Điều chế hệ chất mang thuốc nano cisplatin heparin pluronic (p123) và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HOC TỰ NHIÊN TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NANO CISPLATIN/HEPARIN-FLURONIC (P123) Ư Mã số: Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Thị Bích Trâm BÌNH DƢƠNG, 6/2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HOC TỰ NHIÊN TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NANO CISPLATIN/HEPARIN-FLURONIC (P123) Ư Mã số: Xác nhận đơn vị chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ tên) TS Nguyễn Thị Bích Trâm BÌNH DƢƠNG, 6/2018 Đề tài hồn thành tại: Phịng thí nghiệm hóa học, Trường Đại học Thủ Dầu Một Đề tài bảo vệ trước Hội đồng đánh giá nghiệm thu đề tài KH & CN cấp trường vào hồi … … ngày … tháng … năm 2018 Có thể tìm hiểu đề tài thư viện: Thư viện Trường Đại học Thủ Dầu Một MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngày nay, xã hội phát triển với phát triển ngành khoa học - kĩ thuật tiên tiến cơng nghệ nano lại chiếm phần thiếu lĩnh vực: mỹ phẩm, thực phẩm… đặc biệt y dược Nhìn chung cisplatin nhiều loại thu c ch ng ung thư khác thường k m tan nước, có nhiều hiệu ng ph thu c tư ng tác đặc hiệu k m với tế bào bệnh lẫn tế bào lành Sử d ng chất mang nano nang hóa điều chỉnh nhả chậm thu c ch ng minh giải pháp hiệu chất mang nano dễ dàng di chuyển hệ tuần hoàn máu sau lưu trữ vị trí kh i u thông qua hiệu ng tăng cường thẩm thấu lưu trữ (EPR) (Enhanced permeability and retention effect) sử d ng tác nhân hướng đích Cisplatin thu c nhóm ph c platin (II) dùng nhiều phác đồ hóa trị kết hợp cho bệnh nhân ung thư Tuy nhiên, cisplatin gây nhiều tác d ng ph gây độc thận, thần kinh, … Thu c giảm nhanh dược động học tư ng tác với protein huyết tư ng trước đến tế bào ung thư Mặc dù vậy, tác d ng diệt tế bào ung thư t t nên nhiều thu c có cấu trúc gần gi ng cisplatin phát triển Tuy nhiên ph c đắt có nhiều tác d ng ph Nhiều nghiên c u gần thay tổng hợp ph c platin tập trung vào hướng chất mang nhả thu c nano nhằm giảm tác d ng ph cisplatin mà giữ hiệu thu c Chất mang thu c nano vận chuyển hiệu thu c đến vị trí kh i u góp phần giảm phản ng ph , tăng dung nạp thu c tác d ng trì tăng cường thẩm thấu (EPR-effect) Nhiều nanogel từ poly(NPage | isopropylacrylamide), poly(lactide-co-glycolide)-polyethylene glycol phát triển cho vận chuyển cisplatin Trong đề xuất này, định hướng tổng hợp heparin gh p copolymer polyethylene glycol-b-polypropylene (pluronic P123) sử d ng để tạo ph c với cisplatin hydrate Hệ nanogel vận chuyển hiệu cisplatin nang hóa thêm loại thu c ch ng ung thu k m tan khác Hiệu mang thu c cải thiên c sở kết hợp hoạt tính thu c với đặc tính chất mang nano MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Điều chế, khảo sát đặc tính cấu trúc, độc tế bào nanogel c sở Heparin-fluronic mang thu c ch ng ung thư cisplatin Đ I TƢ NG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU  Đối tƣợng nghiên cứu - Những vấn đề lý luận liên quan tới heparin, fluronic