Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn trong phế thải chăn nuôi gà

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TRONG PHẾ THẢI CHĂN NUÔI GÀ NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 7420201 Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Mã sinh viên Lớp Khóa : ThS Nguyễn Thị Minh Hằng : Hoàng Thị Lệ : 1453070020 : K59B – CNSH : 2014 - 2018 Hà Nội, 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp cá nhân nhận đƣợc nhiều động viên khích lệ, giúp đỡ với hƣớng dẫn tận tình chu đáo cơ, chú, anh chị cán phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh Hóa sinh, thuộc Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Nhân dịp xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Minh Hằng – GV Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam tận tình bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành báo cáo Luận văn tốt nghiệp Tôi chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, công nhân viên Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành báo cáo cách tốt Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè tạo điều kiện, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực Hà Nội ngày 11 tháng 05 năm 2018 Chữ ký GVHD Sinh viên Nguyễn Thị Minh Hằng Hoàng Thị Lệ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU Clony Forming Unit LB Lysogeny Broth VK Vi khuẩn MPT Mẫu phế thải VKMPT Vi khuẩn mẫu phế thải KLTN Khóa luận tốt nghiệp PTN Phịng thí nghiệm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu vi khuẩn 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn 11 1.2 Phân loại ứng dụng vi khuẩn 20 1.2.1 Phân loại 20 1.2.2 Ứng dụng 21 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu 22 2.1.1 Mẫu phế thải chăn nuôi gà 22 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 22 2.2 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà 23 2.4.2 Phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc đĩa thạch 24 2.4.3 Phƣơng pháp khiết bảo quản giống 25 2.4.4 Phƣơng pháp lên men vi khuẩn 25 2.4.5 Xác định hoạt tính enzyme vi khuẩn phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch 25 2.4.6 Xác định khả lên men loại đƣờng 26 2.4.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 2.5 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 27 2.5.1 Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn 27 2.5.2 Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn phƣơng pháp nhuộm Gram 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân lập khiết lƣu trữ vi khuẩn 30 3.1.1 Phân lập vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà 30 3.1.2 Thuần khiết bảo quản giống 31 3.2 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK phân lập đƣợc 32 3.2.1 Xác định hoạt tính loại enzyme amylase 32 3.2.