Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (oryza sativa l )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG KIM OANH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ CÂY LÚA (Oryza sativa L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƯƠNG KIM OANH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ CÂY LÚA (Oryza sativa L.) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tiến Dũng Thái Nguyên – 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng tơi nhóm nghiên cứu hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Tiến Dũng Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019 Học viên Trương Kim Oanh Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Tiến Dũng tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi suốt q trình nghiên cứu thực luận văn Tơi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên thầy cô giáo trường giảng dạy tạo điều kiện cho học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn đến thầy giáo khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm truyền dạy kiến thức kỹ cho tơi suốt q trình học tập trường, tạo điều kiện thuận lợi để thực tốt đề tài nghiên cứu Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp tập thể lớp Cơng nghệ sinh học K25, nhóm sinh viên phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, người sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập hồn thành đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019 Học viên Trương Kim Oanh Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa luận văn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò lúa 1.2.Tổng quan promoter 1.2.1 Khái niệm promoter 1.2.2 Phân loại promoter 1.2.3 Điều hòa gene sinh vật nhân chuẩn 1.2.4 Ứng dụng promoter công nghệ gene thực vật 13 1.2.5 Vai trò yếu tố điều hòa Cis 15 1.3 Vai trò hạt phấn nghiên cứu chọn tạo giống trồng thích ứng với biến đổi khí hậu 16 1.4 Phương pháp chuyển gene thực vật qua Agrobacterium 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 21 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 21 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 21 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 21 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 21 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.3.2 Hóa chất 22 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv 2.3.3 Thiết bị thí nghiệm 23 2.4 Nội dung nghiên cứu 23 2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn 23 2.4.2 Nội dung 2: Tách dòng promoter chuyên biệt hạt phấn thiết kế vector chuyển gene 23 2.4.3 Nội dung 3: Đánh giá hoạt động promoter mơ hình Arabidopsis 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn 23 2.5.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 24 2.5.3 Phương pháp khuyếch đại DNA tổng số kỹ thuật PCR 25 2.5.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 26 2.5.5 Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter 26 2.5.6 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 27 2.5.7 Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp 27 2.5.8 Phương pháp tách chiết plasmid 28 2.5.9 Phương pháp định lượng DNA 29 2.5.10 Phương pháp xác định trình tự 30 2.5.11 Thiết kế vector biểu GUS 30 2.5.12 Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium 31 2.5.13 Phương pháp chuyển gene Arabidopsis 32 2.5.14 Phương pháp đánh giá hoạt động promoter 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa 34 3.2 Tách dòng thiết kế vector 36 3.3 Kết nghiên cứu chuyển gene phân tích biểu gen GUS 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 43 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ CaMV Cauliflower mosaic virus ARN pol RNA polymerases TF Transcription factor TBP TATA box binding protein CRE Cis regulatory element IME Intron mediate enhancement ARF Auxin response factors Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi 16 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.3 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 28 Bảng 3.1 Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa vùng promoter tương ứng nghiên cứu 35 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái hoa hạt phấn Arabidopsis điều kiện stress nhiệt độ cao 18 Hình 2.1 Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene vector tách dịng .27 Hình 2.2 Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR 31 Hình 3.1 Bản đồ nhiệt thể mức độ biểu gene RMP hạt phấn 36 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc gel agarose 1% để sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 vector chuyển gene pKGWFS7 38 Hình 3.3 Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP 38 Hình 3.4 Kết phân tích chuyển gene PCR với cặp mồi GUSF/GUS-R 39 Hình 3.5 Biểu gene GUS cụm hoa chuyển gene 41 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 41 Phân tích biểu gene GUS cụm hoa cho thấy mức độ biểu khác chuyển gene RMP1 RMP2 Gene GUS biểu mạnh tất giai đoạn phát triển hạt phấn điều khiển promoter RMP1 (Hình 3.5) Ở chuyển gene RMP2 mức độ biểu gene GUS yếu (Hình 3.5) Đồng thời đối chứng khơng chuyển gen hạt phấn khơng biểu màu xanh đặc trưng khơng có gen thị RMP1 ::GFP/GUS RMP2 ::GFP/GUS Mặt khác phận khác lá, thân chuyển gen không biểu màu xanh gen thị GUS hạt phấn Kết phân tích biểu gene GUS cụm hoa chuyển gene hoàn tồn phù hợp với kết phân tích