Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ folat, homocystein huyết thanh và một số đa hình gen MTHFR ở phụ nữ có bất thường sinh sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRỊNH THỊ QUẾ NGHI£N CøU MốI LIÊN QUAN GIữA NồNG Độ FOLAT, HOMOCYSTEIN HUYếT THANH Và MộT Số ĐA HìNH GEN MTHFR PHụ Nữ Có BấT THƯờNG SINH SảN LUN N TIN S Y HỌC HÀ NỘI – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRỊNH THỊ QUẾ NGHI£N CøU MèI LI£N QUAN GI÷A NåNG Độ FOLAT, HOMOCYSTEIN HUYếT THANH Và MộT Số ĐA HìNH GEN MTHFR PHụ Nữ Có BấT THƯờNG SINH SảN Chuyên ngành : Hóa sinh Y học Mã số: 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn TS Đoàn Thị Kim Phượng HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, trước hết, tơi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới GS TS Tạ Thành Văn, Chủ tịch Hội đồng Trường, Trưởng Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội TS BS Đồn Thị Kim Phượng, Phó chủ nhiệm Bộ mơn Y sinh học - Di truyền, PGĐ Trung tâm Di truyền lâm sàng hệ gen, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy tận tụy giúp đỡ, động viên hướng dẫn tơi q trình học tập, nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại Học, tồn thể q Thầy Cơ, cán Bộ mơn Hóa Sinh, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Thầy Cơ, bác sỹ nội trú Bộ môn Y sinh học – Di Truyền, Trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ tơi việc thu thập phân tích mẫu mơn Đồng thời, tơi bày tỏ lịng biết ơn đến Ban Giám Đốc, cán Trung tâm xét nghiệm Bệnh viện đa khoa MEDLATEC hỗ trợ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến đối tượng tham gia nghiên cứu gia đình họ giúp tơi có số liệu luận án Cuối cùng, xin ghi nhớ cơng ơn sinh thành, ni dưỡng tình u thương bố mẹ ủng hộ, động viên chồng, hai anh chị em gia đình, người ln bên tơi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Trịnh Thị Quế LỜI CAM ĐOAN Tôi Trịnh Thị Quế, nghiên cứu sinh Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh Y học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn GS.TS Tạ Thành Văn TS Đồn Thị Kim Phượng Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Trịnh Thị Quế DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt APC AUC BAC BM BTSS CI CMIA Cs CV FAD Hb Hct Hcy IgF1 Lox1 MCH MCHC MCP1 MCV MTHFR NCBI NNC NPV OR PKC PPV ROC RPL SD SNP SPC TCYTTG TGF TNF TPO-Ab TPR VCAM Vascular Adhesion Molecule Cell Cell Phân tử kết dính tế bào mạch máu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bất thường sinh sản 1.1.1 Vô sinh 1.1.2 Các bất thường thai sản 1.1.3 Nguyên nhân bất thường sinh sản 1.1.4 Cơ chế liên quan đến bất thường sinh sản 12 1.2 Vai trò homocystein, folat đa hình gen MTHFR 16 1.2.1 Vai trò homocystein 16 1.2.2 Vai trò folat .22 1.2.3 Đa hình gen MTHFR 26 1.3 Các phương pháp định lượng nồng độ homocystein, folat xác định đa hình gen MTHFR 30 1.3.1 Các phương pháp định lượng nồng độ Hcy 30 1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm folat .32 1.3.3 Các phương pháp phát đa hình gen MTHFR 33 1.4 Các nghiên cứu mối liên quan homocystein, folat đa hình gen MTHFR .35 1.4.1 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ homocystein, folat huyết đa hình gen MTHFR người khỏe mạnh 35 1.4.2 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ Hcy, folat đa hình gen MTHFR phụ nữ có bất thường sinh sản 36 1.4.3 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ Hcy, folat huyết đa hình gen MTHFR số bệnh lý khác 38 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu 40 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 40 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 41 2.2 Phương pháp nghiên cứu 41 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 41 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu .41 2.3 Thu thập mẫu biến số nghiên cứu 44 2.3.1 Các bước tiến hành 44 2.3.2 Biến số nghiên cứu 45 2.4 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 46 2.4.1 Trang thiết bị, dụng cụ 46 2.4.2 Hóa chất 46 2.5 Quy trình kỹ thuật .47 2.5.1 Quy trình xét nghiệm Hcy, folat 47 2.5.2 Kiểm soát chất lượng báo cáo kết .48 2.5.3 Phát đa hình gen MTHFR .49 2.6 Xử lý phân tích số liệu 52 2.6.1 Xử lý số liệu 52 2.6.2 Xây dựng ngưỡng cắt tối ưu cho chẩn đoán tăng nồng độ homocystein folat huyết 52 2.7 Xây dựng mơ hình tiên lượng .53 2.8 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 53 2.9 Các biện pháp tránh sai số 54 2.10 Sơ đồ nghiên cứu 54 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu 56 3.2 Nồng độ homocystein, folat huyết đa hình gen MTHFR .57 3.2.1 Nồng độ homocystein folat huyết nhóm nghiên cứu 57 3.2.2 Đánh giá đa hình gen MTHFR 57 3.2.3 Đa hình gen MTHFR đối tượng nghiên cứu 65 3.3 Mối tương quan nồng độ Hcy folat huyết theo đa hình gen MTHFR .71 3.3.1 So sánh nồng độ Hcy theo đa hình gen MTHFR 71 3.3.2 So sánh nồng độ folat theo đa hình gen MTHFR 72 3.3.3 Mối tương quan nồng độ Hcy folat với tổ hợp đa hình vị trí C677T A1298C gen MTHFR 72 3.3.4 Mối tương quan nồng độ Hcy folat huyết 74 3.3.5 Đánh giá mơ hình nghiên cứu .75 Chương 4: BÀN LUẬN .88 4.1 Nồng độ folat, homocystein huyết bệnh nhân có tiền sử thai chết lưu tái diễn 90 4.2 Sự liên quan nồng độ folat, homocystein huyết đa hình gen MTHFR bệnh nhân có tiền sử thai chết lưu tái diễn 113 KHUYẾN NGHỊ 126 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 127 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .128 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Quy định thai chết lưu số nước Bảng 2.1: Hằng số C liên quan đến sai sót loại I II .42 Bảng 2.2: Ước tính cỡ mẫu theo đa hình gen liên quan đến thai chết lưu tái phát theo mức sai sót loại I II .42 Bảng 2.3: Ước tính cỡ mẫu theo biến thiên homocystein liên quan đến sẩy thai và/hoặc thai chết lưu tương ứng với mức sai sót loại I II 43 Bảng 2.4 Kết tính cỡ mẫu tương ứng cho nhóm với mức α, β 43 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng 49 Bảng 2.6 Chu kì nhiệt phản ứng realtime PCR 49 Bảng 2.7 Trình tự mồi phản ứng sequencing 51 Bảng 2.8 Chu kì nhiệt sequencing 51 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi nhóm nghiên cứu 56 Bảng 3.2 So sánh nồng độ Hcy folat huyết theo tuổi .56 Bảng 3.3 So sánh kết Hcy folat nhóm bệnh nhóm chứng 57 Bảng 3.4 Tỷ lệ xuất alen C T vị trí 677 65 Bảng 3.5 Phân bố kiểu gen MTHFR C677T nhóm nghiên