Nguyen Thi Ngoc Lien_hoàn chỉnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ NGỌC LIÊN MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH TRP64ARG TRÊN GEN ADRB3 VÀ TÌNH TRẠNG BÉO PHÌ Ở TRẺ MẦM NON THÀNH PHỐ HÀ NỘI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH Hà Nội - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Liên LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Sinh lý học người Động vật, Khoa Sinh học, Trường đại học Sư phạm Hà Nội cán Phịng Thí nghiệm Trung tâm, Trường đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian học tập tiến hành nghiên cứu Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh tận tình giúp đỡ, truyền dạy kinh nghiệm quý báu hướng dẫn trực tiếp với tất lịng để em hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Đỗ Thị Như Trang nhiệt tình hướng dẫn tơi nhiều kĩ thuật phịng thí nghiệm Tơi xin trân trọng cảm ơn Bộ Giáo dục đào tạo (đề tài mã số B2018SPH50) hỗ trợ kinh phí giúp tơi hồn thành nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục Đào tạo thành phố Hà Nội, Phòng Giáo dục quận huyện, trường Mầm non Hà Nội, học sinh gia đình tạo điều kiện cho tơi tiến hành nghiên cứu Cuối cùng, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình - nguồn động viên tinh thần to lớn giúp vượt qua khó khăn suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Liên MỤC LỤ MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu .3 Ý nghĩa lý luận ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1 Tổng quan béo phì .5 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Tiêu chuẩn xác định tình trạng béo phì trẻ mầm non 1.1.3 Phân loại .8 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh béo phì .9 1.1.5 Các yếu tố nguy dẫn đến béo phì trẻ mầm non 10 1.1.6 Hậu 12 1.1.7 Tình hình thừa cân béo phì trẻ mầm non giới Việt Nam 15 1.2 Tổng quan gen ADRB3 19 1.2.1 Vị trí, cấu trúc chức gen ADRB3 19 1.2.2 Tổng quan SNP rs4994 gen ADRB3 .23 1.2.3 Mối liên quan đa hình Trp64Arg gen ADRB3 đến thừa cân, béo phì 24 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 29 2.2.1 Thời gian nghiên cứu 29 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 29 2.3 Thiết kế nghiên cứu 30 2.4 Vật liệu nghiên cứu .31 2.4.1 Hóa chất 31 2.4.2 Thiết bị 31 2.5 Phương pháp nghiên cứu .32 2.5.1 Các phương pháp thu thập số liệu 32 2.5.2 Soi gel máy chụp gel 43 2.5.3 Phương pháp xử lí số liệu thống kê .43 2.6 Đạo đức nghiên cứu 44 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu 45 3.2 Tối ưu quy trình phân tích kiểu gen ADRB3 rs4994 46 3.2.1 Lựa chọn nhiệt độ bắt mồi 46 3.2.2 Lựa chọn enzyme nồng độ enzyme 47 3.2.3 Kết xác định kiểu gen 48 3.3 Tỉ lệ kiểu gen tần số alen ADRB3 rs4994 trẻ mầm non Hà Nội 49 3.4 Đặc điểm tính trạng liên quan đến béo phì theo kiểu gen 53 3.5 Mối liên quan ADRB3 rs4994 tới béo phì trẻ mầm non 54 3.5.1 Phân bố tỉ lệ kiểu gen theo mơ hình 54 3.5.2 Mối liên quan quan ADRB3 rs4994 béo phì trẻ mầm non phụ thuộc vào giới tính 57 3.5.3 Mối liên quan ADRB3 rs4994 cân nặng trẻ mầm non 60 3.5.4 Mối liên quan ADRB3 rs4994 chiều cao trẻ mầm non 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt ADRB3 AO BMI CI FFA IOTF Viết đầy đủ beta-adrenergic (β adrenoreceptor) Abdominal obesity Body Mass Index Confident Interval Free fatty acids International Obesity Task Force MAF Minor Allele Frequency NCBI National PCR SNP TM UNICEF WC WHO Nghĩa tiếng Việt Center Thụ thể họ adrenergic Béo phì bụng Chỉ số thể Khoảng tin cậy Axit béo tự Tổ chức chuyên trách béo phì quốc tế Tần số nhỏ alen for Trung tâm Thông tin Công nghệ Biotechnology Information sinh học Quốc gia (Hoa