Bước đầu nghiên cứu nhân giống cây long não cinnamomum camphora bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY LONG NÃO (Cinnamomum Camphora (L.) Presl) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Văn Phong Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thương Mã sinh viên : 1453070293 Lớp : 59A - CNSH Khóa học : 2014 - 2018 Hà Nội, 2018 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành để tài khóa luận tốt nghiệp này, em nhận hướng dẫn, bảo tận tình Quý Thầy Cô lời chia sẻ, giúp đỡ, động viên bạn Nhân dịp này, cho phép em xin gửi lời tri ân: Trước hết, em xin ch n thành cảm n thể nghiệp, c c c n ộ c c Thầy n nh đạo Viện CNSH Lâm gi o củ Viện ng nghệ sinh học m nghiệp đ tạo điều iện tốt qu tr nh thực đề tài nghi n cứu Tiếp theo, em xin gửi ời iết n s u sắc đến Thầy TS.Nguyễn Văn Phong, giảng viên Bộ môn công nghệ gen, Viện CNSH Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đ tận t nh hướng ẫn em ng y ngày đầu t y vào nghi n cứu để hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Em xin gửi lời cảm n đến Tập thể Cán Bộ môn Công nghệ gen, Thầy Cơ cán phịng thí nghiệm đ tạo điều kiện thuận lợi hoàn thành tốt đề tài uối c ng, em xin gửi ời cảm n tới gi đ nh, ạn người th n đ u n u n h ch ệ, động vi n tạo điều iện thuận ợi cho chúng em học tập nghi n cứu ho học Tuy đ cố gắng để hoàn thiện đề tài nghi n cứu này, song iến thức, inh nghiệm củ em c n hạn chế, v ản tr nh h i s i s t tồn tại, đ nh gi , để ản oc o h uận tốt nghiệp h ng nh mong qu Thầy đ ng g p o c o củ em hoàn thiện h n N i ng 14 tháng năm n v nt c ện Nguyễn Thị T ƣơng ii iến MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ HƯƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Long Não 1.1.1 Vị trí, phân loại, nguồn gốc phân bố 1.1.2 Giá trị Long Não 1.1.3 Thành phần hóa học tinh dầu Long Não 1.1.4 Công dụng tinh dầu Long Não 1.2 c hướng nhân giống Long Não 1.3 Thành tựu nhân giống in vitro 1.3.1 Một số thành tựu nhân giống in vitro thân gỗ 1.3.2 Thành tựu nuôi cấy in vitro thuộc chi long não 11 HƯƠNG MỤC TIÊU, VÂT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 14 2.1 Mục tiêu 14 2.1.1 Mục tiêu chung 14 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Vật liệu, thời gi n đị điểm nghiên cứu 14 Phư ng ph p nghi n cứu 15 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 15 Phư ng ph p tr ng m i trường dụng cụ thủy tinh 15 Phư ng ph p trùng vật liệu vào mẫu 16 4 Phư ng ph p nu i cấy tạo đ chồi 17 iii Phư ng ph p nu i cấy tạo hoàn chỉnh 18 Phư ng ph p xử lý thống kê số liệu 18 HƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết tạo mẫu 20 3.2 Kết nghiên cứu tạo đ chồi……………………………………………25 3.3 Kết thăm ảnh hưởng IBA tới khả r rễ tạo hoàn chỉnh 27 HƯƠNG KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 30 4.1 Kết luận 30 4.2 Tồn 30 4.3 Kiến nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết đầy đủ Từ viết tắt BAP Benzylamino purine-6 Cs Cộng CT Công thức CTNC Công thức nghiên cứu ĐHST Điều h IAA Indo-3-acetic acid IBA Indole butyric acid Kinetin 6- Furfury Amino Purine 10 MS Murashige & Skoong, 1962 TB Trung bình 11 WPM Woody