Nghiên cứu nhân giống keo lai nhân tạo mới được chọn tạo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

ĐẶT VẤN ĐỀ Gần đây, Trung tâm nghiên cứu giống rừng - Viện khoa học Lâm nghiệp Việt nam chọn, tạo số dòng Keo lai Đó giống có sinh trưởng nhanh nhiều điều kiện lập địa nước ta có tiềm bột giấy lớn Tuy vậy, khó khăn giống có tượng phân ly hữu tính nên thực sinh khơng có đầy đủ đặc điểm tốt mẹ Để phát triển sản xuất đại trà địi hỏi phải có phương pháp nhân giống sinh dưỡng thích hợp Trong phưong pháp nhân giống sinh dưỡng ni cấy mô - tế bào phương pháp phổ biến để nhân nhanh giống lai cung cấp quan sinh dưỡng Cây nuôi cấy mô thường trẻ hố cao độ nên có thời kỳ non trẻ kéo dài có rễ phát triển gần giống mọc từ hạt Nhân giống nuôi cấy mơ - tế bào cịn có hệ số nhân cao nhân giống hom phụ thuộc vào điều kiện thời tiết bên Từ cụm chồi bệnh ban đầu, sau năm nuôi cấy liên tục sản xuẩt hàng triệu Vì thế, nhiều sở sản xuất giống tỉnh đầu tư trang thiết bị để sản xuất cấy mô quy mô công nghiệp Sự đầu tư tạo tiền đề tốt cho việc đột phá công nghệ nhân giống trồng, tạo cách mạng suất chất lượng nhờ phát triển trồng rừng dịng vơ tính Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô Keo lai biết quảng bá rộng rãi việc áp dụng chúng để nhân giống dòng chọn tạo vấn đề đơn giản Cũng phương pháp nhân giống sinh dưỡng khác, ảnh hưởng yếu tố di truyền mẹ đến kết ni cấy địi hỏi xây dựng quy trình kỹ thuật riêng cho dịng cho số dịng có quan hệ di truyền gần gũi u cầu trang thiết bị, kinh phí để thực nghiên cứu kinh nghiệm đội ngũ vận hành dây chuyền ni cấy chiều kích đáng kể hạn chế khám phá quy trình số sở nuôi cấy mô - tế bào thực vật nước ta Đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai nhân tạo chọn tạo phương pháp nuôi cấy mô” đặt nhằm góp phần giải vấn đề tạo thêm điều kiện thuận lợi để phát triển giống lai chọn tạo sản xuất đại trà PHẦN I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở khoa học nhân giống nuôi cấy mô tế bào Nhân giống nuôi cấy mô - tế bào phương pháp nhân giống thực ni cấy quan, mơ ( chí tế bào) mơi trường dinh dưỡng đặc biệt hồn tồn vơ trùng kiểm sốt Vì vật liệu nuôi cấy thường nhỏ thực môi trường nhân tạo nên phương pháp nhân giống gọi vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống in vitro Tinh toàn (Totipotence) tế bào coi tảng việc nuôi cấy Điều nhà thực vật học ngưòi Đức Haberlandt đề xuất lần vào năm 1902 Ông cho tế bào thể sinh vật mang tồn thơng tin di truyền cần thiết đầy đủ cá thể Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh Giả thuyết đến thực nghiệm chứng minh nhiều lồi thực vật bậc cao Sự phân hố phản phân hố sở quan trọng ni cấy mô - tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành thể thống bao gồm nhiều quan chức năng, tất loại tế bào có nguồn gốc từ tế bào phơi sinh tạo nên q trình phân hóa Đó chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào mơ chun hố, đảm nhận chức khác thể Tuy nhiên, tế bào phân hố thành mơ chức chúng khơng hồn tồn khả phân chia Nếu tách tế bào nhóm tế bào khỏi thể nuôi cấy chúng điều kịên mơi trường thích hợp, chúng lại quay trở lại dạng tế bào phơi sinh ban đầu lại có khả phân chia mạnh mẽ phân hóa để tái sinh hồn chỉnh Q trình gọi phản phân hoá Sự phân hoá phản phân hoá biểu thị sơ đồ: Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa Về chất, phân hố phản phân hố tế bào q trình hoạt hố gen Tại thời điểm qúa trình phát triển cá thể, có số gen hoạt hố (trước bị ức chế) giúp thể biểu tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Mặt