kỳ) Polymerase Chain Reaction Single nucleotide polymorphism Stransmembrane segments United Nations Children's Fund Waist circumference World Health Organization Phản ứng chuỗi trùng hợp Đa hình đơn nucleotide Phân đoạn xuyên màng tế bào Quỹ Nhi đồng Hoa Kỳ Chu vi vòng eo Tổ chức Y tế Thế Giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Z-score theo BMI phụ thuộc tuổi giới theo tiêu chuẩn WHO (2016) Bảng 1.2 Ngưỡng BMI theo tuổi giới để xác định thừa cân béo phì trẻ em từ - tuổi Bảng 1.3 Phân loại béo phì theo cân nặng/chiều cao (WHO 2006) .9 Bảng 2.1 Tiêu chuẩn phân loại tình trạng dinh dưỡng cho trẻ tuổi theo WHO (2006) .28 Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 31 Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng phân tích xác định kiểu gen 31 Bảng 2.4 Các thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 2.5 Các thành phần phản ứng cắt với enzyme giới hạn MvaI 38 Bảng 2.6 Lượng agarose cần đun 39 Bảng 2.7 Các thành phần dùng đổ gel 40 Bảng 2.8 Tỉ lệ pha Redsafe dùng đổ gel .40 Bảng 3.1 Đặc điểm nhân trắc nhóm đối tượng nghiên cứu 47 Bảng 3.2 Phân bố kiểu gen tần số alen ADRB3 rs4994 trẻ mầm non 50 Bảng 3.3 Phân bố tỉ lệ kiểu gen ADRB3 rs4994 theo giới tính 51 Bảng 3.4 Đặc điểm nhân trắc nhóm kiểu gen đa hình ADRB3 rs4994 53 Bảng 3.5 Các mơ hình di truyền giả định sử dụng nghiên cứu 54 Bảng 3.6 Phân bố tỉ lệ kiểu gen theo mơ hình nhóm bệnh - chứng .55 Bảng 3.7 Phân bố tỉ lệ kiểu gen theo mơ hình theo giới tính .56 Bảng 3.8 Mối liên quan ADRB3 rs4994 béo phì trẻ mầm non .57 Bảng 3.9 Mối liên quan ADRB3 rs4994 cân nặng trẻ mầm non 61 Bảng 3.10 Mối liên quan ADRB3 rs4994 chiều cao trẻ mầm non 62 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình ngun nhân chế bệnh sinh béo phì Hình 1.2 Tỉ lệ trẻ béo phì tuổi giới năm 2017 Hình 1.3 Số trẻ em thừa cân tuổi theo phân loại thu nhập quốc gia, 2000 2017 Hình 1.4 Vị trí gen ADRB3 nhiễm sắc thể số Hình 1.5 Cấu trúc thụ thể beta Hình 1.6 Các vị trí liên kết phối tử thụ thể beta Hình 1.7 Chức thụ thể beta3-adrenoceptor Hình 1.8 Vị trí rs4994 (Trp64Arg) exon gen ADRB3 Hình 1.9 Sự khuếch đại PCR phân tích điện di Agarose-Gel khu vực Receptor β3-Adrenergic bao gồm đột biến Hình 2.1 Z-score theo BMI phụ thuộc tuổi giới theo tiêu chuẩn WHO (2016) Hình 2.2 Phịng thí nghiệm Trung tâm, Đại học Y Hà Nội Hình 2.3 Thiết kế nghiên cứu Hình 2.4 Các thiết bị dùng nghiên cứu Hình 2.5 Cách đo chiều cao đứng trẻ Hình 2.6 Chuẩn bị cho phản ứng PCR Hình 2.7 Các bước chạy phản ứng PCR Hình 2.8 Chu trình nhiệt chạy PCR Hình 2.9 Các bước ủ sản phẩm PCR với enzyme đặc hiệu Hình 2.10 Các bước đổ gel Hình 2.11 Mẫu ADN tra gel theo thứ tự Hình 2.12 Các bước chạy điện di Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mức nhiệt độ bắt mồi khác Hình 3.2 Hình ảnh điện di sau cắt với enzyme giới hạn MvaI Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (A) sau cắt với enzyme giới hạn (B) Hình 3.4 Tỉ lệ alen đa hình ADRB3 rs4994 số quần thể giới MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Năm 2000, Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO) xem thừa cân béo phì bệnh có ảnh hương nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng kêu gọi nước có hành động nhanh chóng để phịng ngừa bệnh [96] Năm 2016, theo WHO có tới 1,9 tỉ người trương thành từ 18 tuổi trơ lên bị thừa cân, có 650 triệu người bị béo phì [101] Tỉ lệ béo phì tồn giới tăng gần gấp lần từ năm 1976 đến năm 2016 [78] Năm 2014, 2,1 tỉ người, gần 30% dân số toàn cầu bị thừa cân béo phì 5% số ca tử vong tồn giới béo phì Đánh giá tác động kinh tế tồn cầu béo phì ước tính 2,0 nghìn tỉ la Mỹ hay 2,8% tổng