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulose 34 3.2.3 Hoạt tính enzyme protease 35 3.2.4 So sánh hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK từ phế thải gà 35 3.2 Quan sát hình dạng tế bào chủng đƣợc chọn 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Kết phân lập VK từ mẫu phế thải chăn nuôi gà 30 Bảng 3.2: Hình thái, màu sắc số chủng phan lập đƣợc 32 Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme amylase 33 Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme cellulase 34 Bảng 3.5: Hoạt tính enzyme protease 35 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng pH ban đầu đến mật độ chủng vi khuẩn 38 Bảng 3.7:Đặc điểm hình thái chủng VK đƣợc tuyển chọn 39 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1:Các hình dạng vi khuẩn 11 Hình 1.2: Cấu tạo vi khuẩn 15 Hình 3.1: Khuẩn lạc vi khuẩn tổng số 31 Hình 3.2: Vịng phân giải enzyme amylase 33 Hình 3.3: Vịng phân giải enzyme cellulase 34 Hình 3.4: Vịng phân giải enzyme protease 35 Hình 3.5: Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK 36 Hình 3.6:Phản ứng phân giải đƣờng Fructose 37 Hình 3.7: Phản ứng phân giải đƣờng Glucose 37 Hình 3.8: Phản ứng phân giải đƣờng Lactose 37 Hình 3.9: Ảnh hƣởng pH ban đầu đến mật độ vi khuẩn 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nƣớc nông nghiệp, thời kỳ đổi ngành chăn ni có bƣớc phát triển nhanh chóng, mơ hình trang trại chăn ni tập trung đƣợc nhân rộng tồn quốc Mỗi năm nƣớc có khoảng 60 triệu chất thải vật ni, có khoảng 50% đƣợc xử lý, số cịn lại đƣợc sử dụng trực tiếp bón cho trồng làm thức ăn cho cá Do tập trung đầu tƣ để nâng cao suất chất lƣợng vật nuôi, phần nhiều trang trại chƣa trọng đến cơng tác kiểm sốt, quản lý chất thải nên làm phát sinh dịch bệnh, tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng ảnh hƣởng trực tiếp đến việc phát triển bền vững ngành chăn nuôi Tại nhiều địa phƣơng ngƣời dân cịn coi chất thải chăn ni phân bón, khơng quan tâm đến việc xử lý có ủ đống để chờ bón cho trồng theo mùa vụ Đây nguyên nhân gây ô nhiễm môi trƣờng lây truyền dịch bệnh cho ngƣời, vật nuôi trồng Vi sinh vật tồn nguồn phế thải với số lƣợng lớn gồm vi sinh vật có lợi vi sinh vật có hại nguyên nhân gây tƣợng ô nhiễm môi trƣờng bệnh gây hại cho vật nuôi Vi khuẩn lồi có số lƣợng nhiều lồi phổ biến có nhiều ứng dụng nên tơi chọn đề tài:“Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn phế thải chăn ni gà”, nhằm mục đích có thêm sở khoa học cần thiết chủng VSV phế thải chăn ni gà, từ làm sở để phát triển hƣớng nghiên cứu chuẩn đoán bệnh xử lý phế thải chăn nuôi gia cầm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu vi khuẩn 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố Vi khuẩn (tiếng Anh tiếng La Tinh bacterium, số nhiều bacteria) cịn đƣợc gọi vi trùng, nhóm (giới vực) vi sinh vật nhân sơ đơn bào có kích thƣớc nhỏ; số thuộc loại ký sinh trùng Vi khuẩn nhóm sinh vật đơn bào, có kích thƣớc nhỏ (kích thƣớc hiển vi) thƣờng có cấu trúc tế bào đơn giản khơng có nhân, khung tế bào (cytoskeleton) bào quan nhƣ ty thể lục lạp Cấu trúc tế bào vi khuẩn đƣợc miêu tả chi tiết mục sinh vật nhân sơ vi khuẩn sinh vật nhân sơ, khác với sinh vật có cấu trúc tế bào phức tạp gọi sinh vật nhân chuẩn Vi khuẩn nhóm diện đơng đảo sinh giới Chúng diện khắp nơi đất, nƣớc, chất thải phóng xạ, suối nƣớc nóng, [1] dạng cộng sinh ký sinh với sinh vật khác, đƣợc biết phát triển mạnh mẽ tàu khơng gian có ngƣời lái.