cứu 65 Bảng 3.6 Nguy thai chết lưu tái diễn theo đa hình gen MTHFR vị trí 677 66 Bảng 3.7 Tỷ lệ xuất alen C vị trí 1298 68 Bảng 3.8 Phân bố kiểu gen MTHFR A1298C nhóm nghiên cứu 68 Bảng 3.9 Nguy có bệnh theo đa hình MTHFR vị trí 1298 69 Bảng 3.10 Ảnh hưởng đa hình gen kết hợp vị trí đa hình gen MTHFR 70 Bảng 3.11 Nồng độ Hcy (μmol/L) theo đa hình gen MTHFR 71 Bảng 3.12 Nồng độ folat (ng/mL) theo đa hình gen MTHFR 72 Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm: - Xét nghiệm thực huyết thanh/ huyết tương - Lấy ml máu tĩnh mạch vào ống khơng có chất chống đơng hay ống có chất chống đơng chống đơng Li-heparin, K2-EDTA K3-EDTA Có thể sử dụng ống huyết tương chống đông chứa gel tách Mẫu không vỡ hồng cầu - Huyết thanh, huyết tương hay máu toàn phần người để xét nghiệm folate phải bảo quản tránh ánh sáng - Mẫu huyết thanh/huyết tương ổn định: ngày 2-8°C, 30 ngày -10°C lạnh Tránh đông lạnh/rã đông lần Tiến hành phân tích mẫu Trách nhiệm Kỹ thuật viên Kỹ thuật viên Kỹ thuật viên Kỹ thuật viên Kỹ thuật viên Cán phụ trách chuyên môn Kỹ thuật viên X Diễn giải báo cáo kết Báo cáo kết a - Tính tốn kết quả: Máy xét nghiệm Abbott tự động tính tốn nồng độ Folate mẫu Kết thực xét nghiệm máy tự động lưu vào phần mềm quản lý bệnh viện b Khoảng báo cáo: 1.5 ng/mL - 40,0 ng/mL Mẫu với nồng độ folate huyết hay huyết tương lớn 20,0 ng/mL cảnh báo với mã “>20,0” pha lỗng tự động với hệ số 1:2 c Thuật ngữ sử dụng cho kết quả: Tăng, giảm d Khoảng đo: 1,5 ng/mL - 20,0 ng/mL e Khoảng tham chiếu sinh học: 3.1 – 20.5 ng/mL Biện luận kết  Nồng độ Folate máu thấp gặp: - Do thiếu hụt dinh dưỡng bệnh dày ruột, sử dụng không đủ thiếu hụt enzym hay liệu pháp đối kháng folate - Thuốc cồn uống thuốc ngừa thai - Nhu cầu folate mức, trình mang thai - Thiếu máu nguyên hồng cầu khổng lồ  Nồng độ Folate máu cao gặp: - Thiếu hụt Vitamin B12 XI Lưu ý (cảnh báo) Các yếu tố ảnh hưởng đến kết xét nghiệm - Mẫu xét nghiệm folate nên giữ tránh ánh sáng Ánh sáng làm nhanh q trình thối biến folate - Mẫu huyết huyết tương từ mẫu bệnh nhân bị ghép hư hay suy thận (kể bệnh nhân chạy thận) cho nồng độ giá trị folate giảm giả Nguồn biến đổi tiềm ẩn: - Các mẫu xét nghiệm lấy từ bệnh nhân nhận chế phẩm từ kháng thể đơn dòng chuột cho chẩn đốn điều trị chứa kháng thể kháng chuột người (HAMA).Những mẫu cho giá trị thay đổi tăng giảm giả xét nghiệm với xét nghiệm ARCHITECT Folate có sử dụng kháng thể đơn dịng chuột - Kháng thể dị hình huyết người phản ứng với immunoglobulins thuốc thử, gây nhiễu với xét nghiệm miễn dịch in vitro Bệnh nhân thường phơi nhiễm với động vật hay sản phẩm huyết động vật dễ gây nhiễu cho kết bất thường - Mẫu huyết hay huyết tương chứa tế bào hồng cầu làm nồng độ folate tăng giả - Methotrexate, aminopterin, folinic acid (Leucovorin) tác nhân hóa học cho điều trị có cấu trúc phân tử tương tự folate Những tác nhân có phản ứng chéo với protein gắn với folate xét nghiệm folate - Kết phân tích lưu trữ online mạng LIS XIII Tài liệu liên quan: - Quy trình: MED.QTQL.25, MED.QTQL.34, MED.QTQL.35 Hướng dẫn: MED.HD.STAT, MED.HD.05, MED.HD.06, MED.HD.07, MED.HD.08, MED.HD.HS.15 - Biểu mẫu: MED.BMQL.27.04 Sổ sách: + Sổ lưu quy trình xét nghiệm Hóa sinh, Miễn dịch + Sổ lưu hướng dẫn sử dụng máy Hóa sinh, Miễn dịch XIV Tài liệu tham khảo - Tài liệu hướng dẫn sử dụng máy Architect - Tài liệu hướng dẫn sử dụng thuốc thử Folate Abbott Architect - Các xét nghiệm thường quy áp dụng thực hành lâm sàng - NXB Y học (2013) PHỤ LỤC Danh sách mẫu phân tích đối chứng hai phương pháp realtime PCR giải trình tự gen MTHFR Mã ĐTC10 ĐTC12 ĐTC14 ĐTC16 ĐTC18 ĐTC20 ĐTC22 ĐTC24 ĐTC26 ĐTC28 ĐTB56 ĐTB58 ĐTB60 ĐTB62 ĐTB64 ĐTB66 ĐTB68 ĐTB70 ĐTB72 ĐTB74 PHỤ LỤC Đánh giá ngưỡng cắt nồng độ homocystein huyết với dự đoán nguy thai chết lưu tái diễn ID Cutoff 2.59 3.92 4.03 4.31 4.74 4.95 5.1 5.3 10 5.43 11 5.48 12 5.53 13 5.59 14 5.63 15 5.65 16 5.68 17 5.73 18 5.83 19 5.95 20 6.01 21 6.04 22 6.06 23 6.07 24 6.09 25 6.15 26 6.2 27 6.22 28 6.25 29 6.27 30 6.32 31 6.43 32 6.51 33 6.55 34 6.59 35 6.62 36 6.69 37 6.76 38 6.78 39 6.8 40 6.84 41 6.88 42 6.9 43 6.92 44 6.95 45 6.99 46 7.05 47 7.1 48 7.11 49 7.13 50 7.14 51 7.16 52 7.19 53 7.2 54 7.22 55 7.25 56 7.28 57 7.3 58 7.31 59 7.33 60 7.35 61 7.37 62 7.42 63 7.47 64 7.48 65 7.5 66 7.52 67 7.53 68 7.56 69 7.59 70 7.61 71 7.64 72 7.65 73 7.66 74 7.67 75 7.68 76 7.71 77 7.75 78 7.77 79 7.79 80 7.82 81 7.83 82 7.85 83 7.9 84 7.95 85 7.96 86 7.98 87 8.02 88 8.05 89 8.06 90 8.08 91 8.11 92 8.14 93 8.17 94 8.21 95 8.24 96 8.26 97 8.28 98 8.3 99 8.32 100 8.34 101 8.37 102 8.39 103 8.41 104 8.42 105 8.44 106 8.47 107 8.49 108 8.51 109 8.53 110 8.54 111 8.57 112 8.6 113 8.63 114 8.67 115 8.69 116 8.71 117 8.81 118 8.91 119 8.95 120 8.97 121 8.98 122 123 9.02 124 9.03 125 9.05 126 9.07 127 9.09 128 9.13 129 9.17 130 9.21 131 9.28 132 9.34 133 9.37 134 9.42 135 9.47 136 9.51 137 9.6 138 9.66 139 9.68 140 9.77 141 9.85 142 9.91 143 9.98 144 10.02 145 10.09 146 10.14 147 10.16 148 10.19 149 10.22 150 10.29 151 10.39 152 10.45 153 10.48 154 10.52 155 10.56 156 10.62 157 10.67 158 10.71 159 10.73 160 10.75 161 10.81 162 10.9 163 10.95 164 10.98 165 11.07 166 11.17 167 11.19 168 11.35 169 11.51 170 11.62 171 11.75 172 11.79 173 11.84 174 11.95 175 12.16 176 12.3 177 12.34 178 12.37 179 12.4 180 12.43 181 12.49 182 12.53 183 12.58 184 12.65 185 12.67 186 12.68 187 12.73 188 12.82 189 12.91 190 13.01 191 13.08 192 13.15 193 13.38 194 13.56 195 13.58 196 13.85 197 14.37 198 14.66 199 14.87 200 15.63 201 16.29 202 16.44 203 16.54 204 16.68 205 16.85 206 16.96 207 17.55 208 18.31 209 18.68 210 19.09 211 19.5 212 20.07 213 21.22 214 22.32 215 22.8 216 23.27 217 23.94 218 27.85 219 35.48 220 43.97 221 Inf ... 1.4.2 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ Hcy, folat đa hình gen MTHFR phụ nữ có bất thường sinh sản 36 1.4.3 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ Hcy, folat huyết đa hình gen MTHFR số bệnh... phát đa hình gen MTHFR 33 1.4 Các nghiên cứu mối liên quan homocystein, folat đa hình gen MTHFR .35 1.4.1 Các nghiên cứu mối liên quan nồng độ homocystein, folat huyết đa hình gen MTHFR. .. TRỊNH THỊ QUẾ NGHI£N CứU MốI LIÊN QUAN GIữA NồNG Độ FOLAT, HOMOCYSTEIN HUYếT THANH Và MộT Số ĐA HìNH GEN MTHFR PHụ Nữ Có BấT THƯờNG SINH SảN Chuyờn ngnh : Húa sinh Y học Mã số: 62720112 LUẬN ÁN