sản phẩm quốc nội (GDP) toàn cầu [98] Nghiên cứu cơng bố tờ The Lancet trước Ngày Béo phì Thế giới (11 tháng 10 năm 2017) Tỉ lệ trẻ em thiếu niên bị béo phì giới tăng từ 1% (tương đương năm triệu bé gái sáu triệu bé trai) vào năm 1975 lên gần 6% bé gái (50 triệu) gần 8% bé trai (74 triệu) vào năm 2016 [78] Năm 2016, theo WHO có khoảng triệu trẻ em tuổi bị thừa cân béo phì, 340 triệu trẻ em thiếu niên độ tuổi 5-19 bị thừa cân béo phì [101] Nghiên cứu Nhật Bản khoảng 1/3 trẻ nhỏ thừa cân, béo phì tiếp tục thừa cân, béo phì trương thành [59] Béo phì trẻ em gây nhiều hậu xấu tới sức khỏe, kèm theo bệnh mạn tính khơng lây tim mạch, huyết áp, đái tháo đường type II ung thư Ngồi ra, thừa cân béo phì khiến trẻ mặc cảm, tự ti, bị bạn bè trêu chọc, ảnh hương đến kết học tập mối quan hệ xã hội [47] Nghiên cứu Hà Văn Thiệu (2005) học sinh – 15 tuổi Bình Định ảnh hương bất lợi thừa cân béo phì cho thấy trẻ thừa cân, béo phì có đến 84% bị rối loạn lipid máu, 22% gia tăng huyết áp tâm thu 16% bị tổn thương tâm lý [22] Năm 1997, Ban chuyên gia tư vấn WHO nhận định tình hình thừa cân, béo phì trẻ nhỏ vấn đề sức khỏe phát sinh cần quan tâm [103] Ở Việt Nam, tình trạng béo phì trẻ em ngày gia tăng, đặc biệt khu vực đô thị trơ thành vấn đề sức khỏe cộng đồng đáng báo động Kết điều tra nhân học trước năm 1995 cho thấy tỉ lệ thừa cân, béo phì khơng đáng kể Tuy nhiên, khảo sát thành phố lớn sau có tượng gia tăng tỉ lệ thừa cân, béo phì trẻ lứa tuổi nhà trẻ, mầm non học sinh tiểu học Năm 2011, báo cáo tình hình dinh dưỡng quốc gia trẻ tuổi toàn quốc, tỉ lệ trẻ thừa cân, béo phì 4,8%, tăng gấp lần so với số liệu thu năm 2000 [7] Tính đến năm 2014, tỉ lệ thừa cân, béo phì trẻ tuổi thành phố Hồ Chí Minh 12,6%, Bình Dương 13,4% dự báo tăng nhanh thời gian tới Error: Reference source not found Có nhiều nguyên nhân dẫn đến thừa cân, béo phì chế độ ăn uống, vận động thể lực yếu tố di truyền Thừa cân, béo phì tăng lượng phần ăn giảm hoạt động thể lực kết hợp hai yếu tố [1]., [4] Bên cạnh đó, tương tác gen nhạy cảm với chế độ ăn uống lối sống có tác động khơng nhỏ đến nguy béo phì Nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò yếu tố di truyền liên quan đến phát triển bệnh béo phì Nghiên cứu cặp sinh đơi gia đình ảnh hương yếu tố di truyền (gen) chiếm khoảng 40 - 70% bệnh béo phì Các yếu tố di truyền phân loại theo chế tác động béo phì như: Nhóm gen kích thích ngon miệng (Neuropeptide Y, Leptin receptor, P proopiomelanocortin), nhóm gen liên quan đến tiêu hao lượng (Uncoupling proteins), nhóm gen điều hịa chuyển hóa (Beta-2 adrenergic receptor, Beta-3 adrenergic receptor), nhóm gen liên quan đến biệt hóa phát triển tế bào mỡ (Peroxisome proliferator-activated receptor, Vitamin D receptor, Retinoid X receptor) [50],[84] Các nghiên cứu gần tập trung vào hệ thống thụ thể adrenergic vai trị quan trọng thụ thể kích thích sinh nhiệt kích hoạt vận động lipid từ vị trí tích trữ chất béo Đặc biệt phân nhóm beta2-adrenoceptor beta3-adrenoceptor gen ứng cử Các thụ thể beta3-adrenoceptor kích thích vận động ... 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 29 2.3 Thi? ??t kế nghiên cứu 30 2.4 Vật liệu nghiên cứu .31 2.4.1 Hóa chất 31 2.4.2 Thi? ??t bị 31 2.5 Phương pháp nghiên... chuẩn WHO (2016) Hình 2.2 Phịng thí nghiệm Trung tâm, Đại học Y Hà Nội Hình 2.3 Thi? ??t kế nghiên cứu Hình 2.4 Các thi? ??t bị dùng nghiên cứu Hình 2.5 Cách đo chiều cao đứng trẻ Hình 2.6 Chuẩn bị... cân nặng sau: thi? ??u cân, bình thường, thừa cân, béo phì Để xác định tình trạng dinh dưỡng trẻ cần tính BMI trẻ, sau dựa theo BMI, tuổi giới để xác định điểm xác định đồ thi? ? Từ điểm đối