khác, tế bào nằm khối mô thể thường bị ức chế tế bào xung quanh nên khơng thể biểu đặc tính Nếu tế bào đựơc tách riêng rẽ gặp điều kiện mơi trường thuận lợi gen hoạt hố, q trình phân hố phản phân hố đựơc xảy theo chương trình định sẵn genom 1.2 Các giai đoạn q trình nuôi cấy in vitro 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị Giai đoạn xem bước hoá vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy (cây giống) đưa khỏi nơi phân bố tự nhiên khỏi khu khảo nghiệm để chúng thích ứng với môi trường mới, giảm bớt nguồn bệnh tạo điều kiện chủ động nguồn mẫu vật cho công tác ni cấy Trong điều kiện cần thiết tác động biện pháp trẻ hoá vật liệu nhân giống thụ phấn nhân tạo cho lồi khó thụ phấn điều kiện tự nhiên 1.3.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động Mục tiêu giai đoạn tạo mẫu non trẻ cho giai đoạn nuôi cấy nên cần đảm bảo tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt Bộ phận chọn làm mẫu cấy phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho lồi đặc biệt giai đoạn phát triển Đỉnh sinh trưởng chồi bên sử dụng hầu hết loại trồng Ngồi chóp đỉnh chồi non nảy mầm từ hạt cũg sử dụng Mẫu ttrước cấy vào môi trường làm nguồn bệnh cách rửa nhiều lần nước sạch, sau ngâm dung dịch khử trùng nồng độ thích hợp để làm nguồn bênh Tuỳ thuộc vào vật liệu mà chọn loại hoá chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp Trong trình khử trùng mẫu cấy phải thận trọng để không làm ảnh hưởng đến sức sống mẫu cấy 1.2.3 Giai đoạn tạo chồi nhân nhanh chồi Đây giai đoạn quan trọng định thành cơng tồn q trình nhân giống Trong giai đoạn này, vai trò chất điều hoà sinh trưởng quan trọng để sản sinh lượng chồi tối đa mà đảm bảo sức sống chất di truyền vật liệu ni cấy 1.2.4 Giai đoạn tạo mơ hồn chỉnh Tạo rễ giai đoạn quan trọng để có hoàn chỉnh Khi tạo rễ cần loại bỏ chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi thay vào số Auxin kích thích tạo rễ Tuỳ theo loài mà sử dụng loại nồng độ auxin cho phù hợp Thông thường chất IBA, NAA, IAA với hàm lượng từ 1- mg/l chồi nhiều loài thân gỗ Một số trường hợp đặc biệt chồi tạo nhỏ ngắn, sử dụng 1-5mg/l GA3 số hợp chất hữu nước dừa non…bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn chuyển sang khu huấn luyện 1.2.5 Giai đoạn chuyển in vitro vườn ươm Cây đạt tiêu chuẩn hình thái định (số lá, số rễ, chiều cao cây) chuyển dần từ ống nghiệm nhà kính hay nhà lưới, sau chuyển vườn ươm Cây in vitro nuôi cẩy điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên chuyển với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ manh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, dễ bị stress, dễ nước mau héo Để tránh tình trạng này, vườn ươm cấy mơ phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao…Cây thường cấy luống ươm có chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ ẩm Trong ngày đầu cần phải phủ nylon để giảm trình nước (thường 7- 10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ tạo trình cấy mô bị lụi rễ xuất hiện, thường đựơc xử lý với chất kích thích rễ cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian rễ 1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết nuôi cấy mô- tế bào Một số lượng lớn yếu tố phức tạp ảnh hưởng tới phát sinh hình thái mơ- tế bào, nhiên yếu tố phụ thuộc mạnh mẽ vào lồi 1.3.1 Mơi trường ni cấy Mơi trường ni cấy bao gồm mơi trường hóa học điều kiện bên xem vấn đề định thành bại q trình ni cấy 1.3.1.1 Mơi trường hố học: Mơi trường hóa học xem phần đệm để cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng trưởng phân hố mơ suốt q trình ni cấy in vitro Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh: Thành phần, hàm lượng chất mơi trường ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả phát sinh hình thái phận nuôi cấy Khả tái sinh chồi, lá, rễ hoàn chỉnh sinh trưởng phát triển toàn Tuỳ loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, chí tuỳ quan khác thể mà dinh dưỡng cần cho sinh trưởng tối ưu chúng khác Cho đến nhiều môi trường dinh dưỡng tìm như: White (1934); Knudson (1946): Vaccin and Went (1949); Murashige Skoog (1962); Knop (1974)…Mỗi mơi trường thích hợp với số lồi định nên nuôi in vitro tuỳ thuộc vào q trình phát triển mà chọn mơi trường dinh dưỡng phù hợp Nhìn chung mơi trường hóa học bao gồm thành phần sau: Nguồn bon: Mẫu cấy quang hợp song giai đoạn ni cấy đầu khả yếu, nên việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cácbon dạng hữu bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia tăng sinh khối Hai loại đường thường sử dụng saccarose glucose với hàm lượng từ 20-30 g/l cho 1lít dung dịch Trường hợp cần thiết sử dụng loại đường khác như: Maltose, Lactose Glactose Việc trải qua nồi hấp nhiệt độ cao gây việc phân huỷ đường thuỷ phân điều bất lợi cho phát triển thực vật Các loại muối khống đa lượng: Nhu cầu muối khống mơ quan thực vật nuôi cấy in vitro, giống trồng tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần có mơi trường ni cấy là: N, P, K.Ca, Mg, S, thành phần hàm lượng thay đổi tuỳ đối tượng ni cấy nhìn chung nguyên tố sử dụng nồng độ 30 g/l dung dịch Môi trường giàu Kali xúc tiến q trình trao đổi chất mạnh mẽ, mơi trường giàu Nitơ Kali thích hợp cho hình thành chồi - N (Nitơ): Được sử dụng dạng NO3- (nitrat) NH4+ (amoni) riêng rẽ phối hợp với nhau, việc hấp thụ NO3- tế bào thực vật tỏ có hiệu so với NH4 + Nhưng NO3 gây tượng “kiềm hố” mơi trường Vì giải pháp sử dụng phối hợp hai nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý sử dụng rộng rãi Các muối khống có N thường dùng : Canxi nitrat (Ca (NO3)2 4H2O); Kali nitrat (KNO3); Natri Nitrat (NaNO3); Amoni nitrat (NH4NO3) Các muối Amôn thường dùng : Amon sunphat (NH4)2SO4 ; Hoặc Amon Nitrat (NH4NO3) - Hai dạng photpho thường dùng : NaHPO4.7H2O KH2PO4 - Kali cung cấp cho môi trường dạng Kali nitrat (KNO3); Kali Clorua ( KCl); Kali Photphat ( KH2PO4) - Nguồn canxi môi trường cung cấp dạng muối Canxi Nitrat : Ca(NO3)2.4H2O; CaCl2 6H2O; CaCl2.2H2O - Nguồn Mg S cung cấp dạng MgSO4.7H2O (NH4)2SO4 - Các Ion Na+ Cl- cần nồng độ thấp đưa vào môi trường muối khống điều chỉnh PH mơi trường Các loại muối khoáng vi lượng: Là nguyên tố sử dụng nồng độ thấp 30 mg/1 lít dung dịch nhiều nguyên tố vi lượng chứng minh thiếu phát triển mô là: Sắt, đồng, kẽm, Mangan, Moliden, Bo, Iốt, CoBan Các nguyên tố đóng vai trò quan trọng hoạt động Enzym, chúng dùng nồng độ thấp nhiều so với yếu tố đa lượng Sắt (Fe) : Thiếu Fe tế bào khả phân chia, thiếu Fe làm giảm lượng ARN sinh tổng hợp Protein làm tăng lượng AND Acid amin tự dẫn đến giảm phân bào, Fe thường tạo phức hợp với thành phần khác PH môi trường thay đổi phức hợp thường khả giải phóng Fe cho nhu cầu thay đổi chất tế bào Mangan (Mn): Thiếu Mn làm cho hàm lượng Axit amin tự AND tăng lên, ARN sinh tổng hợp Protein giảm dần đến phân bào Bo (B): Thiếu B môi trường gây nên biểu thừa auxin thực tế B làm cho chất ức chế Auxin Oxydase tế bảo giảm Mơ ni cấy có biểu mơ sẹo hố mạnh, thường mô sẹo xốp, mọng nước, tái sinh Molypden (Mo) : Tác động trực tiếp lên trình trao tế bào thực vật Các vitamin: Các vitamin, axit amin