Nguyen Thi Ngoc Lien_hoàn chỉnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH TRP64ARG TRÊN GEN ADRB3 VÀ TÌNH TRẠNG BÉO PHÌ Ở TRẺ MẦM NON THÀNH PHỐ HÀ NỘI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH Hà Nội - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Liên LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Sinh lý học người Động vật, Khoa Sinh học, Trường đại học Sư phạm Hà Nội cán Phịng Thí nghiệm Trung tâm, Trường đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian học tập tiến hành nghiên cứu Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh tận tình giúp đỡ, truyền dạy kinh nghiệm quý báu hướng dẫn trực tiếp với tất lịng để em hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Đỗ Thị Như Trang nhiệt tình hướng dẫn tơi nhiều kĩ thuật phịng thí nghiệm Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Giáo dục đào tạo (đề tài mã số B2018SPH50) hỗ trợ kinh phí giúp tơi hồn thành nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục Đào tạo thành phố Hà Nội, Phòng Giáo dục quận huyện, trường Mầm non Hà Nội, học sinh gia đình tạo điều kiện cho tơi tiến hành nghiên cứu Cuối cùng, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình - nguồn động viên tinh thần to lớn giúp vượt qua khó khăn suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Liên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt ADRB3 AO BMI CI FFA IOTF Viết đầy đủ beta-adrenergic Nghĩa tiếng Việt (β adrenoreceptor) Abdominal obesity Body Mass Index Confident Interval Free fatty acids International Obesity Task Force Thụ thể họ adrenergic Béo phì bụng Chỉ số thể Khoảng tin cậy Axit béo tự Tổ chức chuyên trách béo phì quốc tế Tần số nhỏ alen for Trung tâm Thông tin Công nghệ MAF NCBI Minor Allele Frequency National Center PCR SNP TM UNICEF WC WHO Biotechnology Information Polymerase Chain Reaction Single nucleotide polymorphism Stransmembrane segments United Nations Children's Fund Waist circumference World Health Organization sinh học Quốc gia (Hoa kỳ) Phản ứng chuỗi trùng hợp Đa hình đơn nucleotide Phân đoạn xuyên màng tế bào Quỹ Nhi đồng Hoa Kỳ Chu vi vòng eo Tổ chức Y tế Thế Giới DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình ngun nhân chế bệnh sinh béo phì Hình 1.2 Tỉ lệ trẻ béo phì tuổi giới năm 2017 Hình 1.3 Số trẻ em thừa cân tuổi theo phân loại thu nhập quốc gia, 2000 2017 Hình 1.4 Vị trí gen ADRB3 nhiễm sắc thể số Hình 1.5 Cấu trúc thụ thể beta Hình 1.6 Các vị trí liên kết phối tử thụ thể beta Hình 1.7 Chức thụ thể beta3-adrenoceptor Hình 1.8 Vị trí rs4994 (Trp64Arg) exon gen ADRB3 Hình 1.9 Sự khuếch đại PCR phân tích điện di Agarose-Gel khu vực Receptor β3-Adrenergic bao gồm đột biến Hình 2.1 Z-score theo BMI phụ thuộc tuổi giới theo tiêu chuẩn WHO (2016) Hình 2.2 Phịng thí nghiệm Trung tâm, Đại học Y Hà Nội Hình 2.3 Thiết kế nghiên cứu Hình 2.4 Các thiết bị dùng nghiên cứu Hình 2.5 Cách đo chiều cao đứng trẻ Hình 2.6 Chuẩn bị cho phản ứng PCR Hình 2.7 Các bước chạy phản ứng PCR Hình 2.8 Chu trình nhiệt chạy PCR Hình 2.9 Các bước ủ sản phẩm PCR với enzyme đặc hiệu Hình 2.10 Các bước đổ gel Hình 2.11 Mẫu ADN tra gel theo thứ tự Hình 2.12 Các bước chạy điện di Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mức nhiệt độ bắt mồi khác Hình 3.2 Hình ảnh điện di sau cắt với enzyme giới hạn MvaI Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (A) sau cắt với enzyme giới hạn (B) Hình 3.4 Tỉ lệ alen đa hình ADRB3 rs4994 số quần thể giới MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Năm 2000, Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO) xem thừa cân béo phì bệnh