Plant Medium v sinh trưởng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Cơng thức thí nghiệm khử trùng vật liệu đoạn cành Long Não nuôi cấy m i trường MS 16 Bảng 2.2 Công thức thí nghiệm khử trùng vật liệu đoạn cành Long Não nuôi cấy m i trường WPM 17 Bảng 2.3 Công thức m i trường nuôi cấy tạo đ chồi từ đoạn thân in vitro 17 Bảng 2.4 Cơng thức ni cấy tạo hồn chỉnh 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng tới tỷ lệ tái sinh đoạn thân ong n o m i trường MS 21 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng tới tỷ lệ tái sinh đoạn thân ong n o m i trường WPM 22 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất điều h sinh trưởng tới khả tạo đ chồi long não tuần 24 Bảng 3.4 Kết thăm ảnh hưởng Auxin tới khả r rễ tạo in vitro hoàn chỉnh 27 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Lá, hoa Long Não H nh Đặc điểm hình thái hoa Long Não Hình 1.3 Cơng thức hóa học hợp chất có tinh dầu Long Não có tác dụng chữa bệnh Hình 1.4 Một số loại tinh dầu ong N o đ ng sản xuất sử dụng Hình 3.1 Biểu đồ thể ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% m i trường MS 21 Hình 3.2 Kết tạo mẫu Long Não sau 60 ngày theo dõi 21 Hình 3.3 Biểu đồ thể ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% m i trường WPM 22 Hình 3.4 Kết mẫu Long Não sau 60 ngày nuôi cấy m i trường WPM 23 Hình 3.5 Biểu đồ thể ảnh hưởng củ hàm ượng AP inetin đến hệ số nhân chồi in vitro 24 Hình 3.6 Kết nhân nhanh Long Não sau tuần quan sát môi trường nuôi cấy 25 Hình 3.7 Kết tạo cụm chồi ong N o m i trường LP6 26 Hình 3.8 Kết thăm ảnh hưởng IBA tới khả r rễ tạo Long Não in vitro hồn chỉnh sau 60 ngày ni cấy 28 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Long Não (Cinnamomum Camphora (L.) Presl) hay cịn gọi rã hư ng ồi c y th n gỗ, lớn thường xanh Cây có nguồn gốc từ nước Đ ng Á ( hu vực Đài o n, miền nam Nhật Bản, đ ng n m Trung Quốc nước Đ ng Dư ng ) Tại đ y người trồng n để sản xuất tinh dầu long não Gỗ Long Não không bị côn trùng phá hoại, thường sử dụng làm vật liệu gỗ nh gi đình ( tráp, hộp, chuỗi hạt…) tinh ầu ong n o sử dụng nhiều c c ĩnh vực y tế, kỹ thuật, gia vị Tinh dầu chưng cất từ tát phận củ c y c c oại gỗ nghiền nh , rễ, cành non… Tuy nhiên việc nhân giống chủ yếu dựa vào nảy mầm hạt với tỷ lệ nảy mầm không cao, phẩm chất di truyền h ng đồng đều, phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết Cho nên, việc nhân giống Long Não phư ng ph p nu i cấy m giúp àm tăng th m nguồn vật liệu giống có chất ượng tốt, phẩm chất di truyền đồng đều, giữ nguy n đặc tính tốt mẹ chọn Điểm quan trọng, phư ng ph p sản xuất số ượng lớn thời gian ngắn, bệnh, trồng qu nh năm Xuất phát từ đ , t i tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu nhân giống Long Não (Cinnamomum Camphora (L.) Presl) p ƣơng p áp nuô cấy mô tế bào” với mục đ ch uy tr oài, cung cấp vật liệu giống trồng sản xuất tinh dầu long não CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Long Não 1.1.1 Vị trí, phân loại, nguồn gốc phân bố Phân loại Tên Việt Nam: Cây Long Não Tên latin: Cinnamomum Camphora (L.) Presl Bộ: Laurales Họ: Lauraceae Chi: Cinnamomum