chất phụ gia hữu thường bổ sung vào môi trường sinh dưỡng nhằm thúc đẩy trình sinh trưởng, phát triển mô nuôi cấy Mặc dù tất loại mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả tự tổng hợp hầu hết loại Vitamin thường không đủ lượng nên phải bổ sung thêm từ bên ngồi Tuỳ hệ mơ giai đoạn nuôi mà Vitamin bổ sung lượng thích hợp để mơ đạt sinh trưởng tối ưu Các Vitamin B1 (Thiamin), B2 (Ribofravin); B3 (Axit panthotenic); B5 (Axit nicotinic) ; B6 (Piridoxin) với nồng độ thường từ 0,1 – 1mg/l Myo - Inositol hay sử dụng có vai trị quan trọng sinh tổng hợp thành tế bào thực vật chất bền vững khử trùng nhiệt, thường sử dụng với nồng độ cao: 50 – 500mg/l dung dịch Các Vitamin thường pha hỗn hợp dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 1000 lần dung dịch làm việc Các dung dịch Vitamin dễ hỏng nấm khuẩn nhiềm tạp, cần giữ điều kiện lạnh 00C nên chưa sẵn dịch mẹ Vitamin nhiều lọ nhỏ bảo quản lạnh Các acid amin thường bổ sung vào môi trường mặt làm nguồn nitơ hữu hàm lượng nitơ môi trường bị thiếu hụt, mặt khác làm tăng sinh trưởng mô cấy rõ rệt, chất phụ gia hữu nước dừa, dịch chiết nấm men, … bổ sung vào môi trường nhóm kích thích sinh trưởng mơ sẹo quan Các chất điều hoà sinh trưởng: Các chất điều hồ sinh trưởng có vai trị quan trọng đến kết nuôi cấy in vitro, định thành cơng tồn q trình ni cấy, ảnh hưởng đến biệt hố, phản biệt hoá sinh trưởng tế bào, đặc biệt biệt hoá quan chồi rễ Nhu cầu chất điều hoà sinh trưởng loại giai đoạn nuôi cấy khác nhau, nên tuỳ theo mục đích ni cấy chọn nồng độ tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thường sử dụng nhóm chất là: Auxin, Cytokinin, Gibberellin - Auxin: Au xin có tác dụng kích thích hình thành mơ sẹo xuất rễ bất định, kích thích dãn tế bào Có loại auxin thường sử dụng nuôi cấy mô là: IAA (Indol axetic acid), NAA (Naphthyl acetic acid), 2,4D (2,4- Dicloro phenoxy axetic acid) IBA (Indol butyric acid) Nồng độ auxin dùng nuôi cấy dao động tuỳ chất đối tượng nuôi cấy thường 0,001- 10 mg/l - Cytokinin: Cytokinin bổ sung vào môi trường chủ yếu kích thích phân chia tế bào định phân hố chồi bất định từ mơ sẹo quan Việc sử dụng tỷ lệ auxin / cytokinin môi trường nuôi cấy định phân hố mơ theo hướng tạo rễ, tạo chồi hay mô sẹo Theo nghiên cứu Miller Skoog cho thấy môi trường nuôi cấy tỷ lệ auxin / cytokinin cao mơ biệt hố theo hướng tạo rễ, thấp mơ biệt hố theo hướng tạo chồi, tỷ lệ gần mẫu ni cấy biệt hố theo hướng tạo mô sẹo Theo Das (1958) Nistach (1968) cho có tác dụng đồng thời auxin xytokinin kích thích mạnh mẽ tổng hợp AND dẫn đến trình phân chia tế bào Các chất thuộc nhóm cytokinin thường sử dụng Kinetin; BAP; Zeatin; chất BAP Kinetin dùng phổ biến có hoạt tính cao giá không đắt - Gibberellin: Tới phát 60 loại chất khác thuộc nhóm gibberellic acid loại gibberellic acid thơng dụng ni cấy mơ GA3 Hợp chất có tác dụng kích thích giãn tế bào, kéo dài lóng đốt thân cây, phá ngủ phơi, ức chế tạo rễ phụ (Picrik, 1987) tạo chồi phụ (Street, 1973) Ngồi GA3 cịn ảnh hưỏng đến hoa số thực vật rút ngắn thời gian sinh trưởng Ngồi chất có tác dụng kích thích cịn có chất có tác dụng ức chế sinh trưởng, phát triển khác ABA, Etylen gây ảnh hưởng rõ tới phát sinh hình thái số trồng ni cấy in vitro Các nhóm chất bổ sung: Cho đến thành phần môi trường ngày phong phú đầy đủ phức tạp, người ta sử dụng số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như: Nước dừa, Dịch chiết mầm lúa mỳ, Dịch thuỷ phân casein, hỗn hợp acid amin nhân tạo Biểu đồ 02: Ảnh hưởng riêng lẻ BAP Kn tới khả nhân nhanh kéo dài chồi Keo