biểu gene RMP1 RMP2 dựa sở liệu heat-map (Hình 3.1) Điều khẳng định promoter RMP1 RMP2 hoạt động chuyên biệt hạt phấn Đ/c khơng chuyển gen RMP1 RMP2 Hình 3.5 Biểu gene GUS cụm hoa chuyển gene Ghi : Màu xanh (mũi tên) biểu gene GUS Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu kết luận : - Đã sàng lọc 10 gene có biểu chuyên biệt hạt phấn lúa dựa đồ nhiệt heat-map, ký hiệu RMP1 đến RMP10 - Tách dịng thiết kế thành cơng vector chuyển gene mang promoter RMP1 RMP2 có kích thước 1343 bp 734 bp, ký hiệu pKG7-RMP1 :: GFP/GUS pKG7-RMP2 :: GFP/GUS - Chuyển thành công vector chuyển gene vào Arabidopsis để đánh giá hoạt động promoter Phân tích 14 chuyển gene PCR cho kết dương tính với gene GUS Phân tích biểu gene GUS Cả hai promoter hoạt động hạt phấn chuyển gene RMP1 RMP2 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu đánh giá toàn diện khả hoạt động promoter RMP1 RMP2 lúa mở rộng đối tượng trồng khác trước đưa vào ứng dụng điều khiển gene mục tiêu Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gene Việt Nam Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học Công nghệ, Hà Nội Bộ Nông nghiệp PTNT (2014), Báo cáo kết thực kế hoạch tháng 12 năm 2014 ngành Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Trung tâm tin học thống kê, Hà Nội Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2015), “Vai trò yếu tố điều hòa Cis đáp ứng thực vật với điều kiện bất lợi” , Báo tạp chí sinh học, 37(3), tr 370-383 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter ứng dụng cơng nghệ gen thực vật”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 5(1), tr.118 Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gene thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Võ Thị Thương Lan (2011), Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB Giáo Dục Việt Nam Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Duy Thành, Tạ Đoàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Di truyền học , NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Thúy Quỳnh , Nguyễn Huy Hoàng , Hao Jen Hoang (2016) ‚“Nghiên cứu hoạt động promoter LRR-RLK VIII điều khiển tính chống chịu arsenic mơ hình Arabidopsis”, tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(3), tr 499-505 10 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 44 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 12 Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., Tasaka M (1997), “Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant, Plant Cell, 9, pp 841 - 857 13 Bae HK, Kang HG, Kim GJ, Eu HJ, Oh SA, Song JT, Chung IK, Eun MY, Park SK (2010), “Transgeneic rice plants carrying RNA interference constructs of AOS (allene oxide synthase) genes show severe male sterility”, Plant Breed , 129, pp 647 – 651 14 Benfey P N., Chua N H (1990), “ The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants”, Science, 250(4983), pp 959966 15 Bevan M., Walsh S (2005), “The Arabidopsis Genome: a foundation for plant research”, Genome Reseearch, 15(12), pp 1632 -1642 16 Chang F., Gu Y., Ma H., Yang Z (2013), “ AtPRK2 promotes ROP1 activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth”, Mol Plant, 6, pp 1187-1201 17 Christensen A.H & Quail P.H (1996), “ Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants”, Transgenic Research, 5, pp 213 - 218 18 Conkling M A., C L Cheng, Y T Yamamoto and H M Goodman (1990), “ Isolation of transcriptionally regulated tobacco”, Plant Physiology, 93(3), pp 1203 -1211 19 Clough (1998), “ Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana ”, lant J., 16(6), pp 735 - 743 20 Darshi M.,Trinh K., Murphy A., Taylor S (2012), “Targeting and import mechanism of coiled-coil helix Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN coiled-coil http://lrc.tnu.edu.vn 45 helix domain-containing protein (ChChd3) into the mitochondrial intermembrane space”, J Biol Chem, 287, pp 39480-39491 21 Davis D L., Nielsen M T (1999), Tobaco Production, Chemistry and technology B Blackwell Science, 467 22 Dionisio G., Madsen C K., Holm P B., Welinder K G., Jorgenesen M., Stoger E., Arcalis E., Brinch – Pedersen H (2011), “Cloning and characterization of purple acid phosphatase phytases from wheat (Triticum aestivum L.), barley(Hordeum vulgage L.), maize (Zea maize L.) and rice (Oryza sativa L.)”, Plant Physiol, 156, pp 1087-1100 23 Ditt R F., Nester E W and Comai L (2005), “ The plant cell defense andAgrobacterium tumefaciens” , FEMS Microbiology letters, 247, pp 207-213 24 Gelvin S B (2003), “Agrobacterium - mediated plant transformation t he biology behind the “Gene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp 16 - 37 25 Grierson C S., Barnes S R., Chase M W., Clarke M., Grierson D., Edwards K J., Jellis G J., Jones D J., Knapp S., OldroydG., Poppy G., Temple P., Williams R., and Bastow R., (2011), “One hundred important questions facing plant science research”, New Phytologist, 192, pp –12 26.Grover A., Twell D & Schleiff E (2016) Pollen as a target of environmental changes, Plant Reprod, 29, https://doi.org/10.1007/s00497-016-0285-7 27 Hays J B (2002), “Arabidopsis thaliana, a versatile model system for study of eukaryotic genome-maintenance functions”, DNA repair , 1(8), pp 579- 600 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 46 28 Ho M W., A Ryan and J Cummins (1999), “ Cauliflower