[2] Nhiều tác nhân gây bệnh (pathogen) vi khuẩn Hầu hết vi khuẩn có kích thƣớc nhỏ, thƣờng khoảng 0.5-5.0 μm, có lồi có đƣờng kính đến 0,3mm (Thiomargarita) Chúng thƣờng có vách tế bào, nhƣ tế bào thực vật nấm, nhƣng với thành phần cấu tạo khác biệt (peptidoglycan) Nhiều vi khuẩn di chuyển tiên mao (flagellum) có cấu trúc khác với tiên mao nhóm khác Có khoảng 40 triệu tế bào vi khuẩn gram đất hàng triệu tế bào mm nƣớc Ƣớc tính có khoảng 5×1030 vi khuẩn Trái Đất,[3] tạo thành lƣợng sinh khối vƣợt tất động vật thực vật.[4] Vi khuẩn có vai trị quan trọng tái chế chất dinh dƣỡng nhƣ cố định nitơ từ khí gây thối rữa sinh vật khác Trong vùng dinh dƣỡng quanh cách mạch nhiệt dịch lỗ phun lạnh, vi khuẩn cung cấp chất dinh dƣỡng cần thiết cho sống cách biến đổi hợp chất hòa tan nhƣ hydro sulfua metan thành lƣợng, chúng phát triển mạnh nơi sâu Trái Đất rãnh Mariana.[5][6] Các nghiên cứu khác liên quan chúng sống bên đá độ sâu 1900 feet bên dƣới đáy biển cách khơi bờ biển tây bắc Hoa Kỳ 8500.[5][7] Vi khuẩn đƣợc quan sát Antony van Leeuwenhoek năm 1683 kính hiển vi trịng ơng tự thiết kế Tên "vi khuẩn" đƣợc đề nghị sau lâu Christian Gottfried Ehrenberg vào năm 1828, xuất phát từ chữ βακτηριον tiếng Hy Lạp có nghĩa "cái que nhỏ" Louis Pasteur (1822-1895) Robert Koch (1843-1910) miêu tả vai trò vi khuẩn thể mang gây bệnh hay tác nhân gây bệnh.an đầu vi khuẩn hay vi trùng (microbe) đƣợc coi loại nấm có kích thƣớc hiển vi (gọi schizomycetes), ngoại trừ loại vi khuẩn lam (cyanobacteria) quang hợp, đƣợc coi nhóm tảo (gọi cyanophyta hay tảo lam) Phải đến có nghiên cứu cấu trúc tế bào vi khuẩn đƣợc nhìn nhận nhóm riêng khác với sinh vật khác Vào năm 1956 Hebert Copeland phân chúng vào giới (kingdom) riêng Mychota, sau đƣợc đổi tên thành Sinh vật khởi sinh (Monera), Sinh vật nhân sơ (Prokaryota), hay Vi khuẩn (Bacteria) Trong thập niên 1960, khái niệm đƣợc xem xét lại vi khuẩn (bây gồm cyanbacteria) đƣợc xem nhƣ hai nhóm sinh giới, với sinh vật nhân chuẩn Sinh vật nhân chuẩn đƣợc đa số cho tiến hóa từ vi khuẩn, sau cho từ nhóm vi khuẩn hợp lại Sự đời phân loại học phân tử làm lung lay quan điểm Năm 1977, Carl Woese chia sinh vật nhân sơ thành nhóm dựa trình tự 16S rRNA, gọi vực Vi khuẩn thức (Eubacteria) Vi khuẩn cổ Archaebacteria Ông lý luận hai nhóm này, với sinh vật nhân chuẩn, tiến hóa độc lập với vào năm 1990 nhấn mạnh thêm quan điểm cách đƣa hệ phân loại vực (three-domain system), bao gồm Vi khuẩn (Bacteria), Vi khuẩn cổ (Archaea) Sinh vật nhân chuẩn (Eucarya) Quan điểm đƣợc chấp nhận rộng rãi nhà sinh học 10 2.6 Ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả sinh trƣởng phát triển vi khuẩn Mục đích: Xác định ảnh hƣởng pH ban đầu tới tốc độ sinh trƣởng, phát triển chủng vi khuẩn nghiên cứu, xác định giá trị pH thích hợp tới sinh trƣởng, phát triển chủng vi khuẩn lactic đƣợc tuyển chọn Nguyên tắc: chủng vi khuẩn lactic sinh