Loài: C.Camphora Tên gọi khác: c y R Hư ng, Hình 1.1 Lá, hoa Long Não Phân bố Có nguồn gốc khu vực Đ ng Á, o gồm Đài o n, miền nam Nhật Bản, đ ng n m Trung Quốc c c nước Đ ng Dư ng N trồng khu vực ven bờ biển Đen khu vực Kavkaz ong n o trồng từ u đời khai thác camphor từ kỷ XIII N i ph t triển nhiều Đài o n, Nhật Bản, c c nước v ng Đ ng N m Á, Bắc Mỹ, Bắc Phi, miền N m nước Pháp Ở Việt N m, ong n o trồng từ thời Pháp thuộc Hà Giang sau 1954 c trồng tỉnh miền núi Ở thành phố lớn, ong n o trồng làm cho bóng mát Đặc đ ểm hình thái Thân Long Não: thuộc lồi thân gỗ, lớn thường xanh, có chiều cao từ 20-30m, có cao tới 40m với đường kính 200cm, v thân dày nứt nẻ Long N o c y tư ng đối s ng, h hậu ấm ẩm Cây mọc tốt tr n đất sét pha tầng dày, không sống tr n đất mặn, đất trũng khơ hạn Trong điều kiện thích hợp, Long Não tái sinh từ hạt chồi tốt Hìn 1.2 Đặc đ ểm hình thái hoa Long Não Lá long não: tán rộng x nh qu nh năm, mọc so le có cuống dài,ở kẽ gân gân bên lên tuyến nh , có khả hấp thị ion nặng làm m i trường Các nhẵn bóng, bề mặt s p c m i ong n o bị vò nát tay Về mùa xuân sinh màu xanh lục nhạt Hoa Long Não: hoa nh , màu trắng mọc thành chùm kẽ đẹp c m i th m M ho từ tháng 3-4 Quả mọng hi ch n c màu đen thuộc loại mọng, mọc thành cụm với đường kính khoảng cm Quả chín tháng 10-11 Gỗ Long Não: có màu hồng, loại gỗ chịu nước, không bị mối mọt phá hoại lại c m i th m n n sử dụng nhiều việc tạo 0.3-0.5mg/l Và đạt kết cao nhât kết hợp 1.5mg/l BAP + 0.5mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi cao (4.8 chồi/cụm), chất ượng chồi tốt Đối với m i trường bổ sung 1.5mg/l BAP kết hợp với kinetin với hàm ượng từ 0.5- 0.9mg/l hệ số nhân chồi giảm dần Nguyên nhân do: tỷ lệ Auxin nội sinh kết hợp với Cytokinin ngoại sinh kết hợp với kích thích hay ức chế phát triển chồi Với nồng độ BAP 1,5mg/l + kinetin có nồng độ 0.3-0.9ml/l kết hợp với auxin nội sinh chồi kích thích tạo đ chồi với tỷ lệ tăng ần tới đạt tới ngưỡng cao Với 1.5mg/l BAP +0.5- 0.9mg/l kinetin kết hợp với auxin nội sinh tạo nên ượng lớn chất điều h sinh trưởng vượt mức cần thiết làm ức chế khả tạo chồi hệ số nhân chồi giảm dần Như vậy, với m i trường có bổ sung 1.5mg/l BAP + 0.3-0.9 mg/l kinetin bổ sung BAP với 0.5mg/l kinetin kết hợp với auxin nội sinh m i trường phù hợp tạo cụm chồi, kích thích phát triển chồi tốt A- 80 ngày B- 100 ngày Hình 3.7 Kết tạo cụm chồ Long Não mô trƣờng LP6 Kết thu củ đề tài gần với kết thu từ nghiên cứu nhân giống Long Não K Nirmal Babu cs (2002-2003) đ c ng ố: Số chồi TB tạo thành 13.962 chồi/ cụm nuôi cấy m i trường WPM bổ sung 13.32 mM BAP + 4.65 mM kinetin Kết cho thấy tư ng đồng với kết nghiên cứu nhân giống tạo cụm chồi Re Hư ng Khuất Hải Ninh cs (2017) với m i trường MS có bổ sung 2.2mg/l BAP + 0.1 mg/l kinetin + 0.1mg/l NAA cho hệ số nhân chồi 3.5 chồi / mẫu thời gian 80 26 ngày chồi đạt 2.2cm Tuy nhiên, so với kết nghiên cứu c y V Hư ng nghiên cứu nhân giống tác giả Nguyễn Văn Phong cs (2009) cho thấy hệ số nhân chồi c o h n, thời gian tạo cụm chồi Long Não lại u h n Đ y o đặc tính sinh lý lồi Long Não thân gỗ lâu năm, sinh trưởng phát triển tư ng đối chậm, nhiều khả chồi Long Não có nồng độ chất điều h sinh trưởng nội sinh thấp Vậy nên, cấy chồi Long N o vào m i trường có bổ sung nồng độ BAP kinetin cao cụm chồi hình thành, phát triển chậm h n so với loài khác 3.3 Kết t ăm dò ản ƣởng IBA tới khả rễ tạo hồn chỉnh Trong ni cấy mơ tế bào thực vật, điều khiển biệt hóa chồi rễ giai đoạn cuối c ng để tạo hồn chỉnh (có thân, lá, rễ đầy đủ) Hầu hết cấc loài trồng sử dụng chất điều h sinh trưởng thuộc nhóm Auxin (NAA, I A…) có tác dụng kích thích chồi rễ nhiên, lồi trồng có t ch ũy uxin nội sinh khác nhau, cần x c định hàm ượng auxin ngoại sinh bổ sung thích hợp cho rễ in vitro loài cụ thể Do thời gian nghiên cứu kinh nghiệm thân hạn chế, nội dung nghiên cứu m i trường rễ thiết kế lần lặp với kết thể bảng s u: Bảng 3.4 Kết t ăm dò ản ƣởng Auxin tới khả rễ tạo in vitro hoàn chỉnh STT CTNC Chất ĐH T IBA (mg/l) Số lƣợng mẫu cấy Tỷ lệ rễ (%) Số rễ TB/ chồi Chất lƣợng rễ 25 - - Đ RR1 0,5 25 12 + RR2 0,7 25 32 1.75 ++ RR3 0,9 25 64 3.29 +++ RR4 1.2 25 48 2.25 ++ 27 Chú ý: +: chất lượng rễ kém, mảnh, rễ phụ ++: chất lượng rễ trung bình, rễ mảnh,ngắn, trắng +++: chất lượng rễ tốt, rễ mập,dài, cứng, trắng, nhiều rễ phụ Hình 3.8 Kết t ăm dị ản ƣởng IBA tới khả rễ tạo Long Não in vitro hoàn chỉnh sau 60 ngày nuôi cấy Sau tiến hành thăm ảnh hưởng củ hàm ượng IBA tới khả r rễ tạo hoàn chỉnh Long Não sau 60 theo dõi, ta thấy: Chồi Long Não cấy chuyển vào m i trường MS khơng bổ sung IBA khơng có khả r rễ Khi bổ sung IBA với hàm ượng từ 0.5-0 mg/ m i trường ni cấy có khả ch th ch chồi rễ, đặc biệt với hàm ượng 0.9 mg/l cho tỷ lệ chồi rễ c o h n số rễ chồi nhiều h n (3 29 rễ/ chồi) với chất ượng rễ tốt h n, rễ mập, dài, cứng Khi bổ sung IBA với hàm ượng 2mg/ m i trường nuôi cấy, tỷ lệ chồi rễ số rễ trung bình/ chồi thấp h n so với ni cấy m i trường RR3 o hàm ượng chất điều h sinh trưởng cao gây ức chế khả r rễ tạo in vitro hồn chỉnh Vì mà số rễ trung bình tạo thành m i trường RR4 thấp, chất ượng rễ ém h n ( rễ mảnh,ngắn, yếu) so với rễ chồi cấy m i trường RR3 28 Như vậy, s u hi thăm th t thấy m i trường RR3 thích hợp cho việc rễ in vitro Long Não với công thức MS + 0.9mg/l IBA + 20g/ đường sucrose + 7g/l agar Kết gần với kết nghiên cứu Sharma H cs (2010), nghiên cứu t m m i trường thích hợp rễ Long Não MS +1mg/l IBA 29 CHƢƠNG KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đề tài đ thiết lập công thức tạo mẫu cho Long Não cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao sử dụng HgCl2 0.1% phút - Thiết lập công thức nh n đ chồi m i trường MS có bổ sung 1.5 mg/l BAP + 0.5 mg/l kinetin cho số chồi trung bình cụm chồi cao (4.70 chồi/cụm) - T m m i trường thích hợp cho rễ Long Não in vitro với công thức MS +0.9mg/l IBA cho tỷ lệ chồi rễ cao (44%), số rễ trung bình cao (3.29 rễ/ chồi) chất ượng rễ tốt, rễ dài, mập, cứng nhiều rễ phụ 4.2 Tồn Trong khuôn khổ thời gian nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp sinh viên đề tài chư có thời gian điều kiện nghiên cứu công thức rễ tạo in vitro hoàn chỉnh kỹ thuật huấn luyện chăm s c c y gi i đoạn vườn m 4.3 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu gi n đoạn rễ tạo in vitro hoàn chỉnh huần luyện c y con, chăm s c c y gi i đoạn vườn m 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đinh Thị Huyền (2006) “Nghiên cứu nhân giống Vù ương (Cinamomum balansae) tràm dài ( Melaleca leucadendra) phương pháp nuôi cấ in vitro”, khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp Đoàn Thị Mai cs (2011), “Nghiên cứu nhân nhanh giống keo lai tự nhiên, keo lai nhân tạo, bạch đ n Uro bạch đ n lai nhân tạo lát hoa công nghệ tế b o”, báo cáo kết khoa học công nghệ đề tài, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam Khuất Thị Hải Ninh cs (2017), “nghiên cứu nhân giống in vitro re hương cinnamomum parthenox lon (jack) meisn”, tạp chí khoa học công nghệ lâm nghiệp Nguyễn Th nh D nh, Xu n Đắc, Lê Thị Xuân (2005), “kết bước đầu nhân giống in vitro câ Vù ương (Cinamomum balanse Lecomte) kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học” Những vấn đề c ản sống khoa học sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 03/11/2005, NXB Khoa học Kỹ thuật, 450453 Nguyễn Thị Qúy cs (2014), “Quá trình phát sinh hình thái mơ sẹo chồi long não (Cinnamomum Camphora (L.) sieb.) nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 12, số 7: 1034-1041 Nguyễn Thiện Tịch cs (1988); Võ Bạch M i (1996), “nhân giống in vitro câ Giáng ương (Pterocarpus macrocapus) Nguyễn Văn Phong cs (2009), “Nhân giống Vù ương để tạo nguồn giống phục vụ chương trình l m gi u rừng” tạp chí kinh tế sinh thái số 27, 46-50 Nguyễn Văn Phong cs (2014), “Nhân giống Thông Caribe (pinus caribaea Morelet) phư ng ph p nu i cấy in vitro, tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thơn, 107-112 Nguyễn Văn Phong cs (2016), “ Nghiên cứu hệ thống tái sinh Xoan ta in vitro từ xoan ta tr i” tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, 5864 Tài liệu tiếng Anh 10 “plant ph siolog ” 11 Albert Sasson (1988),Biotechnologies and development 12 Azad M A K., Yokota S., Ishiguri F., Yahara S., Yoshizawa N (2005) Large-scale clonal propagation of Cinnamomum camphora (L.) nees and eberm, Bull Utsunomiya Univ For: 41 13 Chelliah D A., Biological Activity Prediction of an Ethno Medicinal Plant Cinnamomum camphora Through Bio-informatics, 2008 Ethnobotanical Leaflets 12, 181-190 14 Grbic, G et al., Effect Of Camphor Essential Oil On Rat Cerebral Cortex Activity As Manifested By Fractal Dimension Changes, 2008 Arch Biol Sci 60, 547-553 15 Hiroki, T et al., Identification of Dimethylmatairesinol as an Immunoglobulin E-suppressing component of the leaves of Cinnamomum camphora, 2011 Journal of Health Science 57, 184-187 16 Huang L.C., Huang B.L., Murashige T (1998) A micropropagation protocol for Cinnamomum camphora, In vitro Cell Dev Biol Plant, 34: 141-146 17 Hye, Ja L et al., In vitro anti-inflammatory and anti-oxidative effects of Cinnamomum camphora extracts, 2006 Journal of Ethnopharmacology 103, 208-216 18 InomotoY & Kitani Y(1989) In vitro propagation of Cinnamomum cassia Plant Tiss Cult Lett 6: 25–271 19 Jadhav, M.V et al., Effect of Cinnamomum camphora on human sperm motility and sperm viability, 2010 Journal of