mosaic viral promoter-a recipe for disaster?”, Microbial Ecology in Health and Disease, 11(4), pp 194-197 29 Honys D., Oh S A., Renak D., Donders M., Solcova B., Johnson J A., Boudova R., Twell D (2006), “ Identification of microspore-active promotes that allow targeted manipulation of gene expression at early stages of microgametogenesis in Arabidospsis” , BMC Plant Biol, 6, pp 31 30 Hohn T., Futterer J (1992), Transcriptional and translational control of gene expression in cauliflower mosaic virus”, Current opinion in genetics & development, 2(1), pp 90 - 96 31 Huang J W, J T Chen, W P Yu, L F Shyur, A Y Wang, H Y Sung and J C Su (1996), “ Complete structures of three rice sucrose synthase isogenes and differential regulation of their expressions”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60(2), pp 233-239 32 Huraba P., Honys D., Twell D., Capková V., Tupý J (2005), “Expression of beta-galactosidase and beta-xylosidase 332 during microspore and pollen development” , genes Planta , 220, pp 931-940 33 Jefferson R (1987) GUS: Histochemical Staining with X-Gluc, http://stockingerlab.osu.edu, ngày 26/11/2001 34 Liu L., Y Zhou, M W Szczerba, X Li and Y Lin (2010), “Identification and application of a rice senescence-associated promoter”, Plant physiology, 153(3), pp 1239 -1249 35 Nakashima K., Tran L.S., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y., Hayashi N Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki K (2007), “Functional analysis of a NAC – type transcription factor Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 47 OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress – responsive gene expression in rice”, Plant J, 1(4), pp 617-630 36 Noad R J., D S Turner and S N Covey (1997), “ Expression of functional elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic acids research, 25(6), pp 1123 – 1129 37 Noir S., Brautigam A., Colby T., Schmidt J., Panstruga R (2005), “A reference map of the Arabidospsis thaliana mature pollen proteome”, Biochem Biophys Res Commun, 337, pp 1257-1266 38 Paupiere M J., van Heusden A W., Bovy A G (2014), “The metabolic basis of pollen thermo-tolerance: perspectives for breeding”, Metabolites, 4, pp 889-920 39 Safadi F., Reddy V S., Reddy A S (2000), “A pollen-specific novel calmodulinbinding protein with tetratricopeptide repeats”, J Biol Chem, 275, pp 35457-35470 40 Swapna L., Khurana R., Kumar S.V., Tyagi A.K., Rao K.V (2011), “Pollen – specific expression of Oryza sativa indica pollen allergene gene (OSIPA) promoter in rice and Arabidospsis transgenneic systems”, Mol Biotechnol, 48 49-50, 10.1007/s 12033-010-9347-5 41 Tan H., Liang W., Hu J., Zhang D (2012), “ MTR1 encodes a secretory fasciclin glycoprotein required for male reproductive development in rice”, Dev Cell, 22, pp 1127-37 42 Tan C M., Chen R J , Zhang J H., Gao X L., Li L H., Wang P R., Deng X J., Xu Z J (2013), “ OsPOP5, a prolyl oligopeptidase family gene from rice confers abiotic stress tolerance in Escherichia coli”, Int J Mol Sci , 14, pp 20204-20219 43.Tanthanuch W., Chantarangsee M., Maneesan J., Ketudat-Cairns J (2008), “ Genomic and expression analysis of glycosyl hydrolase Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 48 family 35 genes from rice (Oryza sativa L.)”, BMC Plant Biol, 8, pp 84 44 The Arabidopsis Genome Initiative (2000), “Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana”, Nature, 408, pp 796 - 815 45 Tripathi L., Sowdhamini R (2006), “ Cross geneome comparisons of serine proteases in Arabidospsis and rice, BMC Geneomics, 7, pp 200 46 Turner D S., D G McCallum and S N Covey (1996), “ Roles of the 35S promoter and multiple overtapping domains in the pathogenicity of the pararetrovirus cauliflower mosaic virus”, Journal of virology, 70(8), 4514 47 Yin Y., L Chen and R Beachy (1997), “ Promoter elements required for phloem- specific gene expression from the RTBV promoter in rice”, The Plant Journal, 12 (5), pp 1179-1188 48 Yu W P., A Y Wang, R H Juang, H Y Sung and J C Su (1992), “ Isolation and sequences of rice sucrose synthase cDNA and genomic DNA”, Plant molecular biology, 18(1), pp 139 -142 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 49 PHỤ LỤC ( Bài báo khoa học ) BÁO CÁO KHOA HỌC PROCEEDINGS HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC 2018 “ SÀNG LỌC VÀ TÁCH DÒNG MỘT SỐ PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L.)” Nguyễn Tiến Dũng*, Trần Thị Mai, Trương Kim Oanh, Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Xn Vũ, Nguyễn Hữu Thọ, Ngơ Xn Bình Khoa Cơng nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Thái Ngun Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ... ? ?Phân l? ??p đánh giá hoạt động promoter chuyên biệt hạt phấn từ l? ?a (Oryza sativa L. )" 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân l? ??p đánh giá hoạt động promoter chuyên biệt hạt phấn từ l? ?a (Oryza sativa L. ). .. gene liên quan đến hạt phấn dựa thông tin promoter chuyên biệt hạt phấn 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu phân l? ??p đánh giá hoạt động promoter chuyên biệt hạt phấn từ l? ?a (Oryza sativa L) góp... ĐẠI HỌC NÔNG L? ?M TRƯƠNG KIM OANH PHÂN L? ??P VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ CÂY L? ?A (Oryza sativa L. ) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC