòng bệnh tiến triển nặng, xơ gan, ung thư tế bào gan

1.3.7 HBxAg ( Hepatitis B x Antigen)

HBxAg xuất hiện sớm trong pha nhiễm trùng cấp HBxAg là một protein đa chức năng có tác dụng kích hoạt sự sao chép HBV, điều hòa sự tăng trưởng tế bào

ký chủ và có liên quan chặt chẽ tới cơ chế sinh ung thư tế bào gan [16], [20] Đây là markr cần tiếp tục nghiên cứu làm sáng tỏ

1.3.8 HBV - DNA

Ở pha nhiễm trùng cấp tính, HBV - DNA có thể phát hiện được ước chừng 1 tuần sau khi HBsAg (+) nhưng một số ít trường hợp có thể phát hiện trước khi

dần, đi ngược chiều gia tăng của ALT và thường mất trước khi HBsAg (-) và cùng mất với HBeAg ở những bệnh nhân khỏi Nếu HBV - DNA tồn tại kéo dài trên 8 tuần kể từ khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng đầu tiên, thì nguy cơ báo hiệu bệnh chuyển mạn tính [12]

Ở pha nhiễm trùng mạn tính, người bệnh ở giai đoạn dung nạp miễn dịch có tải lượng virus thường > 107 copies/ml thậm chí đến 1011 copies/ml Bệnh nhân viêm gan virus mạn, HBeAg (+) có tải lượng virus thường ≥ 105 copies/ml, bệnh nhân HBeAg (-) có tải lượng virus >104 copies/ml [34], [35] Bệnh nhân viêm gan virus B có HBsAg (-) (đột biến trốn thoát, viêm gan ác tính) Tải lượng virus là công cụ hữu ích giúp chẩn đoán

Ở người nhiễm HBV nói chung đặc biệt ở phụ nữ có thai Tải lượng virus tiên lượng sự lây nhiễm [72]

1.3.9 cccDNA ( Covalently closed cicular DNA)

Có mặt trong nhân tế bào gan được tách triết từ mẫu bệnh phẩm sinh thiết bằng kỹ thuật PCR cccDNA tồn tại dai dẳng trong nhân tế bào gan và gia tăng do

sự xâm nhập trở lại của các nucleocapside mới và chỉ mất đi do tế bào gan chết tự nhiên hoặc do tế bào Tc gây ra và do vai trò của các cytokine [31], [32] Sự tồn tại của cccDNA phản ánh tình trạng mạn tính của bệnh Hiện nay chưa có thuốc kháng virus nào có thể tác động đến cccDNA Nồng độ cccDNA có mối tương quan thuận với hàm lượng HBsAg huyết thanh Do vậy, HBsAg được xem như một marker có giá trị trong theo dõi và tiên lượng đáp ứng điều trị [32], [55]

Biểu đồ 1.1: Diễn biến huyết thanh học của nhiễm cấp tính HBV và khỏi

( Nguồn từ tư liệu công ty VABIOTECH)

Biểu đồ 1.2: Diễn biến huyết thanh học của nhiễm mạn tính HBV

(Nguồn từ tư liệu công ty VABIOTECH)

1.4 Biến đổi một số chỉ số hóa sinh chức năng gan và HBV - DNA trong các bệnh do HBV gây ra

1.4.1 Viêm gan virus B cấp tính (A cute hepatitis B)

Ước chừng có đến 70% bệnh nhân viêm gan virus B cấp nghèo triệu trứng và không có vàng da, còn vàng da chiếm khoảng 30% [40] Viêm gan virus B cấp có

triệu trứng lâm sàng hiếm gặp ở sơ sinh và chỉ gặp chừng 10% trẻ em ở dưới 4 tuổi [56], [59]

Xét nghiệm cho thấy enzym AST, ALT tăng cao từ 1000 – 2000 U/l, ít nhất cũng trên 5 lần ngưỡng cao của giá trị bình thường Enzym AST, ALT tăng cao nhất

ở thời điểm trước vàng da 3 ngày, sau đó giảm nhanh trở về bình thường trong vòng