P123, cisplatin - Thực trạng tổng hợp hệ chất nano heparin-fluronic P123 sử d ng để mang nhả thu c cisplatin  Phạm vi nghiên cứu - Tổng hợp nano heparin-fluronic P123 mang cisplatin khảo sát liên quan phạm vi phòng thí nghiệm - Thời gian nghiên c u: 15 tháng Page | NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Hệ th ng hoá vấn đề lý luận liên quan tới vấn đề nghiên c u đề tài; - Mô tả phân tích, đánh giá thực trạng vấn đề nghiên c u:  Hoạt hóa P123 với NPC đánh giá cấu trúc  Điều chế NPC-P123-OH đánh giá cấu trúc  Điều chế heparin gh p BDA tác chất gh p cặp carbodiimide  Điều chế heparin hoạt hóa gh p với NPC-P123-OH  Điều chế đánh giá đặc tính nanogel từ heparin-P123  Điều chế hệt nanogel mang thu c cisplatin dạng hydrate/dạng không hydrate  Đánh giá lượng thu c cisplatin mang nanogel  Đánh giá hiệu nhả thu c cisplatin chất mang nanogel  Đánh giá hiệu tiêu diệt tế bào ung thư phổi HCI-L460 hệ nanogel ch a thu c cisplatin hidrat  Đề xuất biện pháp, giải pháp, khuyến nghị (kiến nghị) Page | PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phư ng pháp nghiên c u tài liệu - Phư ng pháp nghiên c u thực nghiệm  Thực nghiệm tổng hợp nano heparin-pluronic P123 mang cisplatin  Thực nghiệm trình mang thu c ch ng ung thư cisplatin  Thực nghiệm trình khảo sát hoạt tính c chế hệ chất lên tế bào ung thư Các phư ng pháp phân tích hóa lí đại:  Phổ cộng hưởng từ nhân – Nuclear magnetic resonance – NMR  Phổ hồng ngoại – Infrared – IR  Kính hiển vi điện tử truyền qua – TEM  Phư ng pháp đo kích thước hạt tán xạ ánh sáng động - DLS  Phư ng pháp đo ICP xác định hàm lượng cisplatin có copolymer/nanogel  Phân tích nhiệt trọng TGA (Thermal gravimetric analysis)  Phư ng pháp quang phổ phát xạ nguyên tử plasma ICP-AES (Inductively couple plasma – atomic emission spectrocopy) - Phư ng pháp thử độc tính tế bào Phư ng pháp SRB (Sulforhodamine B) - xác định độc tính đ i với tế bào ung thư hoạt chất mơ hình in vitro Page | Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài có giá trị việc nghiên c u hợp chất mang thu c ch ng ung thư hướng đích, hợp chất chuyển thu c ch ng ung thư đến vị trí tế bào ung thư Đây vấn đề xã hội quan tâm Page | KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ TỔNG H P HEPARIN-P123 3.1.1 Kết tổng hợp NPC-P123-NPC Phân tử pluronic H-(OC2H4)20-(OC3H6)70-(OC2H4)20-OH (P123) có hai nhóm hydroxyl –OH vị trí đầu vị trí cu i mạch phân tử hoạt hóa hợp chất para-nitrophenyl chloroformate O2N-C6H4-OCOCl (NPC) theo tỉ lệ mol 1:2 Các nguyên tử H bị thay g c O2N-C6H4-O-CO- thông qua liên kết ester tạo thành hợp chất p-O2N-C6H4-O-CO-(OC2H4)20-(OC3H6)70(OC2H4)20-O-CO-O-C6H4-p-NO2 kí hiệu NPC-P123-NPC  Kết phổ 1H-NMR NPC-P123-NPC Hình 1: Phổ1H-NMR NPC-P123-NPC Page |  Kết phổ FT-IR NPC-P123-NPC Hình 2: Phổ FT-IR Pluronic P123 NPC-P123-NPC 3.1.2 Kết tổng hợp NPC-P123-OH Sản phẩm NPC-P123-NPC đem phản ng với 3-aminopropan-1-ol (H2N-CH2CH2CH2-OH), tạo thành sản phẩm p-O2N-C6H4-O-CO-(OC2H4)20(OC3H6)70-(OC2H4)-O-CO-NH-CH2CH2CH2-OH kí hiệu NPC-P123-OH  Kết phổ 1H-NMR NPC-P123-OH Hình 3: Phổ1H-NMR NPC-P123-OH Page |  Kết phổ FT-IR NPC-P123-OH Hình 4: Phổ FT-IR pluronic P123, NPC-P123-NPC NPC-P123-OH 3.1.3 Kết tổng hợp Hep-DAB Các nhóm carboxylate phân tử heparin hoạt hóa 1,4- diaminobutane H2NCH2CH2CH2CH2NH2 (DAB) trông qua tác nhân gh p cặp 1Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC), N-Hydroxysuccinimide (NHS) tạo thành sản phẩm kí hiệu Hep-DAB  Kết phổ FT-IR Hep-DAB Hình 3.5: Phổ FT-IR Hep-DAB Page | 3.1.4 Kết tổng hợp Hep-P123 S đồ tổng hợp Hep-P123 S đồ 1: Phản ng tạo thành Hep-P123  Kết phổ 1H-NMR Hep-P123 Hình 6: Phổ1H-NMR Hep-P123 Page |  Kết phổ FT-IR heparin-P123 Hình 7: Phổ FT-IR Pluronic P123, NPC-P123-NPC, NPC-P123-OH Heparin-pluronic P123  Kết giản đồ TGA Hep-P123 Hình 8: Giản đồ TGA P123, heparin Hep-P123 Page | 10 Từ giản đồ TGA tính kh i lượng thực tế mà pluronic P123 gh p heparin: Bảng 4: So sánh tỉ lệ mol hep-P123 theo lý thuyết thực tế Hep:P123 Tỉ lệ lí Giá trị a Giá trị b Tỉ lệ thực Hiệu suất thuyết (mol) (mg) (mg) tế (mol) ghép (%) 1:3 3.76 3.18 1:2.69 89.68 1:7 32.38 28.8 1:4.57 65.30 1:10 16.48 13.44 1:5.13 51.33 1:14 14.8 13.44 1:5.92 42.29  Kết DLS, TEM heparin-P123 Hình 9: TEM kích thước hạt Hep-P123 (a) Hep-P123 (1:3), (b) Hep-P123 (1:7), (c) Hep-P123 (1:10), (d) Hep-P123 (1:14) Bảng 5: Kết đường kính hạt (nm) theo DLS TEM Nanogel DLS (nm) TEM (nm) Hep-P123-1:3 94.4 62.2 ± 19.4 Hep-P123-1:7 107.2 87.3 ± 15.1 Hep-P123-1:10 113.9 104.0 ± 15.5 Hep-P123-1:14 182.4 114.5 ± 21.7 Page | 11 Qua kết đo DLS TEM bảng hình cho thấy: - Các hạt nanogel Hep-P123 có dạng hình cầu - Kích thước hạt phân b kích thước nanogel tăng tỉ lệ mol Hep-P123 gia tăng 3.2 KẾT QUẢ NANOGEL HEP-P123 (1:3) NANG HÓA CISPLATIN  Kết phổ FT-IR nanogel Hep-P123 (1:3) nang hóa cisplatin khơng hydrat cisplatin hydrat Hình 10: Phổ FT-IR heparin, Hep-P123 (1:3), Hep-P123-Cis (1:3) Hep-P123-CisOH (1:3) Qua phổ FT-IR ch ng minh hợp chất Hep-P123-Cis/CisOH có xuất đồng thời Hep-P123, Cisplatin Cisplatin hydrat, ch ng tỏ tổng hợp thành công sản phẩm Hep-P123-Cis/CisOH Page | 12  Kết nang hóa cisplatin/cisplatin hydrat Hep-P123 (1:3) theo phư ng pháp ICP Bảng 3.7: Kết nang hóa thu c cisplatin cisplatin hydrat Hep-P123 Cisplatin Tên mẫu Hep-P123 (1:3) Cisplatin hydrat %Pt[2] %cisplatin[3] %Pt(3) %cisplatin[39] (w/w) (w/w) (w/w) (w/w) 5.80 8.92 19.70 30.3 S đồ 2: Phản ng tạo thành Hep-P123-CiOH  Kết nhả thuốc Cisplatin hệ nano Hep-P123-CisOH (1:3) Trong điều kiện sinh lý, cisplatin bị thủy phân thành monoaquadiaquacisplatin liên kết với guanine adenine ADN làm cản trở ch p ADN Page | 13 Hình 3.11 cho thấy h n 60% (wt / wt) CisOH ph c hep-P123CisOH giải phóng sau 24 hai điều kiện pH khác Đây t c độ thủy phân nhanh ph c chất CisOH nhóm anion mạng nanogel lỏng lẻo lượng pluronic P123 liên hợp T c độ giải phóng CisOH pH=5.5 (81.32%) cao h n pH=7.4 (68.72%) sau 24h Điều ph c hep-P123-CisOH bị thủy phân nhanh chóng điều kiện axit Kết có ích hệ th ng phân ph i thu c s vị trí kh i u pH