có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng kêu gọi nước có hành động nhanh chóng để phịng ngừa bệnh [96] Năm 2016, theo WHO có tới 1,9 tỉ người trưởng thành từ 18 tuổi trở lên bị thừa cân, có 650 triệu người bị béo phì [101] Tỉ lệ béo phì tồn giới tăng gần gấp lần từ năm 1976 đến năm 2016 [78] Năm 2014, 2,1 tỉ người, gần 30% dân số tồn cầu bị thừa cân béo phì 5% số ca tử vong toàn giới béo phì Đánh giá tác động kinh tế tồn cầu béo phì ước tính 2,0 nghìn tỉ la Mỹ hay 2,8% tổng sản phẩm quốc nội (GDP) tồn cầu [98] Nghiên cứu cơng bố tờ The Lancet trước Ngày Béo phì Thế giới (11 tháng 10 năm 2017) Tỉ lệ trẻ em thiếu niên bị béo phì giới tăng từ 1% (tương đương năm triệu bé gái sáu triệu bé trai) vào năm 1975 lên gần 6% bé gái (50 triệu) gần 8% bé trai (74 triệu) vào năm 2016 [78] Năm 2016, theo WHO có khoảng triệu trẻ em tuổi bị thừa cân béo phì, 340 triệu trẻ em thiếu niên độ tuổi 5-19 bị thừa cân béo phì [101] Nghiên cứu Nhật Bản khoảng 1/3 trẻ nhỏ thừa cân, béo phì tiếp tục thừa cân, béo phì trưởng thành [59] Béo phì trẻ em gây nhiều hậu xấu tới sức khỏe, kèm theo bệnh mạn tính khơng lây tim mạch, huyết áp, đái tháo đường type II ung thư Ngồi ra, thừa cân béo phì khiến trẻ mặc cảm, tự ti, bị bạn bè trêu chọc, ảnh hưởng đến kết học tập mối quan hệ xã hội [47] Nghiên cứu Hà Văn Thiệu (2005) học sinh – 15 tuổi Bình Định ảnh hưởng bất lợi thừa cân béo phì cho thấy trẻ thừa cân, béo phì có đến 84% bị rối loạn lipid máu, 22% gia tăng huyết áp tâm thu 16% bị tổn thương tâm lý [22] Năm 1997, Ban chuyên gia tư vấn WHO nhận định tình hình thừa cân, béo phì trẻ nhỏ vấn đề sức khỏe phát sinh cần quan tâm UNICEF / WHO / World Bank Group Joint Child Malnutrition Estimates, Ở Việt Nam, tình trạng béo phì trẻ em ngày gia tăng, đặc biệt khu vực đô thị trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng đáng báo động Kết điều tra nhân học trước năm 1995 cho thấy tỉ lệ thừa cân, béo phì khơng đáng kể Tuy nhiên, khảo sát thành phố lớn sau có tượng gia tăng tỉ lệ thừa cân, béo phì trẻ lứa tuổi nhà trẻ, mầm non học sinh tiểu học Năm 2011, báo cáo tình hình dinh dưỡng quốc gia trẻ tuổi toàn quốc, tỉ lệ trẻ thừa cân, béo phì 4,8%, tăng gấp lần so với số liệu thu năm 2000 [7] Tính đến năm 2014, tỉ lệ thừa cân, béo phì trẻ tuổi thành phố Hồ Chí Minh 12,6%, Bình Dương 13,4% dự báo tăng nhanh thời gian tới Error: Reference source not found Có nhiều nguyên nhân dẫn đến thừa cân, béo phì chế độ ăn uống, vận động thể lực yếu tố di truyền Thừa cân, béo phì tăng lượng phần ăn giảm hoạt động thể lực kết hợp hai yếu tố [1]., [4] Bên cạnh đó, tương tác gen nhạy cảm với chế độ ăn uống lối sống có tác động khơng nhỏ đến nguy béo phì Nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò yếu tố di truyền liên quan đến phát triển bệnh béo phì Nghiên cứu cặp sinh đơi gia đình ảnh hưởng yếu tố di truyền (gen) chiếm khoảng 40 - 70% bệnh béo phì Các yếu tố di truyền phân loại theo chế tác động béo phì như: Nhóm gen kích thích ngon miệng (Neuropeptide Y, Leptin receptor, P proopiomelanocortin), nhóm gen liên quan đến tiêu hao lượng (Uncoupling proteins), nhóm gen điều hịa chuyển hóa (Beta-2 adrenergic receptor, Beta-3 adrenergic receptor), nhóm gen liên quan đến biệt hóa phát triển tế bào mỡ (Peroxisome proliferator-activated receptor, Vitamin D receptor, Retinoid X receptor) [50], [84] Các nghiên cứu gần tập trung vào hệ thống thụ thể adrenergic vai trị quan trọng thụ thể kích thích sinh nhiệt kích hoạt vận động lipid từ vị trí tích trữ chất béo Đặc biệt phân nhóm beta2-adrenoceptor beta3-adrenoceptor gen ứng cử Các thụ thể beta3-adrenoceptor kích thích vận động chất béo tăng sinh nhiệt tế bào mỡ nâu Việc điều trị động vật béo phì với chất chủ vận beta3-adrenergic chọn lọc làm giảm nơi tích trữ chất béo hiệu Gen ADRB3 (adrenoceptor beta 3) thuộc nhóm gen điều hịa chuyển hóa có tác động đến béo phì [50] Năm 1997, ba nhóm độc lập cơng bố đột biến codon 64 gen ADRB3 với thay tryptophan thành arginine (Trp64Arg) Đa hình liên quan đến khởi phát sớm bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin, đặc điểm kháng insulin xu hướng tăng cân Một số nghiên cứu sau cho thấy mối liên quan đặc biệt đa hình Trp64Arg với béo phì [2] Trong nghiên cứu khác biến thể Trp64Arg ADRB3 có liên quan đến hoạt động lipid thấp tế bào mỡ người Do đó, suy giảm thụ thể beta3-adrenoceptor dẫn đến béo phì qua giảm chi tiêu lượng mô mỡ [86] Những báo cáo cho thấy đa hình Trp64Arg gen ADRB3 gen ứng cử cho bệnh béo phì Vậy gen ADRB3 có ảnh hưởng đến béo phì trẻ mầm non? Việc nghiên cứu tác động gen với béo phì trẻ đem lại lợi ích việc tiên lượng béo phì trẻ? Đó lý thực đề tài “Mối liên quan đa hình Trp64Arg gen ADRB3 tình trạng béo phì trẻ mầm non thành phố Hà Nội” Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng tối ưu hố quy trình xác định kiểu gen đa hình Trp64Arg xác định tỉ lệ alen tỉ lệ kiểu gen đa hình trẻ em - Xác định mối liên quan đa hình Trp64Arg gen ADRB3 tình trạng béo phì trẻ mầm non thành phố Hà Nội Nội dung nghiên cứu - Xây dựng tối ưu quy trình kĩ thuật sinh học phân tử gồm kĩ thuật nhân gen (Polymerase Chain Reaction, PCR), kĩ thuật phân tích kiểu gen enzyme cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - Polymerase Chain Reaction, RFLP-PCR) để xác định kiểu gen đa hình Trp64Arg thuộc gen ADRB3 phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Việt Nam - Phân tích kiểu gen đa hình Trp64Arg thuộc gen ADRB3 284 trẻ mầm non - tuổi quy trình xây dựng tối ưu - Phân tích thống kê để xác định mối liên quan đa hình Trp64Arg gen ADRB3 tình trạng béo phì trẻ mầm non thành phố Hà Nội Ý nghĩa lý luận ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học - Tỉ lệ alen, tỉ lệ kiểu gen đa hình Trp64Arg gen ADRB3 sở để tính cỡ mẫu cho nghiên cứu ước lượng phân bố alen quần thể - Xác định mối liên quan đa hình Trp64Arg gen ADRB3 tình trạng béo phì trẻ mầm non góp phần xây dựng mơ hình dự đốn nguy béo phì trẻ mầm non dựa thông tin kiểu gen số đặc điểm dinh dưỡng, hoạt động thể lực trẻ 4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Kết nghiên cứu góp phần dự đốn sớm nguy béo phì trẻ nên ứng dụng hoạt động nhiều đơn vị như: trường mầm non, phòng khám tư vấn dinh dưỡng, trung tâm y tế dự phòng, chương trình phịng chống bệnh mạn tính khơng lây quốc gia, chương trình giáo dục dinh dưỡng gia đình trường học - Kết nghiên cứu cung cấp phần thông tin cho việc đưa lời khuyên việc chăm sóc trẻ cách để phịng chống béo phì từ giai đoạn nhỏ, từ giúp giảm tỉ lệ béo phì trưởng thành, giảm biến chứng liên quan, giảm gánh nặng cho xã hội chi phí y tế trả cho việc điều trị bệnh liên quan đến béo phì 10 ... chuẩn WHO (2016) Hình 2.2 Phịng thí nghiệm Trung tâm, Đại học Y Hà Nội Hình 2.3 Thi? ??t kế nghiên cứu Hình 2.4 Các thi? ??t bị dùng nghiên cứu Hình 2.5 Cách đo chiều cao đứng trẻ Hình 2.6 Chuẩn bị... vào kết nghiên cứu trên, can thi? ??p phòng chống thừa cân, béo phì thực hiện, cách giảm thời gian xem truyền hình tháng trẻ lớp lớp 16 thu kết tốt Cụ thể, trẻ can thi? ??p giảm thời gian xem truyền... 2016 [78] Năm 2016, theo WHO có khoảng triệu trẻ em tuổi bị thừa cân béo phì, 340 triệu trẻ em thi? ??u niên độ tuổi 5-19 bị thừa cân béo phì [101] Nghiên cứu Nhật Bản khoảng 1/3 trẻ nhỏ thừa cân,