4 – 8 tuần [12] Theo dõi chỉ số Bilirubin trực tiếp/ Bilirubin toàn phần, Shiomi S cho rằng nếu chỉ số này > 0,3 thường có tiên lượng nặng [17]

Nồng độ HBsAg cao nhất lúc enzym ALT đạt đỉnh và sau đó giảm và mất đi trong vòng 6 tháng kể từ khi xuất hiện HBeAg (+) và HBV - DNA (+) được phát hiện ngay ở thời kỳ khởi phát và tồn tại suốt trong giai đoạn có triệu trứng HBeAg

và HBV - DNA thường (-) trước khi HBsAg (-) Tải lượng virus tăng cao thường trước khi có triệu trứng lâm sàng và giảm nhanh khi enzym ALT gia tăng IgM – HBcAb (+) xuất hiện trước khi có triệu chứng lâm sàng hoặc 1 – 2 tuần trước khi enzym ALT tăng sau đó giảm dần và mất đi trong vòng 6 tháng và nhường lại cho IgG – HbcAb (+)

1.4.2 Viêm gan virus B mạn tính (Chronic hepatitis B)

Viêm gan virus B mạn là tình trạng viêm và hoại tử gan kéo dài liên tục trên

6 tháng Những bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan virus B mạn khi có HBsAg (+)

> 6 tháng hoặc HBsAg (+) và IgG (-), HBcAg (+), tải lượng virus ≥ 104 copies/ml ( Nhóm bệnh nhân có HBeAg (-)), ≥ 105 copies/ml ( Nhóm bệnh nhân có HBeAg (+) ), enzym ALT tăng cao thường xuyên hay từng đợt Mức độ viêm và hoại tử thì luôn thay đổi từ nhẹ đến nặng, mức độ xơ hóa có giá trị tiên lượng bệnh [60], [61], bệnh nhân HBeAg (+) thường có tổn thương gan mức độ nặng Trong quá trình di chuyển đảo huyết thanh HBeAg hoặc trong trường hợp đột biến HBeAg thường xẩy

ra tình trạng tăng hoạt độ ALT > 10 lần giá trị cao của bình thường, lâm sàng biểu hiện giống viêm gan cấp tính và được gọi là đợt bùng phát của viêm gan B mạn Bệnh nhân HBeAg (-) có tổn thương gan mức độ nhẹ đến vừa, tải lượng virus ≥ 104copies/ml Những bệnh nhân này thường gặp nhiều ở các nước Châu Á – Thái Bình Dương, Châu Âu, Địa Trung Hải [10], [19], [42], [59]

Các xét nghiệm cho thấy hoạt độ enzym ALT tăng thường từ 2 – 5 lần giới hạn trên của bình thường, xuất hiện protein niệu do lắng đọng phức hợp miễn dịch

gây viêm cầu thận Những trường hợp viêm gan bùng phát có ALT tăng trên 10 lần thậm chí trên 20 lần, bilirubin TP máu tăng cao, albumin máu giảm, globulin tăng, tỉ

lệ prothrombin giảm, AFP tăng từ vài chục đến vài trăm ng/ml huyết thanh, AFP có thể tăng đồng thời với enzym ALT hoặc tiếp theo đợt tăng enzym ALT nhưng không kéo dài Những bệnh nhân này phải luôn đề phòng tiến triển nặng thành bệnh

lý gan mất bù [15], [23], [24]

1.4.3 Xơ gan (Chirrhosis of liver )

Theo tổ chức Y tế thế giới (1978), xơ gan là bệnh lý mạn tính ở gan với các tổn thương đặc trưng như: viêm gan mạn tính, mô xơ phát triển lan tràn, cấu trúc gan bị đảo lộn không hồi phục, có nhiều cục tân đạo [2], [21]

Hội chứng suy gan chức năng gan: Xét nghiệm máu giảm cả ba dòng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu Tỉ lệ prothombin < 75%, Cholesterol ester < 65%,protein máu giảm, albumin giảm, tỉ lệ A/G < 1, có thể thấy glucose tăng hoặc giảm, bilirubin máu tăng, ASL, ALT tăng nhẹ và vừa trong đợt tiến triển…

1.4.4 Người mang virus viêm gan B

Người mang HBV không triệu chứng là những người đơn thuần chỉ có xét nghiệm HBsAg (+), không kèm bất cứ triệu chứng lâm sàng, enzym ALT bình thường Người mang HBV mạn thể hiện dưới 3 hình thái:

- Người nhiễm HBV mạn tính giai đoạn dung nạp miễn dịch

- Người mang HBV không hoạt động ( Inactive HBV carrier state)

- Viêm gan B mạn giai đoạn enzym ALT bình thường

Để chẩn đoán phân biệt giữa các hình thái của người mang HBV không triệu chứng Xét nghiệm HBeAg, do tải lượng virus máu và làm mô bệnh học gan là những xét nghiệm bắt buộc

Người mang HBV giai đoạn dung nạp miễn dịch hầu hết xảy ra ở những người nhiễm HBV từ mẹ hoặc < 1 tuổi, những người này thường ở lứa tuổi < 20,xét nghiệm cho thấy HBeAg (+), tải lượng virus tăng rất cao và thường > 107 copies/ml, thậm chí 1011 copies/ml, mô bệnh học gan chỉ ra hình ảnh viêm gan tối thiểu [49] Viêm gan virus B mạn giai đoạn ALT bình thường là những bệnh nhân viêm gan virus B mạn hoàn toàn không có triệu chứng lâm sàng, enzym ALT bình

luôn từ vừa đến nặng [73]

1.5 Vai trò của HBV - DNA

Vai trò hàm lượng HBV - DNA

Theo nghiên cứu của tác giả: U.H Iloejel, H.I Yang, J Sul, C.L Jen Kuo, S.L You, C.J Chen ở đại học Quốc Gia Đài Loan Taipei và của Bristol – Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Wallingford, C.T USA trên 3851 người nhiễm HBV ở đài loan từ 1991 – 1992 với HBV - DNA bằng phương pháp PCR và

xơ gan được chẩn đoán bằng siêu âm và sinh hóa cho thấy: tỷ lệ xơ gan 386,1/100.000 người theo dõi/ năm với HBV <300 copies/ml, 2575,7/100.000 với HBV - DNA 106 copies/ml, (p<0,0001) Nguy cơ xơ gan (RRRadj) với mức HBV - DNA 104 copies/ml là 2,4 và HBV - DNA > 106 copies/ml là 9,3 Có 1.620 người (43%) với HBV - DNA 10.000 copies/ml hay có hơn 289 trường hợp xơ gan Tỷ lệ

xơ gan ngay cả khi HBV không phát hiện được là 386,1/100.000 cho thấy rằng khi không phát hiện được HBV - DNA cũng không loại trừ nguy cơ xơ gan về sau Các tác giả đã kết luận rằng: mức độ của HBV - DNA có tiên đoán mạnh mẽ cho nguy

cơ xơ gan, tỷ lệ xơ gan gia tăng với mức độ HBV - DNA phụ thuộc liều lượng Vì vậy giảm được HBV - DNA mong rằng sẽ giảm được nguy cơ xơ gan ở bệnh nhân viêm gan B mạn

Nghiên cứu hồi cứu ở 3774 người nhiễm virus viêm gan B mạn ở 7 thị trấn của Đài Loan vào giữa năm 1991 – 1992 đến 30 tháng 6 năm 2004 ( cũng của các tác giả trên), các đối tượng được theo dõi về khám lâm sàng, siêu âm bởi các chuyên khoa gan mật cho thấy có 3214 (85%), HBeAg (-) trong đó có 1082 (34%)

có HBV - DNA là 104 copies/ml; 560 (15%) HBeAg (+) trong đó có 538 (96%) có HBV - DNA là 104 copies/ml Có sự liên quan phụ thuộc liều lượng giữa HBV - DNA và nguy cơ xơ gan với HBeAg Với HBV - DNA không phát hiện được ở nhóm có HBeAg (-) , nguy cơ cao nhất cho sự tiến triển đến xơ gan vẫn là ở nhóm HBeAg (+) với mức HBV - DNA > 105 copies/ml Với người có mức HBV - DNA

từ 1 – 9,9 x 101 – 9,9 x 105 và > 1 triệu có tỷ lệ xơ gan tương tự bất kể HBeAg dương tính hay âm tính Như vậy tăng HBV - DNA huyết tương có giá trị tiên đoán mạnh mẽ cho nguy cơ xơ gan ở người nhiễm HBV mạn bất kể HBeAg dương hay