trƣởng phát triển giới hạn pH định Dựa vào đặc điểm chia vi sinh vật làm loại: Vi sinh vật ƣa trung tính: chúng sinh trƣởng, phát triển tốt mơi trƣờng có pH từ 6,4 đến 7,5 Vi sinh vật ƣa axit: chúng tồn sinh trƣởng pH từ – Vi sinh vật ƣa kiềm: chúng sinh trƣởng tốt mơi trƣờng có độ pH cao tới 11,5 Giá trị pH mà thích hợp với sinh trƣởng phát triển vi khuẩn Lactic đƣợc gọi pH tối thích, pH này, vi khuẩn lactic có trao đổi chất với mơi trƣờng mạnh sinh trƣởng phát triển chúng mạnh Tiến hành: Nuôi cấy lắc tốc độ 200 vịng/phút nhiệt độ tối thích với chủng vi khuẩn lactic môi trƣờng LB dịch thể dải pH 5; 6; 6,5; 48 Thu lấy dịch nuôi, đo OD xác định sinh khối tế bào Từ kết ghi lại đƣợc chọn pH ban đầu thích hợp cho sinh trƣởng chủng 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập khiết lƣu trữ vi khuẩn 3.1.1 Phân lập vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà Từ mẫu phế thải chăn nuôi gà đƣợc lấy khu vực Xuân Mai thời điểm chăn nuôi gà khác khau, ký hiệu mẫu - MPT1 mẫu phế thải chăn nuôi gà sau thời gian bán gà tháng - MPT2 mẫu phế thải chăn nuôi gà thời gian nuôi gà - MPT3 mẫu phế thải chăn nuôi sau thời gian bán gà 10 ngày Mẫu đƣợc pha loãng nhƣ mô tả phần phƣơng pháp nghiên cứu (mục 2.4.1) Cấy trải môi trƣờng nuôi khuẩn LB thu đƣợc 13 chủng VK, ký hiệu chủng đƣợc thể bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết phân lập VK từ mẫu phế thải chăn nuôi gà Ký hiệu mẫu Số lƣợng chủng VK Ký hiệu chủng CFU/g VKMPT1.1 VKMPT1.2 VKMPT1.3 MPT1 VKMPT1.4 4.106 VKMPT1.5 VKMPT1.6 VKMPT1.7 VKMPT2.1 MPT2 VKMPT2.2 2.106 VKMPT2.3 VKMPT3.1 MPT3 VKMPT3.2 3.106 VKMPT3.3 - Quan sát bảng 3.1 cho thấy việc phân bố VK không đồng mẫu khác nhác nhau, mẫu có phân bố VK nhiều mẫu 30 MPT1 53,84%, hai mẫu cịn lại MPT2 MPT3 có phân bố VK với 23,07% - Kết bảng 3.1 ta thấy mật độ mẫu phế thải khác nhau, mẫu phế thải gà có mật độ VK nhiều mẫu MPT1 với mật độ 4.10 6, tiếp đến mẫu MPT3 có mật độ VK 3.106 cuối mẫu MPT2 có mật độ VK thấp 2.106 Nhƣ vậy, mật độ vi khuẩn mẫu phế thải chăn nuôi gà thu thập phục vụ nghiên cứu khác Từ chủng VK nêu trên, tiếp tục tiến hành tinh khuẩn lạc, khiết giống, việc tinh khuẩn lạc mơi trƣờng ni cấy thích hợp dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc đƣợc ký hiệu theo mẫu phân lập Hình 3.1: Khuẩn lạc vi khuẩn tổng số sau thời gian bán gà tháng 3.1.2 Thuần khiết bảo quản giống Sau phân lập đƣợc chủng vi khuẩn phế thải chăn nuôi gà tiến hành khiết chủng VK phân lập đƣợc việc tiến hành cấy ziczac hoạc cấy vạch nhiều lần môi trƣờng LB đặc thu đƣợc chủng khiết 31 Hình 3.2: Khuẩn lạc số chủng VK Khuẩn lạc thu đƣợc chủng VK có hình thái, màu sắc khác đƣợc mơ tả bảng 3.2: Bảng 3.2: Hình thái, màu sắc số chủng phân lập Chủng vi khuẩn Hình thái, màu sắc khuẩn lạc VKMPT1.1 Tròn, trơn, màu trắng sữa VKMPT1.3 Tròn, màu vàng chanh VKMPT2.3 Trịn, trơn, màu vàng nâu viền ngồi màu trắng đục VKMPT3.2 Trịn, trơn, màu trắng ngà Trên mơi trƣờng LB chủng VK sinh trƣởng phát triển tốt Các chủng sau đƣợc tinh khiết đƣợc bảo quản tủ lạnh 40C để tiến