Clinical Research Letters 1, 1-10 20 Jamshidzadeh, A et al., Effects of Camphor on Sexual Behaviors in Male Rats, 2006 Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 2, 209-214 21 Jharna, M et al., Evaluation of the clinical efficacy and safety of the herbal cold balm in the treatment of the common cold associated with headache, 2009 The Antiseptic 106, 87-90 22 K Nirmal Babu cs (2003), Micropropagation of camphor tree (Cinnamomum camphora), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 179–183 23 McCown BH & Amos R (1979) Initial trials of commercial micropropagation with birch Proc Int Plant Prop Soc 29: 387–393 24 Murashige T & Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiologia Plan- tarum 15: 473–493 25 Rangari, P., Screening Of Antibacterial Sensitivty Of Essential Oils Of Camphor And Cinnamon, 2011 Shodh Anusandhan Samachar, 22-26 26 Richa Singh cs (2012),Cinnamomum camphora (Kapur): Review, Pharmacognosy Journal , Vol 4, Issue 28 27 Sabah, A L., Effect of Camphor on Uterus Histology of Pregnant Rats, 2009 JKAU: Med Sci 16, 77-90 28 Sharma H and Vashistha B.D (2010) In vitro propagation of Cinnamomum Camphora ( L) nees & eberm using shoot tip explants 29 Y.P.S Bajaj (edited), Biotechnology in Agriculture and Foreatry Tài liệu tham khảo web: 30 caygionglamnghiep.org 31 duoclieu.edu.vn 32 tinhdaugiangthoa.com PHỤ BIỂU Phụ biểu 01: Mô trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) mô trƣờng WPM (Woody Plant Medium) Các t àn p ần mô trƣờng Hàm lƣợng (mg/l) MS WPM KNO3 1900 - NH4NO3 1650 400 MgSO4.7H2O 370 370 KH2PO4 170 170 CaCl2 332 96 H3BO5 6,2 6,2 MnSO4.H2O 22,3 22,3 ZnSO4 8,6 8,6 Na2MoO4 0,25 0,25 CuSO4 7H2O 0,025 0,025 CoCl2 0,025 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 - Na2EDTA 37,3 - 2,0 Myo-Inositol 100 100 Thiamine HCl 0,1 0,1 Axit nicotinic 0,5 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 0,5 Glycin Phụ biểu 02: Ản ƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu từ đoạn thân nuôi cấy mô trƣờng MS Thời Hóa chất Mơi trƣờng gian CTNC khử trùng Tỷ lệ Lần lƣợng mẫu lặp mẫu cấy (%) 35 17.14 100 38 15.79 100 32 15.63 100 TB 35 16.19 100 40 17.50 85.71 47 21.27 90.00 37 18.92 100 TB 41.33 19.23 91.90 38 42.11 87.5 42 42.86 83.33 35 37.14 92.31 TB 38.33 40.70 87.23 40 50.00 60.00 45 46.67 47.62 32 53.13 58.82 TB 39 49.93 55.17 (phút) VM1 VM2 HgCl2 0.1% MS VM3 VM4 Tỷ lệ Số mẫu tái sinh (%) Phụ biểu 03: Kết phân tích p ƣơng sa nhân tố ản ƣởng thời gian khử trùng tới tỷ lệ tái sinh đoạn thân Long Não môi trƣờng MS Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count VM1 VM2 VM3 VM4 ANOVA Source of Variation 3 3 SS Between Groups Within Groups 3436.314 241.2901 Total 3677.604 Sum Average Variance 300 100 275.71 91.90333 53.76803 263.14 87.71333 20.19423 166.44 55.48 46.6828 df MS F 1145.438 37.97712 30.16127 11 P-value F crit 4.44E05 4.066181 Phụ biểu 04: Ản ƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu từ đoạn thân nuôi cấy mô trƣờng WPM Thời Hóa chất Mơi trƣờng gian CTNC khử trùng Tỷ lệ Lần lƣợng mẫu lặp mẫu cấy (%) 36 13.89 100 40 10.00 100 41 17.07 100 TB 39 13.65 100 36 