âm tính Hiệu quả của việc giảm HBV - DNA đến mức rất thấp đặc biệt là ở người HBeAg (-) có thể làm giảm tiến trình dẫn đến xơ gan do viêm gan B mạn

Mục tiêu:

Kết quả của đề án chỉ ra mối liên quan giữa nồng độ HBV-DNA với một số chỉ số hóa sinh về chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan B, từ đó gợi ý một số hướng chữa bệnh viêm gan B

Các nội dung nghiên cứu:

- Xác định nồng độ HBV – DNA ở bệnh nhân viêm gan B

- Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ HBV – DNA với một số chỉ số hóa sinh về chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan B

- Giải trình tự gen và xác định loài

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là 150 bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B

- Đối tượng được đưa ra nghiên cứu là 5 mẫu máu của các bệnh nhân (Ký hiệu: 01, 464, 472, 143 và 175) được chẩn đoán mắc viêm gan B tại bệnh viện Đa Khoa Tỉnh Thanh Hóa

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu

- Bệnh nhân có kết quả xét nghiệm HbsAg dương tính

- Bệnh nhân có nồng độ HBV – DNA đạt ngưỡng phát hiện

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân nhiễm kết hợp HCV, HIV hoặc các bệnh gan khác như: Viêm gan nhiễm độc, xơ gan, ung thư gan…

- Bệnh nhân không hợp tác tham gia nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu tiến hành theo phương pháp mô tả cắt ngang

- Phương pháp chọn mẫu: Chọn tất cả các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn đến khám tại Khoa Vi Sinh - Bệnh Viện Đa Khoa - Tỉnh Thanh Hóa

2.2.2 Cách lấy mẫu và bảo quản

- Sử dụng bơm tiêm vô trùng lấy 3-5 ml máu tĩnh mạch, chuyển máu nhẹ nhàng sang tube giữ máu, không chống đông

- Ly tâm mẫu với tốc độ 5000 vòng/phút x 05 phút, sau đó tách huyết tương chuyển vào 02 tube Eppendorf 2ml có nắp khóa

- Các tube mẫu được gán mã số nghiên cứu thống nhất

2.2.3 Các chỉ số nghiên cứu

- Hoạt độ enzyme AST, ALT, GGT trong huyết tương

- Nồng độ Bilirubin Tp, Bilirubin TT, Albumin trong huyết tương

- Nồng độ HBV – DNA trong huyết thanh

- Test nhanh HbeAg

2.2.4 Nguyên lý và kỹ thuật xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

* Kỹ thuật xác định HBV - DNA

Nồng độ virus huyết thanh được xác định bởi kỹ thuật Real time PCR trên máy Real time PCR BIO RAD - Mỹ, theo phương pháp Taqman Kỹ thuật được thực hiện tại phòng Vi sinh và các mầm bệnh Y học – Khoa Vi Sinh - Bệnh Viện

Đa Khoa - Tỉnh Thanh Hóa

* Kỹ thuật Real time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản diễn ra theo

từng chu kỳ nhiệt, được theo dõi trực tiếp Thực chất là 2 quá trình diễn ra đồng thời: Nhân bản DNA bằng phản ứng PCR đồng thời phát sang huỳnh quang trực tiếp ( màu của phẩm nhuộm gắn kết với phân tử DNA) tỉ lệ thuận với số lượng bản sao

* Kỹ thuật Real time PCR theo phương pháp Taqman

+ Thành phần phản ứng:

- Taqman probe là một giai đoạn Oligunucleotide được gắn hiệu có gắn chất huỳnh quang phát sáng ở đầu 5’ (Đầu roporter – R) và gắn chất hấp thụ ánh sáng huỳnh quang phát đầu 3’ (Đầu quenche – Q)

- Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease có nhiệm vụ cắt

bỏ đoạn mồi khi đoạn này bắt cặp lên sợi DNA khuôn và cản đầu 3’, của mồi khi Enzyme kéo dài mồi tổng hợp bổ sung

- Nguyên lý phản ứng: Khi chưa có sản phẩm khuyếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman Probe còn nguyên vẹn, ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ đầu 5’ (R) sẽ bị hấp thụ bởi chất hấp thụ ở đầu 3’ (Q) do vậy cảm biến quang không ghi nhận được Khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại thì Taqman probe bắt cặp với sợi khuôn của sản phẩm này ở nhiệt độ bắt cặp và Enzyme Taq polmerase sẽ cắt bỏ đoạn dò để kéo dài tổng hợp thành sợi bổ sung Do vậy, đầu reporter sẽ cách xa đầu quyenche Khi nguồn phát sáng tác động lên đầu Reporter, chất huỳnh quang sẽ phát sáng sẽ không kịp hấp thụ bởi đầu quenche, cảm biến học sẽ ghi nhận cường

độ ánh sáng để xác định số bản sao theo thời gian thực của phản ứng PCR

+ Chu kỳ và thời gian thực hiện: 40 chu kỳ trong thời gian 7 phút

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng Real time PCR với Taqman Probe

* Kỹ thuật tách và tinh sạch DNA từ huyết thanh:

+ Nguyên tắc chung:

Màng virion được phá vỡ bằng các chất tẩy rửa mạnh, DNA trong tế bào được giải phóng cùng với các protein Sau đó, DNA được tinh sạch nhờ protease K

+ Cách tiến hành:

1 Đánh dấu các tube 1.5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu

2 Cho 200µl mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900µl dung dịch pED1, vortex 30s, để yên 10 phút Thêm vào 200µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube phải chuyển thành màu trắng đục Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

3 Thu 600µl dịch nổi có chứa DNA vào 1 tube vô trùng có sẵn 600µl dung dịch pEX3 Trộn đều, để yên 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

4 Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (hoặc hồng) Cho từ từ 900µl dung dịch EX4 vào Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

5 Loại bỏ dịch nổi, thu cặn Để khô ở 60oC trong 10 - 15 phút Cho vào 50µl dung dịch ED5 Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan hoàn toàn

6 Thu DNA trong ống bảo quản ở - 22o C

+ Thành phần mix phản ứng Real time PCR:

+ Chu kỳ phản ứng nhiệt như sau:

Program 1: 500 x 1 phút →

Program 2: 940 x 2 phút →

Program 3: (940 x 05 giây → 600 x 30 giây) 40cycler →

+ Đánh giá kết quả: Chia làm 2 nhóm [53],[64]:

- Nhóm dưới ngưỡng phát hiện của kỹ thuật: Nồng độ virus < 300 copies/ml

- Nhóm xác định được nồng độ virus : Nồng độ virus ≥ 300 copies/ml

* Test nhanh xác định HbeAg

Kỹ thuật sử dụng test của hãng ACON – Mỹ Kỹ thuật được thực hiện tại phòng Vi sinh và các mầm bệnh y học – Khoa Vi Sinh - Bệnh Viện Đa Khoa - Tỉnh Thanh Hóa

Nguyên lý hoạt động:

Kit thử chuẩn đoán Viêm gan B (HbeAg) là dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch, pha rắn, kiểu “bánh sandwich” hai lớp, định tính phát hiện sự có mặt của HbeAg trong huyết thanh

Màng được phủ lót trước một lớp kháng thể anti – Hbe tại vùng hiển thị kết quả Trong quá trình làm xét nghiệp, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản ứng với các phần tử mang kháng thể anti – Hbe Hỗn hợp tiếp tục thấm lên trên nhờ các mao dẫn về phía lớp màng, gặp và phản ứng với kháng thể anti – HbeAg tại đây tạo

ra vạch màu ở vùng kết quả của kit thử Sự xuất hiện vạch màu này cho biết kết quả dương tính, ngược lại nếu không xuất hiện vạch màu kết quả sẽ âm tính

Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn

luôn xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng) để thông báo rằng lượng mẫu đã

đủ và lớp màng đã thấm tốt

Dương tính: Xuất hiện hai vạch đỏ rõ rệt, một ở vùng chứng gọi là vạch

chứng (C) còn vạch kia ở vùng kết quả gọi là vạch kết quả (T)

Lưu ý: Độ đậm mầu đỏ của vạch kết quả (T) có thể sẽ khác nhau Tuy nhiên bất cứ độ mờ nào ở vạch kết quả (T) cũng được coi là dương tính

Âm tính: Xuất hiện chỉ một vạch chứng (C) Không thấy xuất hiện vạch kết

quả (T) dù đậm hay mờ

Kết quả không có giá trị: Không thấy xuất hiện vạch chứng (C) Nguyên nhân

thường gặp là do lượng mẫu phẩm không đủ hoặc thao tác xét nghiệm sai

* Phương pháp xác định chỉ số hóa sinh

Phát hiện về sự thay đổi về hàm lượng, hoạt độ một số chất tồn tại trong máu

so với hằng số người bình thường

AST, ALT, GGT tiến hành trên máy phân tích hóa sinh tự động Sysmex Chemix 180, Đức sản xuất tại phòng xét nghiệm máu – Khoa Hóa Sinh - Bệnh Viện

Đa Khoa - Tỉnh Thanh Hóa

Hóa chất của hãng Erba – Đức

+ Xác định hoạt độ GOT, GPT

- Nguyên lý: Hoạt độ GOT, GPT được xác định bằng phương pháp động học theo khuyến cáo của hội hóa học lâm sàng quốc tế ( Ifcc –Internation fedenration of clinical chemistry)

L-aspartat + α- cetoglytarat oxaloacetat + L-glutamat

Oxaloacetat + NADH + H+ L-malat + NAD+

MDH = malatdehydrogenase

L – alanin + α – cetoglutarat Pyruvat + L-glutamat

Pyruvat + NADH + H+ L – lactat + NAD+

NADH 0,001 mmol/l

• Để xác định hoạt độ GPT:

Thuốc thử 1 bao gồm: Đệm tris 150 mmol/l, ph =7,5

L-analin750 mmol/l LDH ≥ 8 u/l

Thuốc thử 2 bao gồm: α – cetoglutarat 90 mmol/l

1 – 3 tuổi <56 u/l < 39 u/l

4 – 6 tuổi < 36 u/l <29 u/l

7 – 12 tuổi <50 u/l < 39 u/l

13 – 17 tuổi nam < 35 u/l <23 u/l

13 – 17 tuổi nữ <27 u/l <26 u/l

+ Xác định hoạt độ GGT

L – γ – glutamyl – 3 – caboxy – 4 nitroaniline + glycylglycine L – γ – glutamyl + glycylglycine + 5-amino – 2 – nitrobenzoat

- Thuốc thử

• Thuốc thử 1: (Đã pha sẵn): Đệm trí 100 mmol/l , ph =8,25

• Glycylglycine 100 mmol/l

• Thuốc thử 2: (Đã pha sẵn)

L – γ – glutamyl – 3 – caboxy – 4 nitroanilin: 2,9 mmol/l

+ Định lượng Bilirubin toàn phần và bilirubin trực tiếp

- Nguyên lý: bilirubin toàn phần phản ứng với muối diazo 2-4 diclorophenyl đã được làm bền tạo thành phức hợp màu đỏ diazo Đậm độ màu tỉ lệ với nồng độ bilirubin , đo ở bước song 570 nm Dùng chất tẩy để giải phóng bilirubin tự do

- Mẫu thử: Dùng huyết thanh tươi, trong vòng 1 giờ sau khi lấy máu

- Trị số tham khảo : Bilirubin TP

- Thuốc thử:

Bromocresol green 0,26 mmol/l; Đệm citrate pH= 4,2 30 mmol/l, Albumin chuẩn: 5g/dl; Trị số tham khảo:35 - 52 g/dl