hành thí nghiệm 3.2 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK phân lập đƣợc Sau tuyển chọn tinh chủng vi khuẩn chọn chủng VK để kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào chúng 3.2.1 Xác định hoạt tính loại enzyme amylase 32 Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme amylase Chủng vi khuẩn Hoạt tính enzyme amylase (D-d, mm) VKMPT1.1 8±0,01 VKMPT1.3 11±0,01 VKMPT2.3 15±0,13 VKMPT3.2 15±0,07 Hình 3.2: Vịng phân giải enzyme amylase Từ bảng số liệu 3.3 cho thấy chủng VK có hoạt tính enzyme amylase Trong hoạt tính enzyme amylase hai chủng VKMPT3.2 VKMPT2.3 mạnh (15mm), hoạt tính enzyme amylase chủng VKMPT1.1 yếu (8mm) Tinh bột thành phần phế thải chăn nuôi gà, chủng VK đƣợc tìm thấy phế thải chăn ni gà có hoạt tính phân giải tinh bột đồng phù hợp với kết nghiên cứu chủng VK tìm thấy phế thải chăn ni gà 33 3.2.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulose Bảng 3.4: Hoạt tính enzyme cellulose Hoạt tính enzyme cellulase (D- Chủng vi khuẩn d, mm) VKMPT1.1 - VKMPT1.3 8±0,02 VKMPT2.3 - VKMPT3.2 18±0,01 Chú thích: (-) khơng có hoạt tính Hình 3.3: Vịng phân giải enzyme cellulase Từ bảng số liệu 3.4 cho thấy có hai chủng VK có hoạt tính enzyme cellulase chủng VKMPT1.3 (8mm) chủng VKMPT3.2 (18mm) Hai chủng cịn lại khơng có hoạt tính enzyme cellulase chủng VKMPT1.1 chủng VKMPT2.3 Hoạt tính enzyme cellulose chủng VK đƣợc chọn thấp khơng đồng có số chủng đƣợc chọn có hoạt tính 34 3.2.3 Hoạt tính enzyme protease Bảng 3.5: Hoạt tính enzyme protease Chủng vi khuẩn Hoạt tính enzyme protease (D-d, mm) VKMPT1.1 20±0,21 VKMPT1.3 - VKMPT2.3 18±0,05 VKMPT3.2 16±0,11 Chú thích: (-) khơng có hoạt tính Hình 3.4: Vịng phân giải enzyme protease Từ bảng số liệu 3.5 cho thấy có chủng VK có hoạt tính enzyme protease chủng: VKMPT1.1 (20mm), VKMPT2.3 (18mm), VKMPT3.2 (16mm) Chủng VKMPT1.3 khơng có hoạt tính enzyme protease Hoạt tính enzyme protease chủng có hoạt tính cao đồng kết phù hợp chủng vi khuẩn đƣợc tìm thấy phế thải chăn ni gà Do sống phế thải chăn nuôi gà, thành phần phế thải chủ yếu protein nên VK tìm thấy có hoạt tính enzyme protease cao giúp phân giải tốt protein 3.2.4 So sánh hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK từ phế thải gà Hoạt tính enzyme chủng VK từ phế thải gà đƣợc thể qua biểu đồ dƣới đây: 35 Hình 3.5: Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK Chủng VKMPT3.4 có hoạt tính enzyme amylase mạnh với đƣờng kính vịng phân giải là: (15mm), chủng VKMPT1.1 có hoạt tính enzyme amylase nhỏ (8mm) Chủng VKMPT1.1 có hoạt tính enzyme protease mạnh (20mm), chủng khơng có hoạt tính enzyme protease chủng VKMPT1.3 Chủng VKMPT3.2 có hoạt tính enzyme cellulase mạnh (18mm), hai chủng VKMPT1.1 chủng VKMPT2.3 khơng có hoạt tính cellulase Dựa vào kết cho thấy chủng VK có hoạt tính enzyme khơng đồng chủng có hoạt tính với loại enzyme (VKMPT3.2) chủng cịn lại có hoạt tính với loại enzyme 3.3 Xác định khả phân giải loại đƣờng Các chủng vi khuẩn tốt sau đƣợc tuyển chọn nuôi lỏng mơi trƣờng LB, sau xác định khả phân giải