19.44 100 43 18.60 87.50 42 23.81 90 TB 40.33 20.62 92.5 35 48.57 82.35 44 34.09 80 40 40.00 93.75 TB 39.67 40.89 85.42 32 56.25 55.56 35 48.57 52.94 43 46.51 60 TB 36.67 (phút) VM5 VM6 HgCl2 0.1% WPM VM7 VM8 Tỷ lệ Số 50.44 mẫu tái sinh (%) 56.36 Phụ biểu 05: Kết phân tíc p ƣơng sa nhân tố ản ƣởng thời gian khử trùng tới tỷ lệ tái sinh đoạn thân Long Não môi trƣờng WPM Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count VM5 VM6 VM7 VN8 ANOVA Source of Variation 3 3 SS Between Groups Within Groups 3311.536 221.1555 Total 3532.691 Sum Average Variance 300 100 277.5 92.5 43.75 256.1 85.36667 54.09083 168.5 56.16667 12.73693 df MS 1103.845 27.64444 11 F 39.9301 P-value F crit 3.68E05 4.066181 Phụ biểu 06: Ản ƣởng àm lƣợng BAP Kinetin tới khả tạo đa c ồi Long Não Chất ĐH T (mg/l) CTNC BAP Kinetin LP1 0.3 LP2 0.5 LP3 0.7 LP4 0.9 LP5 1.5 0.3 LP6 1.5 0.5 LP7 1.5 0.7 LP8 1.5 0.9 Lần lặp TB TB TB TB TB TB TB TB Số lƣợng mẫu cấy 35 32 30 32.33 36 34 35 35 32 36 37 35 35 34 38 35.67 33 36 31 33.33 30 36 35 33.67 36 32 30 32.67 31 34 32 32.33 Số chồi tạo thành 38 34 35 35.67 50 52 49 50.33 65 74 76 71.67 65 63 69 65.67 68 75 64 69 142 173 160 158.33 110 98 105 104.33 81 86 82 83 Số chồi TB mẫu 1.09 1.06 1.17 1.10 1.39 1.53 1.40 1.44 2.03 2.06 2.05 2.05 1.86 1.85 1.82 1.84 2.06 2.08 2.06 2.07 4.73 4.81 4.57 4.70 3.05 3.06 3.5 3.19 2.61 2.53 2.56 2.57 Chất lƣợng chồi ++ +++ ++ + ++ +++ ++ ++ Ghi chú: +: chất lượng chồi (các chồi mảnh, còi, yếu) ++: chất lượng chồi ( chồi trung bình cao xanh đều) +++: chất lượng chồi tốt ( cao, mập thân v xanh đồng đều) Phụ biểu 07: Kết p ân tíc p ƣơng sa nhân tố ản ƣởng àm lƣợng BAP K net n đến hệ số nhân chồi Long Não Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count LP1 LP2 LP3 LP4 LP5 LP6 LP7 LP8 3 3 3 3 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total SS 27.33713 0.185467 27.5226 Sum 3.32 4.32 6.14 5.53 6.2 14.11 9.61 7.7 Average 1.106667 1.44 2.046667 1.843333 2.066667 4.703333 3.203333 2.566667 Variance 0.003233 0.0061 0.000233 0.000433 0.000133 0.014933 0.066033 0.001633 df MS F 3.905304 336.9062 16 0.011592 P-value F crit 3.72E-16 2.657197 23 Phụ biểu 08: kết phân tíc độ lệch chuẩn hệ số nhân chồi trung bình so với hệ số nhân chồi ba lần lặp Lần lặp LP1 LP2 LP3 LP4 LP5 LP6 LP7 LP8 1.09 1.39 2.03 1.86 2.06 4.73 3.05 2.61 1.06 1.53 2.06 1.85 2.08 4.81 3.06 2.53 1.17 1.40 2.05 1.82 2.06 4.57 3.5 2.56 TB 1.10 1.44 2.05 1.84 2.07 4.70 3.19 2.57 STDEV.S 0.04 0.06 0.01 0.01 0.02 0.10 0.21 0.03 ... i tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu nhân giống Long Não (Cinnamomum Camphora (L.) Presl) p ƣơng p áp nuô cấy mô tế bào? ?? với mục đ ch uy tr oài, cung cấp vật liệu giống trồng... thân gỗ đ đư vào nghi n cứu nuôi cấy mô- tế bào Từ năm 1994, ngành m Nghiệp đ nhập công nghệ, thiết bị giống gốc Bạch Đàn để nuôi cấy mô cho số c sở đ n sn y nhiều c sở nuôi cấy mô giâm hom rừng... (2017) nghiên cứu nhân giống c y re hư ng (Cinnamomum Parthenoxylon (Jack) Meisn) thuộc họ Long Não (Lauraceae) Nhân giống Re hư ng ằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho thấy khử trùng vật liệu nuôi cấy