lai Kiểm tra ảnh hưởng riêng lẻ BAP Kinetin đến chiều dài chồi Keo lai in vitro tiêu chuẩn thống kê thu kết quả: Đối với tiêu chiều dài chồi, Ftt = 35,6176 >F05 tra bảng = 1,9624 Kết cho thấy nồng độ Kinetin BAP sử dụng dạng riêng lẻ có ảnh hưởng rõ rệt đến chiều dài chồi Keo lai Kết cho phép xác định cơng thức có ảnh hưởng trội đến kết thí nghiệm cách so sánh tiêu nghiên cứu hai công thức có ảnh hưởng tốt đến kết thí nghiệm So sánh số lượng chồi chiều dài chồi công thức bổ sung BAP 1.5 mg/l công thức bổ sung BAP2.0 mg/l kết quả: Về chiều dài chồi có /t/ = 0,16 < t05 tra bảng = 1,96 Các kết cho phép chấp nhận giả thuyết H0, chọn cơng thức: MS* + 1,0 mg/l BAP MS*+ 1,5 mg/l BAP làm công thức tốt để nhân chồi kéo dài chồi nhân giống in vitro Keo lai 3.3.2 Ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến hệ số nhân chiều dài chồi Keo Kết cho thấy MS* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l môi trường tốt số thí nghiệm tiến hành Song chất lượng chồi thu chưa mong đợi Chính thế, nghiên cứu bổ sung thêm NAA nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 mg/l NAA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, chất có tác dụng làm tăng khả hơ hấp mơ, tăng hoạt tính enzim ảnh hưởng mạnh đến trao đổi N tiếp nhân bon mơi trường Ở nồng độ thích hợp NAA cịn có vai trị kích thích sinh trưởng, phân chia tế bào kích thích tạo rễ Vì thế, bổ sung Auxin vào mơi trường có Cytokinin tác dụng kích thích chồi cứng cáp phát triển cách hài hoà số lượng chất lượng Nhờ đó, tỷ lệ chồi đủ tiêu chuẩn để chuyển sang môi trường tạo rễ tăng đáng kể Số liệu thu thập sau 30 ngày nuôi cấy tổng hợp bảng sau Bảng 05: Ảnh hưởng phối hợp BAP NAA tới tạo cụm chồi Môi trường MS* + Công BAP1,5 mg/l + thức Số chồi/cụm T.b Chiều dài chồi(cm) Sd T.b Sd NAA 0.0 mg/l ĐC 6,73 2,0 6,40 1,0 NAA 0,25 mg/l N1 6.5 1.2 6,3 1,1 NAA 0,5mg/l N2 6,6 1,6 6,7 0,87 NAA 0,75mg/l N3 6,5 1.1 6,4 1,03 NAA 1,00 mg/l N4 6,2 1.3 6,2 0,75 NAA 1,25 mg/l N5 6.1 1,3 5,9 0,71 6.8 6.6 6.4 6.2 5.8 5.6 5.4 Số chồi/ Cụm ĐC N1 Chiều dài chồi (cm) N2 N3 N4 N5 Biểu đồ 03: Ảnh hưởng phối hợp BAP NAA tới tạo cụm chồi Hệ số nhân chồi tất cơng thức có bổ sung NAA thấp đối chứng chứng tỏ việc bổ sung NAA vào mơi trường ni cấy có hàm lượng BAP 1.5 mg/l làm giảm hệ số nhân chồi Hàm lượng chất cao, hệ số nhân chồi giảm mức giảm không đáng kể Sai dị số lượng chồi lại theo chiều hướng ngược lại tăng hàm lượng NAA chứng tỏ tăng hàm lượng chất làm cho phân hóa tạo chồi có xu hướng ổn định Chiều dài sai dị chiều dài chồi cơng thức có bổ sung NAA có sai khác so với đối chứng theo xu hưởng tỷ lệ nghịch với hàm lượng NAA Kết kiểm tra sai khác chiều dài chồi phân tích phương sai cho thấy: Chiều dài chồi có FA = 6,3881 > F05 tra bảng = 2,6559 Kết chứng tỏ nhân tố nghiên cứu - hàm lượng NAA có ảnh hưởng rõ rệt đến tiêu nghiên cứu Do đó, chúng tơi tiến hành so sánh hệ số nhân chồi cặp cơng thức có trị số lớn cơng thức bổ sung 0.5 mg/l NAA đối chứng để tìm cơng thức có ảnh hưởng trội đến kết thí nghiệm Kết tính tốn t =1,97 > t05 tra bảng = 1,96 ; bổ sung 0.5 mg/l NAA khơng có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi Về nguyên lý chọn công thức làm công thức tốt cho mục tiêu hệ số nhân chồi Mặc dù công thức mơi trưịng MS* + BAP 1,5 mg/l + NAA 0,5mg/l cho hệ số nhân chồi không sai khác với đối chứng, số chồi thu có chất lượng tốt, tương đối đồng (thể sai tiêu chuẩn thấp cơng thức đối chứng) có chiều cao từ cm trở lên đủ tiêu chuẩn cho trình rễ Chất lượng chồi thu có bổ sung NAA cao Tóm lại: Các kết phân tích