đƣờng chủng VK Vi khuẩn phân giải polisaccarid ngoại bào nhờ tiết enzyme thuỷ phân phân giải polisaccarid thành phân tử nhỏ hơn, sau phân tử đƣợc đồng hoá Tinh bột glicogen bị thuỷ phân amylase thành glucose, maltose sản phẩm khác 36 Hình 3.6:Phản ứng phân giải đường Fructose Ở môi trƣờng đƣờng fructose chủng VKMPT2.3 có khả phân giải đƣờng mạnh (mơi trƣờng có màu vàng đậm nhất), chủng VKMPT1.1 có khả phân giải yếu (màu vàng cam) Hình 3.7: Phản ứng phân giải đường Glucose Ở mơi trƣờng đƣờng glucose chủng VKMPT3.3 có khả phân giải mạnh nhất, chủng VKMPT2.3 có khả phân giải yếu Hình 3.8: Phản ứng phân giải đường Lactose Ở mơi trƣờng đƣờng lactose chủng VKMPT3.2 có khả phân giải đƣờng mạnh nhất, chủng VKMPT1.1 có khả phân giải yếu Chú thích: (A): ĐC; 37 (B): Chủng VKMPT1.1; (C): Chủng VKMPT1.3; (D): Chủng VKMPT2.3; (E): Chủng VKMPT3.2 Tất chủng VK có khả phân giải loại đƣờng ống nghiệm có chủng phân giải đƣờng màu chuyển từ đỏ sang vàng lần lƣợt loại đƣờng fructose, glucose, lactose Khả phân giải đƣờng chủng VK đƣợc tìm thấy mạnh 3.4 Ảnh hƣởng pH ban đầu đến khả sinh trƣởng phát triển vi khuẩn Bảng 3.6: Ảnh hưởng pH ban đầu đến mật độ chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Mật độ vi khuẩn (OD600) pH=5 pH=6 pH=6,5 pH=7 VKMPT1.1 0,583 1,556 0,875 0,539 VKMPT1.3 0,675 1,568 1,125 0,584 VKMPT2.3 0,822 1,832 1,414 0,602 VKMPT3.2 0,931 1,437 1,129 0,581 Hình 3.9: Ảnh hưởng pH ban đầu đến mật độ vi khuẩn 38 Từ bảng 3.6 hình 3.10 cho thấy: Mơi trƣờng trung tính pH=6; chủng VK có mật độ cao Khi pH thay đổi tăng lên pH kiềm mật độ chủng vi khuẩn giảm dần, pH axit chủng VK không sinh trƣởng phát triển với mật độ tối ƣu Chủng VKMPT2.3 có mật độ sinh khối cao (1,832), chủng VKMPT3.4 có mật độ sinh khối thấp (1,437) 3.2 Quan sát hình dạng tế bào chủng đƣợc chọn Sau phân lập tinh chủng VK chọn đƣợc chủng có hoạt tính Bảng 3.7:Đặc điểm hình thái chủng VK tuyển chọn Chủng vi khuẩn VKMPT1.1 VKMPT1.3 VKMPT2.3 VKMPT3.2 Đặc điểm Sắp xếp tế Nhuộm Hình dạng tế bào (nhuộm bào Gram Gram) Đơn, đơi, đám Đơn, đôi, đám Đơn, đôi, đám Đơn, đôi, đám Gram (-) Gram (-) Gram (-) Gram (-) 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Phân lập khiết đƣợc 13 chủng VK mẫu phế thải chăn ni gà - Xác định đƣợc hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK số 13 chủng: + Hoạt tính amylase: chủng có hoạt tính amylase, chủng VKMPT3.2 có hoạt tính mạnh (15mm), chủng VKMPT1.1 có hoạt tính yếu (8mm) + Hoạt tính cellulase: hai chủng có hoạt tính chủng VKMPT1.3 (8mm) chủng VKMPT3.2 (18mm), hai chủng khơng có hoạt tính chủng VKMPT1.1 chủng VKMPT2.3 + Hoạt tính protease: ba chủng có hoạt tính protease chủng VKMPT1.1 (20mm), VKMPT2.3 (18mm) chủng VKMPT3.2 (16mm); chủng VKMPT1.3 hoạt tính enzyme amylase - Quan sát đƣợc hình thái khuẩn lạc chủng - Cả chủng bắt màu Gram âm quan quát hình dạng tế bào Kiến nghị Do thời gian tiến hành KLTN trang thiết bị PTN hạn chế nên chƣa thực đƣợc số nội dung chuyên sâu chủng VK Nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu thời gian cho phép thực nội dung sau: - Định danh tên loài cho chủng VK đƣợc tuyển chọn kỹ thuật sinh học phân tử - Nghiên cứu ứng dụng chủng VK để tạo chế phẩm sinh học xử lý chất thải chăn nuôi 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: 1, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyển, Phạm Văn Ty, Giáo trình vi sinh vật học đại cương, Nhà xuất giáo dục 2, Kinh tế nông thôn (06/11/2009) 3, Nguyễn Văn Cách, Lê Văn Nhƣơng, Cơ sở công nghệ sinh học, tập – công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục Việt Nam, 2009 4, Ngơ Đình Bính, Vi sinh vật học công nghiệp, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia, 2005 5, Nguyễn Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1993 6, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietscience, 2006 7, Phan Quốc Khánh, Cơng nghiệp hóa chất, Thông tin kinh tế & Công nghệ, số 1, 2004 Tài liệu tiếng anh: 1, Fredrickson JK, Zachara JM, Balkwill DL, Kennedy D, Li SM, Kostandarithes HM, Daly MJ, Romine MF, Brockman FJ (2004) “Geomicrobiology of high-level nuclear waste-contaminated vadose sediments at the Hanford site, Washington state” Applied and Environmental Microbiology 70 (7): 4230–41 PMC 444790 PMID 15240306 doi:10.1128/AEM.70.7.4230-4241.200 3, Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ (1998) “Prokaryotes: the unseen majority” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95 (12): 6578–83 Bibcode:1998PNAS 95.6578W PMC 33863 PMID 9618454 doi:10.1073/pnas.95.12.6578 4, C.Michael Hogan 2010 Bacteria Encyclopedia of Earth eds Sidney Draggan and C.J.Cleveland, National Council for Science and the Environment, Washington DC 6, Glud R, Wenzhöfer F, Middelboe M, Oguri K, Turnewitsch R, Canfield DE, Kitazato H (2013) “High rates of microbial carbon turnover in sediments in the deepest oceanic trench on Earth” Nature Geoscience (4): 284 Bibcode:2013NatGe 284G doi:10.1038/ngeo1773 Các website 1, http://tailieu.vn 2, http://luanvan.net 3, http://giaotrinh.vn CÔNG THỨC CÁC LOẠI MƠI TRƢỜNG SỬ DỤNG Cơng thức mơi trƣờng LB NaCl 10g/l Peptone 10g/l Cao nấm men 5g/l Agar 15-20g/l Công thức môi trƣờng thử đƣờng: Cao nấm men 5g/l Peptone 10g/l Phenol red 0,01g/l Các loại đƣờng: 10g/l glucose, lactose, fructose Cơng thức mơi trƣờng thử hoạt tính enzyme Agar Cơ chất: tinh bột, CMC, casein 20g/l 10g/l ... tài:? ?Phân lập nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn phế thải chăn ni gà? ??, nhằm mục đích có thêm sở khoa học cần thiết chủng VSV phế thải chăn ni gà, từ làm sở để phát triển hƣớng nghiên cứu. .. 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập khiết lƣu trữ vi khuẩn 3.1.1 Phân lập vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà Từ mẫu phế thải chăn nuôi gà đƣợc lấy khu vực Xuân Mai thời điểm chăn nuôi gà khác khau,... nghiên cứu - Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn từ phế thải chăn nuôi gà Xuân Mai - Chƣơng Mỹ - Hà Nội - Nghiên cứu chọn lọc chủng VK có hoạt tính enzyme ngoại bào cao - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng