Nghiên cứu nhân giống náng hoa trắng crinum asiaticum l bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin gửi đến quý thầy cô công tác Viện Cơng nghệ Sinh học Lâm nghiệp quan tâm, giúp đỡ bảo không q trình thực khóa luận tốt nghiệp trƣờng mà cịn q trình học tập tơi Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Thị Hải Hà tận tình hƣớng dẫn trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp trƣờng Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên giúp đỡ phần quan trọng giúp tơi vƣợt qua khó khăn học tập Mặc dù có nhiều cố gắng để thực đề tài cách hoàn chỉnh nhƣng bƣớc đầu tìm hiểu nghiên cứu khoa học, kiến thức cịn hạn chế nhiều điều bỡ ngỡ nên khơng tránh khỏi nhiều điều thiếu sót, tơi mong đƣợc góp ý thầy, bạn để báo cáo tơi đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng năm 2019 Sinh viên thực Bùi Thị Thơm i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Náng hoa trắng 1.2 Tình hình nghiên cứu ni cấy in vitro loài thuộc chi Crinum giới Việt Nam PHẦN 2: MỤC TIÊU - NỘI DUNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Đối tƣợng địa điểm bố trí thí nghiệm 2.3.1 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 2.3.2 Địa điểm bố trí thí nghiệm 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm 2.4.1 Nghiên cứu cơng thức khử trùng thích hợp cho việc tạo mẫu in vitro 2.4.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi từ củ Náng hoa trắng 2.4.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Náng hoa trắng 11 2.4.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ Náng hoa trắng 12 2.4.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng giá thể đến khả snh trƣởng invitro 12 2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 13 ii PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 15 3.1 Ảnh hƣởng hóa chất thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu Náng hoa trắng 15 3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi Náng hoa trắng 17 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Náng hoa trắng 21 3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ Náng hoa trắng 23 3.5 Ảnh hƣởng giá thể đến khả sinh trƣởng invitro 25 PHẦN 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 27 4.1 Kết luận 27 4.2 Tồn 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIỂU iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Từ viết tắt BAP Benzyl amino purin MS Murashige & Skoog NAA Naphthalene acetic acid TDZ Thidiazuron TB Trung bình CTTN Cơng thức thí nghiệm ĐHST Điều hòa sinh trƣởng iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm thu thập số liệu nghiên cứu phƣơng pháp tạo mẫu Náng hoa trắng Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi từ mảnh lát cắt ngang củ Náng hoa trắng 10 Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo cụm chồi Náng hoa trắng 11 Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ Náng hoa trắng 12 Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hƣởng giá thể đến khả sinh trƣởng in vitro Náng hoa trắng 13 Bảng 3.1 Kết ảnh hƣởng công thức khử trùng đến khả tạo mẫu Náng hoa trắng 15 Bảng 3.2 Kết ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi Náng hoa trắng 18 Bảng 3.3 Kết ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Náng hoa trắng 21 Bảng 3.4 Kết ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả rễ Náng hoa trắng 23 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng thành phần giá thể đến khả sinh trƣởng invitro Náng hoa trắng: 25 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây Náng hoa trắng (nguồn: ikute.vn) Hình 3.1 Mẫu Náng hoa trắng 17 Hình 3.2 Chồi tái sinh từ mô sẹo mẫu 19 Hình 3.3 Chồi tái sinh từ mô sẹo mẫu 19 Hình 3.4 Chồi tái sinh từ mô sẹo mẫu củ 20 Hình 3.5 Mơ sẹo tạo thành từ củ 20 Hình 3.6 Chồi tái sinh từ mơ sẹo mẫu củ 20 Hình 3.7 Cụm chồi Náng hoa trắng nuôi cấy công thức NN3: 22 Hình 3.8 Cơng thức rễ R1 (Sau tuần nuôi cấy) 24 Hình 3.9 Cơng thức rễ R3 (Sau tuần nuôi cấy) 25 Hình 3.10 : Cây Náng hoa trắng trồng giá thể sau tuần 26 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Náng hoa trắng (Crinum asiaticum L.) thuộc họ Thủy tiên, thuốc đƣợc sử dụng phổ biến dân gian Một số kết nghiên cứu cho thấy Náng hoa trắng có chứa hoạt chất alcaloid có tác dụng chống viêm Náng hoa trắng đƣợc sử dụng điều trị u xơ tuyến tiền liệt, ngăn ngừa hạn chế phát triển khối u, điều trị bong gân, giảm đau, chống viêm Theo đề tài “Nghiên cứu tác dụng nắng hoa trắng (Crinum asiaticum L.) ” TS.Nguyễn Bá Hoạt cho thấy Náng hoa trắng có hoạt chất alkaloid theo lycorin cao có tác dụng làm giảm phì đại lành tính tuyến tiền liệt lên tới 35,4% Bệnh đặc biệt thƣờng gặp nam giới từ tuổi 50 trở lên thƣờng tiểu rắt, tiểu buốt, tiểu đêm gây khó khăn làm giấc ngủ ngon đêm Hiện nay, nhu cầu sử dụng Náng hoa trắng làm dƣợc liệu điều trị bệnh ngày tăng việc sử dụng loại thuốc thực phẩm chức có nguồn gốc thảo dƣợc vừa có tác dụng tích cực điều trị lại tác dụng phụ so với thuốc tây y Náng hoa trắng chủ yếu đƣợc nhân giống vơ tính củ Tuy nhiên, cần thời gian dài để nhân đạt số lƣợng lớn, chất lƣợng tuổi không đồng đều; trữ lƣợng tự nhiên giới hạn bị cạn kiệt Vì vậy, việc nghiên cứu loài Náng hoa trắng nghiên cứu phƣơng pháp nhân nhanh loài để cung cấp nguyên liệu cho sản xuất quy mô công nghiệp cần thiết Từ nhu cầu thực tiễn sở khoa học nêu trên, tiến hành thực “Nghiên cứu nhân giống Náng hoa trắng (Crinum asiaticum L.) phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật” PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Náng hoa trắng Náng hoa trắng có tên gọi khác dân gian Náng, hoa Náng, Tỏi lơi, Đại tƣớng quân, Chuối nƣớc, tên khoa học Crinum asiaticum L thuộc họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) Hình 1.1: Cây Náng hoa trắng (nguồn: ikute.vn) Cây thân thảo, lâu năm, thân hành, gốc hình cầu, trơng giống nhƣ củ, đƣờng kính 10-15 cm, vỏ vảy màu nâu, cao 30-50 cm, có cao 1m Lá hình dải hay mũi mác, mọc từ gốc, dài 30-50 cm, rộng 2-5 cm, mặt hõm thành rãnh màu sẫm gốc lá, gốc thành bẹ ôm lấy thân có mo bao bọc, sau nở Cụm hoa gồm cán dài 40-60cm, to ngón tay mang 10-50 hoa màu trắng, họp thành tán, thơm dịu vào sáng sớm chiều tối, cánh hoa hình dải thn, nhị thị ngồi Quả hình cầu trịn, đƣờng kính 3-5 cm, có ngăn chứa hạt Lồi phân bố từ Ấn Độ qua Inđơnêxia tới đảo Molluyc Ở nƣớc ta, mọc hoang dại nơi ẩm mát, thƣờng trồng làm cảnh Lá củ đƣợc dùng để làm thuốc Cây Náng hoa trắng có tỷ lệ đậu thấp, nhân giống phƣơng pháp hữu tính hiệu khơng cao Thƣờng nhân giống phƣơng pháp vơ tính (tách chồi mẹ) nhân giống phƣơng pháp in vitro (nuôi cấy mô) Nếu thu gom đƣợc hạt, hạt đƣợc gieo trồng tập trung vào vƣờn ƣơm, sau - tháng hạt mọc lên thành con, mọc từ hạt thƣờng yếu, non, bé mỏng Khi đƣa trồng, lên chậm phát triển, tốn nhiều công chăm sóc, sản xuất thƣờng tận dụng thêm nguồn giống từ hạt, chủ yếu trồng tách từ gốc mẹ (Lê Trần Đức, 1997) Đối với đƣợc nhân giống phƣơng pháp in vitro: Sau đƣa khỏi ống nghiệm, phải trải qua - tháng vƣờn ƣơm, có rễ mới, đủ kích thƣớc củ đạt - 1,5 cm Năm 2003, Viện Dƣợc liệu thực đề tài cấp “Nghiên cứu Náng hoa trắng chữa u xơ tiền liệt tuyến” (1/2003 – 12/2005) Theo nghiên cứu cho thấy Náng hoa trắng có hàm lƣợng alkaloid cao hẳn trinh nữ hồng cung Náng hoa trắng có hàm lƣợng alcaloid tồn phần cao (Trung bình 0,97%), cao Trinh nữ hoàng cung (TB 0,49%) Náng hoa đỏ (TB 0,56%) Đặc biệt đề tài “Nghiên cứu tác dụng nắng hoa trắng (Crinum asiaticum L.) bệnh phì đại tuyến tiền liệt” TS Nguyễn Bá Hoạt tiến hành từ năm 2001 đến 2008 kết luận: Náng hoa trắng có tác dụng làm giảm phì đại lành tính tuyến tiền liệt lên tới 35,4% Náng hoa trắng có tác dụng chống viêm mạn tốt, có khả làm giảm trọng lƣợng u hạt tới 25,4 % Do đó, Náng hoa trắng đƣợc nghiên cứu để sử dụng làm thuốc chữa phì đại tuyến tiền liệt, loại bệnh phổ biến nam giới Náng hoa trắng thƣờng đƣợc sử dụng cho bệnh nhân phì đại tiền liệt tuyến dạng dịch chiết Khi sử dụng cho bệnh nhân phì đại tuyến tiền liệt, Náng hoa trắng giúp làm giảm kích thƣớc khối phì đại giảm chèn ép lên niệu đạo Thông thƣờng thành phần thuốc dùng điều trị phì đại tiền liệt tuyến hay gây phản ứng phụ làm ảnh hƣởng đến khả tình dục ngƣời bệnh Nhƣng sử dụng Náng hoa trắng, không gây tác dụng phụ mà ngƣời bệnh gặp phải Đồng thời, ngồi tác dụng điều trị bệnh hiệu quả, Náng hoa trắng giúp hạn chế ngăn ngừa phát triển u xơ tiền liệt tuyến Ngoài ra, uống nƣớc từ Náng hoa trắng giúp cải thiện rối loạn chứng tiểu tiện bệnh nhân u xơ nhƣ: tiểu buốt, tiểu đêm, tiểu nhiều lần, tiểu rắt, tiểu khơng hết Náng hoa trắng có tác dụng chữa bong gân, giảm đau xƣơng khớp Hỗ trợ điều trị trƣờng hợp chấn thƣơng nhƣ: bầm tím, sƣng tấy, bong gân, sai gân ngã Khớp cổ chân, khớp gối khớp cổ tay nơi dễ bị bong gân Ngƣời bệnh thƣờng thấy cổ tay, cổ chân lực, đau nhức điểm bám dây chằng vào xƣơng đau dọc theo dây chằng, khớp sƣng nề, nóng, làm trở ngại hoạt động… Ngồi ra, Náng hoa trắng có hoa đẹp, dễ trồng chăm sóc vậy, cịn đƣợc trồng để làm cảnh 1.2 Tình hình nghiên cứu ni cấy in vitro loài thuộc chi Crinum giới Việt Nam Hiện giới Việt Nam cịn hạn chế nghiên cứu ni cấy mơ lồi Náng hoa trắng, nhiên số loài thuộc chi Crinum đƣợc nghiên cứu Năm 1999, Melanie R Ulrich cộng nghiên cứu ni cấy mơ lồi Crinum lilies phía Nam nƣớc Mỹ Kết cho thấy, công thức khử trùng mẫu sử dụng hypochlorite 0,525% thời gian cho kết tốt Công thức tái sinh chồi sử dụng nồng độ BAP từ 0-22 µM kết hợp với NAA có nồng độ từ 0-5,3 µM Kết tốt thu đƣợc nồng độ BAP 22 µM Fennell cộng (2001) nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng đến q trình nhân giống in vtro Crinum variable cho thấy: sử dụng BAP nồng độ 1mg/l cho kết nhân chồi tốt với tỷ lệ mẫu đa chồi đạt 92%, số chồi trung bình/ mẫu đạt chồi Than hoạt tính với tỷ lệ 5% có tác dụng tốt việc đẩy nhanh phát triển củ rễ Silvana Arẳjo cộng (2013) tạo mơ sẹo lồi Crinum americanum L từ củ sử dụng 2,4-D với nồng độ 2,26 µM cho kết tốt So sánh với nghiên cứu tác giả Ninh Thị Thảo (2009) sử dụng mẫu để tái sinh chồi từ phần đế củ mang hai vảy củ loài Loa kèn đỏ nhung cho tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 94,44%; đạt 2,12 chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi trung bình 2,16 cm ni cấy mơi trƣờng MS có bổ sung mg/l BAP Sự khác biệt cho thấy loại nồng độ chất ĐHST có ảnh hƣởng rõ rệt đến giai đoạn tái sinh chồi Tùy vào lồi nghiên cứu sử dụng loại chất ĐHST khác kết tái sinh tốt Nhƣ vậy, để đạt hiệu tái sinh chồi cao nên sử dụng vật liệu từ củ, nuôi cấy mơi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l TDZ Hình 3.2 Chồi tái sinh từ mơ sẹo mẫu Công thức TS6 (Sau 10 tuần nuôi cấy) A B Hình 3.3 Chồi tái sinh từ mơ sẹo mẫu Công thức TS4 (A Sau tuần nuôi cấy, B Sau 10 tuần ni cấy) 19 Hình 3.4 Chồi tái sinh từ mô sẹo mẫu củ Công thức TS9 ( Sau 10 tuần ni cấy) Hình 3.5 Mơ sẹo tạo thành từ củ công thức TS8 (Sau tuần ni cấy) Hình 3.6 Chồi tái sinh từ mơ sẹo mẫu củ Công thức TS8 ( Sau 10 tuần nuôi cấy) 20 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Náng hoa trắng Ở giai đoạn nhân nhanh chồi, dựa nghiên cứu trƣớc nghiên cứu giai đoạn tái sinh chồi, sử dụng môi trƣờng nuôi cấy cố định 0,5 mg/l NAA thay đổi nồng độ BAP theo dải từ 1,5-3 mg/l Kết sau tuần nuôi cấy đƣợc tổng hợp bảng 3.4 Bảng 3.3 Kết ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Náng hoa trắng Công BAP NAA thức (mg/l) (mg/l) Số Số mẫu Tỉ lệ mẫu tạo mẫu tạo thí chồi cụm nghiệm (mẫu) chồi (%) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) Chất lƣợng chồi NN1 1,5 30 17 56,67 1,14 3,2 Xấu NN2 30 23 76,67 1,76 3,7 TB NN3 2,5 30 25 83,33 2,23 5,4 Tốt NN4 30 24 80,00 1,83 4,0 Tốt 0,001 0,001 0,5 Sig - Chất lƣợng chồi đƣợc đánh giá nhƣ sau: + Chồi tốt: màu xanh mập khỏe + Chồi trung bình: màu xanh nhỏ + Chồi xấu: màu vàng nhạt nhỏ Từ số liệu bảng 3.3 cho thấy Náng hoa trắng có khả tạo cụm chồi chƣa cao tất cơng thức thí nghiệm Tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi cao đạt 83,33% công thức NN3 với hệ số nhân chồi đạt 2,23 Kết phân tích thống kê tiêu hệ số nhân chồi, chiều cao chồi có phân hóa rõ rệt cơng thức thí nghiệm (sig