kết nghiên cứu mục 3.3.1 3.3.2 cho phép xác định môi trường tốt để nhân nhanh chồi Keo lai MS* + BAP 1.5 mg/lít + NAA 0.5 mg/lít Sử dụng mơi trường này, đạt hệ số nhân chồi 6.6, chiều cao trung bình chồi 6.7 cm sai tiêu chuẩn chiều cao chồi 0,87 cm Với giả thiết phân bố số lượng theo chiều dài chồi có dạng chuẩn tiệm cận chuẩn, ước lượng chiều dài trung bình chồi 95% số chồi tạo nằm khoảng chiều dài từ 4.9 cm đến 8.3 cm Thời gian hoàn thành chu kỳ nhân chồi môi trường 25 ngày Các chồi tạo trẻ hóa mức cao độ - xuất thật mầm mọc từ hạt (ảnh dưới) (MS* +BAP 1.5mg/l) (MS* +BAP 1.5mg/l + NAA0.5mgg/l) Ảnh 3: Ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến hệ số nhân chiều dài chồi Keo 3.3.3 Ảnh hƣởng IBA NAA đến rễ chồi Keo lai IBA NAA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, nồng độ thích hợp, chất có tác dụng kích thích hình thành rễ bất định Đây hoạt chất thường sử dụng để tạo rễ cho chồi đủ tiêu chuẩn tạo giai đoạn nhân nhanh chồi để tạo hồn chỉnh Chồi keo lai dễ rễ mơi trường ni cấy in vitro - rễ mơi trường MS có cải tiến, chất lượng rễ khơng đảm bảo Vì nghiên cứu bổ sung Auxin việc làm cần thiết Để xác định mơi trường rễ thích hợp cho đối tượng nghiên cứu, Môi trường sử dụng nửa chất đa lượng vi lượng môi trường MS cải tiến (1/2MS*) bổ sung thêm Auxin: IBA NAA nồng độ khác Các chồi cho rễ nuôi cấy điều kiện trình nhân chồi , sau 20 ngày nuôi cấy số liệu tỷ lệ rễ chiều dài rễ thu thập Kết tổng hợp bảng 06 Biểu đồ 04 đến 06 Bảng 06: Kết thí nghiệm kích thích tạo rễ cho dịng Keo Mơi trường 1/2 Cơng MS* thức Dịng Tỷ lệ rễ Chiều dài rễ Số rễ trung (%) (cm) bình/chồi Đối chứng ĐC 36,3 2,97 2,7 IBA 0,5 mg/l I1 54,2 5,18 4,1 IBA 1,0 mg/l I2 69,6 5,20 4,6 IBA 1,5 mg/l I3 76,3 6,43 5,8 IBA 2,0 mg/l I4 60,7 5,85 4,5 NAA 0,5 mg/l N1 43,0 3,71 4,0 NAA1,0 mg/l N2 40,7 3,79 3,7 NAA 1,5 mg/l N3 59,3 3,74 3,9 NAA 2,0 mg/l N4 52,6 2,80 3,2 80 Tỷ lệ rễ (%) 70 ĐC I1 I2 I3 I4 N1 N2 N3 N4 60 50 40 30 20 10 Biểu đồ 04: Ảnh hưởng chất kích thích rễ đến tỷ lệ rễ Chiều dài Rễ (cm) ĐC I1 I2 I3 I4 N1 N2 N3 N4 Biểu đồ 05: Ảnh hưởng chất kích thích rễ đên chiều dài rễ Số rễ trung bình/ ĐC I1 I2 I3 I4 N1 N2 N3 N4 Biểu đồ 06: Ảnh hưởng chất kích thích rễ đến số rễ Ảnh 07: Chồi keo sau 20 ngày cấy rễ Khi sử dụng môi trường I3( 1/2 MS* + IBA1,5 mg/l) Các chồi Keo lai dòng MA1 tương đối dễ rễ, không cần sử dụng Auxin thu 36.3% số chồi có rễ Tuy tất công thức xử lý IBA NAA có tỷ lệ chồi rễ, số rễ bình quân chồi chiều dài rễ tốt đối chứng Kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi rễ đạt từ 54,4% - 76,3%, tỷ lệ rễ sử dụng NAA nồng độ khác đạt từ 40,7% - 59,3 % thấp so với IBA Điều cho thấy nồng độ IAA, IBA có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ chồi rễ Khi tăng nồng độ IBA, tỷ lệ chồi rễ, chiều dài rễ số rễ trung bình chồi tăng lên tương ứng, đạt giá trị lớn hàm lượng 1.5 mg/lít sau bắt đầu giảm Biến đổi cho thấy sử dụng IBA để kích thích rễ, 1.5 mg/lít hàm lượng tối ưu Đối với NAA có tượng tương tự hàm lượng tối ưu sử dụng chất để kích thích rễ 1.5mg/lít Kết thí nghiệm cho thấy, IBA có tác dụng mạnh mẽ đến rễ so với NAA So sánh tỷ lệ chồi rễ, chiều dài rễ số rễ trung bình chồi cơng thức tối ưu sử dụng IBA (1.5mg/lit) công thức tối ưu sử dụng NAA (1.5mg/l) nhận thấy trị số trung bình cơng thức sử dụng IBA cao NAA Kiểm tra tiêu chiều dài rễ phương pháp thống kê Về chiều dài rễ, có t = 2,46 > t05 tra bảng =1,96 Như môi trường rễ cho Keo lai 1/2 MS* + 1.5mg/lit IBA, thời gian cần thiết để hoàn thành rễ 20 ngày tỷ lệ chồi có rễ 76,3 % Hình 11: Hình ảnh Keo lai nhân tạo 1,5 tháng tuôỉ vườn ươm PHẦN V KẾT LUẬN – TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 5.1 Kết Luận Cơng thức khử trùng thích hợp cho dòng Keo lai MA1 HgCl2 với nồng độ 0,1% thời gian khử trùng 10 phút Theo cách này, thu 48.15% mẫu 19% số mẫu có chồi (cấy mơi trường MS* có bổ sung BAP 0.5 mg/l) Môi trường nuôi cấy cho đối tượng thí nghiệm mơi trường MS có thay đổi tỷ lệ chất khống bổ sung thêm số Vitamin acid amin cần thiết Mơi trường nhân chồi thích hợp cho dịng Keo lai nghiên cứu MS* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l Môi trường tiền rễ hay môi trường nâng cao chất lượng chồi cho dòng nghiên cứu mơi trường MS* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l kết hợp với nồng độ NAA nồng độ 0,5mg/l Mơi trường tạo rễ thích hợp cho dịng Keo lai nhân tạo nghiên cứu ½ MS* bổ sung IBA nồng độ IBA 1,5mg/l Các chồi rễ chăm sóc theo kết nghiên cứu nhân giống Keo lai nhân tạo trước cho tỷ lệ sống cao 85% sinh trưởng tốt, khoẻ mạnh 5.2 Tồn Tại - Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên chưa tiến hành thí nghiệm xác định mùa vụ khử trùng thích hợp cho đối tượng nghiên cứu - Chưa xác định mùa vụ rễ thích hợp huấn luyện thích hợp 5.3 Khiến nghị - Cần tiếp tục nghiên cứu thêm môi trường nhân chồi rễ thích hợp cho dịng - Thử nghiệm thêm số phưong pháp nhân giống cho Keo lai có hiệu Phụ Biểu 01: Thành phần mơi trƣờng Murashige Skoog minimal (MS) Dung Hố chất dịch A B C Nồng Số ml dung dịch mẹ cần cho 1000ml độ dung dịch làm việc EDTA 0.80 Fe2(SO4)3 0.38 NH4NO3 82.50 KNO3 95.00 H3PO4 1.24 KH2PO4 34.00 KI 0.166 28 20 NA2MoO4.2H2O 0.050 D E CoCl2.6H2O 74.00 MgSO4.7H2O 4.46 MnSO4.4H2O 1.72 ZnSO4.7H2O 0.005 CuSO4.5H2O 88.00 CaCl2.2H2O 0.02 Thiamine HCl 0.10 Axits nicotinic 0.10 F 5 Pyridoxine HCl 0.40 Glyeine 0.10 G NAA 0.40 H Kinetin 0.5 Phụ biểu 02: Thành phần môi trƣờng WPM Thành phần Nồng độ Muối khoáng 400.0 NH4NO3 990.0 K2SO4 556.0 Ca(NO3.4H2O)2 96.0 CaCl2.2H2O 170.0 KH2PO4 370.0 MgSO4.7H2O 2.23 ZnSO4.7H2O 8.6 CuSO4.5H2O 0.025 H3BO3 6.2 10 Na2MoO4.2H2O 0.25 11 FeSO4.7H2O 27.84 12 Na2EDTA 37.24 TT Vitamin chất hữu 13 B1 1.0 14 Nicotinic axit 0.5 15 B6 0.5 16 Glyxin 2.0 17 Myo- inositol 100.0 Phụ biểu 03: Thành phần môi trƣờng B5: (Gamborg et al, 1976) Thành phần mơi trƣờng Đa lượng Vi lượng Muối khống (NH4)2SO4 134 CaCl2.H20 150 MgSO4.7H20 246 KNO3 2528 NaH2PO4.H2O 150 H3PO3 3,0 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 MnSO4.H2O 10 KI 0,75 Na2MoO4.2H20 0,25 ZnSO4.7H2O 2,0 Na2EDTA.2H20 37,2 Myo- Inositol 100 Pyridoxine HCl 1,0 2,4-D Các chất hữu Nồng độ (mg/l) 0,1-1,0 Nicotinic acid 1,0 Thiamine HCl 10 Kinetin 0,1 Sucrose 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO VÀ SỬ DỤNG 1.Lê Đình Khả (1999) Nghiên cứu sử dụng giống lai tự nhiên Keo tai tượng Keo tràm Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà nội Trang 170-172 2.Đoàn Thị Mai, cộng sự, 2001 Nhân Giống cho số giống rừng có suất cao Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội 11/2001 Đoàn Thị Mai, Trần Hồ Quang, Ngô Minh Duyên (1998), “Kỹ thuật nhân giống Keo lai nuôi cấy mô phân sinh”, Tạp chí Lâm nghiệp tháng 7, trang 35, 36 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005) Công nghệ sinh học, tập NXB Giáo Dục Vũ Thị Ngọc (2008) “ Nghiên cứu nhân giống số dịng Keo lai tự nhiên phương pháp ni cấy mơ In-vitro”, Khố luận tốt nghiệp trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên- Đại học Quốc Gia Hà nội Vũ Thị Thu Hiền (2006).” Nghiên cứu nhân giống Hông (Paulownia Fortunel (seem.) Bằng phương pháp nuôi cấy In vitro” Khố luận tốt nghiệp trường ĐHLN Lê Đình Khả (2006) Lai giống rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu chuyển giao kỹ thuật nuôi cấy mô (2001) Trung tâm nghiên cứu giống rừng, Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam Nguyễn Trọng Trí, Bài Giảng Công Nghệ Sinh Học, Trường Đai học Lâm nghiệp NHẬT KÍ THỰC TẬP: Địa điểm thực tập: Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội Kế hoạch thực hiện: Thời gian Nội dung thực Ngày 12 - 22/02/ 2009 Xây dựng đề cương chi tiết Ngày 15/ 1/ 2009 Đến sở thực tập Ngày 23/ 02/ 2009 Nhận giấy định thực tập Ngày 25/ 02/ 2009 Xin giấy giới thiệu thực tập Ngày 17/ 01/ - 23 /02/ 2009 Tiến hành nuôi cấy vào môi trường nhân nhanh Ngày 23/ 02 - 25/02/2009 Tiến hành thu thập số liệu môi trường nhân nhanh Ngày 25/02 - 15/ 03/ 2009 Tiến hành nuôi cấy vào môi trường rễ Ngày 16/03 - 17/ 03/ 2009 Thu thập số liệu tiền rễ Ngày 18/03 - 15/ 04 /2009 Tiến hành thí nghiệm ni cấy vào mơi trường rễ Ngày 15/04 - 18/ 04 /2009 Thu thập số liệu môi trường rễ Ngày 19/ 04 - 30/ 04/ 2009 Xử lý nội nghiệp số liệu thu viết khoá luận Ngày 01 - 06/ 05/2009 Duyệt khoá luận lần Ngày 07/ 05/ 2009 Tiếp tục hoàn thành khóa luận Ngày 10/ 05/2009 Duyệt khố luận lần Ngày 15/ 05/ 2009 In Khoá luận Ngày 18/ 05/ 2009 Nộp khoá luận Ngày 18/ 05 - 30/ 05/ 2009 Chuẩn bị cho cơng tác bảo vệ khố luận LỜI MỞ ĐẦU Để hồn tất chương trình đào tạo kĩ sư Trường Đại học Lâm nghiệp giúp sinh viên có điều kiện làm quen với cơng tác nghiên cứu khoa học Được đồng ý Ban chủ nhiệm khoa Lâm học, môn Giống Công nghệ sinh học, Trung tâm nghiên cứu Giống rừng thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam tiến hành thực đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu nhân giống dòng Keo lai nhân tạo chọn tạo MA1 phương pháp nuôi cấy mô tế bào” Sau thời gian thực tập nghiên cứu với tinh thần làm việc khẩn trương nghiêm túc, đến khố luận hồn thành Trong q trình thực tập nhận quan tâm, giúp đỡ tận tình cá nhân quan, Trước hết tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới: Thầy Kiều Văn Thịnh cán giảng dạy môn Giống Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Lâm Nghiệp Thạc sĩ Đoàn Thi Mai, Cán Trung tâm nghiên cứu Giống cấy rừng, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam Là người trực tiếp hướng dẫn, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khố luận suốt thời gian qua Nhân dịp xin chân thành tập thể cán Trung tâm nghiên cứu Giống rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt nam đóng góp, giúp đỡ ý kiến xây dựng q báu q trình thực khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán Khoa Lâm học - Trường Đại Học Lâm Nghiệp dạy dỗ, dìu dắt tơi suốt thời gian học tập vừa qua Cuối xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè ln động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực hiên: Nguyễn Thị Thu Thuỷ ... triển giống lai chọn tạo sản xuất đại trà PHẦN I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở khoa học nhân giống nuôi cấy mô tế bào Nhân giống nuôi cấy mô - tế bào phương pháp nhân giống thực nuôi cấy. .. khám phá quy trình số sở nuôi cấy mô - tế bào thực vật nước ta Đề tài ? ?Nghiên cứu nhân giống Keo lai nhân tạo chọn tạo phương pháp nuôi cấy mơ” đặt nhằm góp phần giải vấn đề tạo thêm điều kiện thuận... tâm nghiên cứu Giống rừng thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam tiến hành thực đề tài tốt nghiệp: ? ?Nghiên cứu nhân giống dòng Keo lai nhân tạo chọn tạo MA1 phương pháp nuôi cấy mô tế bào? ?? Sau