Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ và ô nhiễm vi sinh vật trong thịt lợn tại cơ sở giết mổ hoàng long trên địa bàn thành phố hải dương

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN NGỌC SƠN KHẢO SÁT THỰC TRẠNG HOẠT ĐỘNG GIẾT MỔ VÀ Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỊT LỢN TẠI CƠ SỞ GIẾT MỔ HOÀNG LONG TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI DƯƠNG Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Ngọc Thạch NHÀ XUấT BảN HọC VIệN NƠNG NGHIệP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận văn trung thực, khách quan chƣa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Sơn i LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn kính trọng sâu sắc tới thầy giáo môn Nội chẩn – Dƣợc – Độc chất, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn kính trọng tới PGS.TS Phạm Ngọc Thạch, ngƣời thầy dành nhiều công sức thời gian tận tình bảo giúp tơi suốt q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lời cám ơn tới giúp đỡ Cơ sở giết mổ Hoàng Long, thành phố Hải Dƣơng Nhân dịp này, cho phép đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới nhà khoa học, thầy cô giáo bạn đồng nghiệp đã, giúp đỡ, tạo điều kiện cho nâng cao kiến thức, hoàn thành luận văn Xin ghi nhận cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè đồng nghiệp động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Sơn ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tình hình hoạt động giết mổ nƣớc 2.1.1 Tình hình giết mổ động vật Thành phố Hồ Chí Minh 2.1.2 Tình hình giết mổ động vật Hà Nội 2.2 Sự hƣ hỏng thịt 2.3 Đƣờng xâm nhập vi khuẩn vào thịt 2.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Việt Nam 2.4.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm bệnh truyền qua thực phẩm 2.4.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 2.4.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn giới Việt Nam 13 2.5 Các nguồn ô nhiễm vi khuẩn vào thịt 15 2.5.1 Lây nhiễm từ khơng khí 15 2.5.2 Lây nhiễm từ nƣớc 16 2.5.3 Lây nhiễm trình giết mổ 17 2.5.5 Lây nhiễm trình phân phối thực phẩm 17 2.6 Những nghiên cứu ô nhiễm vi sinh vật thực phẩm 18 2.7 Các tổ chức hoạt động an toàn vệ sinh thực phẩm 19 2.8 Một số vi khuẩn thƣờng gặp ô nhiễm thịt động vật 21 iii 2.8.1 Tập đoàn vi khuẩn hiếu khí 21 2.8.2 Coliform 22 2.8.3 Escherichia coli 22 2.8.4 Vi khuẩn Salmonella 24 2.8.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 26 2.8.6 Vi khuẩn Clostridium perfringens 26 2.9 Vệ sinh an toàn thực phẩm sở giết mổ chế biến thực phẩm 27 Phần Đối tƣợng, nội dung, nguyên liệu, phƣơng pháp nghiên cứu 29 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 29 3.2 Nội dung nghiên cứu 29 3.2.1 Điều tra, đánh giá thực trạng điều kiện trang thiết bị, công nghệ, vệ sinh thú y ý thức ngƣời tham gia hoạt động giết mổ lợn sở giết mổ Hoàng Long 29 3.2.2 Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn không khí nguồn nƣớc sử dụng giết mổ 29 3.2.3 Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn thịt lợn số sở giết mổ bao gồm tiêu: tổng số vi khuẩn hiếu khí, E Coli, Coliform, Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens 29 3.2.4 Đề xuất giải pháp quy hoạch, quản lý, công nghệ sở theo hƣớng giết mổ tập trung 29 3.3 Nguyên liệu nghiên cứu 29 3.3.1 Mẫu xét nghiệm 29 3.3.2 Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 29 3.3.3 Thiết bị mày móc, dụng cụ hố chất dùng thí nghiệm 29 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 3.4.1 Phƣơng pháp điều tra 30 3.4.2 Phƣơng pháp lấy mẫu kiểm tra đánh giá ô nhiễm vi khuẩn 30 3.4.3 Phƣơng pháp xét nghiệm vi khuẩn 30 3.5 Phƣơng pháp đánh giá xử lý số liệu 32 Phần Kết thảo luận 33 4.1 Thực trạng hoạt động giết mổ sở giết mổ Hoàng Long 33 4.1.1 Về sở hạ tầng, trang thiết bị 34 iv 4.1.2 Đánh giá vệ sinh nhà xƣởng 37 4.2 Kiểm tra mức độ ô nhiễm nƣớc sử dụng sở giết mổ lợn Hoàng Long 37 4.3 Kiểm tra mức độ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn sở giết mổ Hoàng Long 41 4.3.1 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt lợn sở giết mổ Hoàng Long 41 4.3.2 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi khuẩn E.coli thịt lợn 43 4.3.3 Kết kiểm tra tiêu tổng số Coliform 44 4.3.4 Kết kiểm tra tiêu vi khuẩn Staphylococcus aureus 47 4.3.5 Kết kiểm tra tiêu vi khuẩn Clostridium perfringens 49 4.3.6 Tổng hợp kết kiểm tra vi khuẩn ô nhiễm thịt lợn số sở giết mổ 51 Phần Kết luận đề nghị 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Đề nghị 53 Tài liệu tham khảo 55 Phụ lục 59 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ATTP An toàn thực phẩm BNN& PTNT Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn BYT Bộ Y tế CSGM Cơ sở giết mổ FAO Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc NN Nông nghiệp NXB Nhà Xuất QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TT Thông tƣ UBND Ủy ban nhân dân VSATTP Vệ sinh an tồn thực phẩm VSVHK Vi sinh vật khí WHO Tổ chức Y tế giới vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm nƣớc ta từ 2011 đến 2018 14 Bảng 2.2 Quy định tạm thời vệ sinh thú y sở giết mổ động vật 27 Bảng 4.1 Địa chỉ, quy mô giết mổ hộ khu giết mổ tập trung Hoàng Long 33 Bảng 4.2 Kết kiểm tra, đánh giá tiêu sở giết mổ lợn quy định Thông tƣ 09/2016/TT-BNNPTNT 35 Bảng 4.3 Kết kiểm tra tiêu Coliform nƣớc sử dụng cho hoạt động giết mổ CSGM Hoàng Long 39 Bảng 4.4 Kết kiểm tra tiêu E.coli nƣớc sử dụng cho hoạt động giết mổ CSGM Hoàng Long 40 Bảng 4.5 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt lợn 42 Bảng 4.6 Kết kiểm tra tiêu E coli thịt lợn 43 Bảng 4.7 Kết kiểm tra tổng số Coliform thịt lợn CSGM Hoàng Long 45 Bảng 4.8 Kết kiểm tra Salmonella thịt CSGM Hoàng Long 47 Bảng 4.9 Kết kiểm tra Staphylococcus aureus thịt CSGM Hoàng Long 48 Bảng 4.10 Kết kiểm tra Clostridium perfringens thịt CSGM Hoàng Long 50 Bảng 4.11 Tổng hợp kết kiểm tra vi khuẩn ô nhiễm thịt lợn CSGM Hoàng Long 51 vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Khu vực nhà xƣởng sở giết mổ Hoàng Long 36 Hình 4.2 Khu ni nhốt trƣớc thịt sở giết mổ Hồng Long 37 Hình 4.3 Bể chƣa nƣớc sở giết mổ Hoàng Long 38 Hình 4.4 Tỷ lệ mẫu nhiễm Coliform nƣớc sử dụng cho hoạt động giết mổ CSGM Hoàng Long 39 Hình 4.5 Tỷ lệ mẫu nhiễm E.coli nƣớc sử dụng cho hoạt động giết mổ CSGM Hoàng Long 40 Hình 4.6 Dụng cụ đựng nƣớc sở giết mổ Hồng Long 41 Hình 4.7 Mức độ ô nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt lợn 42 Hình 4.8 Kết kiểm tra tiêu E coli thịt lợn 44 Hình 4.9 Kết kiểm tra tổng số Coliform thịt lợn CSGM Hoàng Long 45 Hình 4.10 Kết kiểm tra Salmonella thịt CSGM Hồng Long 47 Hình 4.11 Kết kiểm tra Staphylococcus aureus thịt CSGM Hoàng Long 49 Hình 4.12 Kết kiểm tra Clostridium perfringens thịt CSGM Hoàng Long 50 Hình 4.13 Tổng hợp kết kiểm tra vi khuẩn nhiễm thịt lợn CSGM Hồng Long 51 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Ngọc Sơn Tên đề tài: Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn sở giết mổ Hoàng Long địa bàn thành phố Hải Dƣơng Mã số: 8640101 Ngành: Thú y Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Phát lƣu hành virus cúm H5N1, H5N6 số chợ biên giới chợ nội địa địa bàn tỉnh Lạng Sơn, đồng thời theo dõi thay đổi tỷ lệ lƣu hành chủng nhằm cảnh báo sớm dịch cúm gia cầm đề xuất biện pháp phòng chống dịch cho phù hợp Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp điều tra Lập bảng biểu thu thập số liệu thực trạng hoạt động giết mổ; vấn ngƣời liên quan đến nội dung nghiên cứu đề tài Sử dụng phƣơng pháp thống kê chun mơn để tính số liệu điều tra - Phƣơng pháp lấy mẫu kiểm tra đánh giá ô nhiễm vi khuẩn Tại trƣờng, mẫu thịt đƣợc lấy theo Quy chuẩn QCVN 01 - 04: 2009/BNNPTNT xử lý phịng thí nghiệm theo TCVN 4833-1:2002; TCVN 48332:2002 Kết đƣợc đánh giá theo TCVN 7046 : 2009 Mẫu nƣớc đƣợc lấy bảo quản mẫu theo tiêu chuẩn TCVN 6663/2011, kết đƣợc đánh giá theo quy chuẩn QCVN 01 : 2009/BYT Khơng khí đƣợc lấy mẫu theo phƣơng pháp lắng bụi Koch - Phƣơng pháp xét nghiệm vi khuẩn Xác định tổng số vi khuẩn Coliform, E Coli giả định nƣớc theo TCVN 6187-2 : 1996; Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí khơng khí theo phƣơng pháp lắng bụi Koch; Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt theo TCVN 4884 : 2005; Xác định E coli thịt theo TCVN 7924-2 : 2008; Định tính vi khuẩn Salmonella thịt theo TCVN 4829 : 2005; Xác định tổng số Staphylococcus aureus thịt theo TCVN 4830-1 : 2005; Xác định tổng số vi khuẩn Clostridium perfringens thịt theo TCVN 4991:2005; Xác định Coliforms tổng số thịt theo TCVN 6848:2007; Phƣơng pháp định danh vi khuẩn máy định danh Vitek2 compact ix Sử dụng thiết bị phịng thử nghiệm vi sinh thơng thƣờng cụ thể là: 6.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) để khử trùng ƣớt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.2 Tủ ấm, có khả hoạt động 30 °C ± °C 6.3 Đĩa Petri, thủy tinh chất dẻo có đƣờng kính từ 90 mm đến 100 mm 6.4 Pipet, có dung tích danh định ml 6.5 Nồi cách thủy, hoạt động 44 °C đến 47 °C 6.6 Thiết bị đếm khuẩn lạc, ví dụ: sử dụng chiếu sáng với phơng tối, đƣợc gắn với kính lúp có độ phóng đại thích hợp khoảng 1,5 x đếm học điện tử số 6.7 pH mét, có độ xác ± 0,1 đơn vị pH 25 °C 6.8 Ống nghiệm, bình chai có dung tích thích hợp không lớn 500 ml Lấy mẫu Điều quan trọng phòng thử nghiệm nhận đƣợc mẫu đại diện không bị hƣ hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Xem tiêu chuẩn riêng lấy mẫu cho sản phẩm tƣơng ứng Nếu chƣa có tiêu chuẩn riêng bên liên quan tự thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Việc chuẩn bị mẫu thử theo phần tƣơng ứng TCVN 6507 (ISO 6887) TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn riêng tƣơng ứng với sản phẩm Nếu chƣa có tiêu chuẩn riêng bên liên quan tự thoả thuận với vấn đề Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng Xem phần tƣơng ứng TCVN 6507 (ISO 6887) tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm 9.2 Cấy ủ 9.2.1 Lấy hai đĩa Petri vô trùng (6.3) Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào đĩa ml mẫu thử sản phẩm chất lỏng ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác (độ pha loãng 10-1) 9.2.2 Lấy hai đĩa Petri vô trùng (6.3) khác Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào đĩa ml dịch pha loãng 10-1 (nếu sản phẩm chất lỏng) ml dung dịch pha loãng 102 (nếu sản phẩm dạng khác) 71 9.2.3 Lặp lại trình tự với dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng dung dịch pha lỗng thập phân, cần 9.2.4 Nếu thích hợp có thể, chọn bƣớc pha lỗng tới hạn (ít hai dung dịch pha lỗng thập phân liên tiếp) để cấy đĩa Petri cho thu đƣợc số đếm từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc đĩa petri 9.2.5 Rót vào đĩa Petri khoảng từ 12 ml đến 15 ml môi trƣờng thạch đếm đĩa (5.2) 44 °C đến 47 °C Thời gian từ chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 10-1 sản phẩm chất lỏng) đến rót mơi trƣờng (5.2) vào đĩa không đƣợc vƣợt 45 phút 9.2.6 Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trƣờng cách xoay đĩa Petri hỗn hợp đông đặc lại cách đặt đĩa Petri bề mặt nằm ngang, mát 9.2.7 Sau đơng đặc hồn tồn nghi ngờ sản phẩm cần kiểm tra có chứa vi sinh vật mà khuẩn lạc chúng mọc lan khắp bề mặt mơi trƣờng, rót khoảng ml mơi trƣờng phủ (5.3) 44 °C đến 47 °C lên bề mặt môi trƣờng cấy mẫu Để cho đông đặc nhƣ mô tả 9.2.8 Lật ngƣợc đĩa cấy mẫu đặt vào tủ ấm (6.2) 30 °C ± °C 72 h ± h Không xếp chồng cao sáu đĩa Các chồng đĩa cần đƣợc tách khỏi cách xa thành tủ 9.3 Đếm khuẩn lạc 9.3.1 Sau giai đoạn ủ qui định (9.2.8), đếm khuẩn lạc đĩa (10.1) sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (6.6), cần Kiểm tra đĩa dƣới ánh sáng dịu Điều quan trọng khuẩn lạc phải đƣợc đếm tránh đếm nhầm với hạt không hòa tan chất kết tủa đĩa Kiểm tra cẩn thận khuẩn lạc nghi ngờ, cần nên dùng kính lúp có độ khuyếch đại lớn để phân biệt khuẩn lạc với tạp chất lạ 9.3.2 Các khuẩn lạc mọc lan rộng đƣợc coi khuẩn lạc đơn lẻ Nếu hợp phần tƣ đĩa mọc dày lan rộng, đếm khuẩn lạc phần đĩa cịn lại tính số tƣơng ứng cho đĩa Nếu phần tƣ đĩa bị mọc dầy lan rộng loại bỏ đĩa khơng đếm 10 Biểu thị kết 10.1 Phƣơng pháp tính Xem phần sửa đổi ISO 7218 : 1996 10.2 Độ chụm 10.2.1 Yêu cầu chung 72 Các liệu độ chụm đƣợc đánh giá đĩa chứa nhiều 15 khuẩn lạc 300 khuẩn lạc Dữ liệu độ chụm phụ thuộc vào liên kết hệ vi sinh vật chất mẫu Các liệu thu đƣợc từ nghiên cứu cộng tác (xem [1], [2] [3]) có giá trị sữa nguyên liệu sữa trùng Chúng đƣợc dùng làm số ƣớc tính cần xác định số khuẩn lạc có sản phẩm khác 10.2.2 Độ lặp lại Chệnh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập đơn lẻ, thu đƣợc sử dụng cùng, phƣơng pháp, vật liệu thử giống hệt nhau, phòng thử nghiệm, ngƣời thực hiện, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn, tính theo log10 vi sinh vật có lít (tƣơng ứng với 1,8 thang danh định số vi sinh vật lít) khơng đƣợc lớn giới hạn lặp lại r = 0,25 CHÚ THÍCH: Giới hạn lặp lại thu đƣợc từ nghiên cứu cộng tác sữa nguyên liệu sữa tiệt trùng (xem [1], [2] [3]) đƣợc sử dụng cho sản phẩm nhƣ 10.2.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử đơn lẻ, thu đƣợc sử dụng phƣơng pháp vật liệu thử giống hệt phòng thử nghiệm khác nhau, ngƣời khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, tính theo log10 vi sinh vật có lít (tƣơng ứng với 2,8 thang danh định số vi sinh vật lít) khơng đƣợc lớn giới hạn tái lập R = 0,45 CHÚ THÍCH Giới hạn tái lập thu đƣợc từ nghiên cứu cộng tác sữa nguyên liệu sữa tiệt trùng (xem [1], [2] [3]) đƣợc sử dụng cho sản phẩm nhƣ 10.3 Giải thích kết thử nghiệm Trong ví dụ dƣới xem xét đến số liệu độ chụm trung bình, mức xác suất 95 % phân tích mẫu Trong thực tế thƣờng sử dụng trung bình vài mẫu Các số đƣợc tính số vi sinh vật lít a) Các điều kiện lặp lại Kết thứ nhất: 105 = 100 000 Chênh lệch kết thứ kết thứ hai không đƣợc lớn 0,25 log10 đơn vị Kết thứ hai: log 104,75 = 56 000 log 105,25 = 178 000 Chênh lệch kết thứ thứ hai đƣợc chấp nhận kết thứ hai không thấp 56 000 không cao 178 000 b) Các điều kiện tái lập 73 Các kết thu đƣợc phịng thử nghiệm thứ (trung bình phép xác định kép): 105 = 100 000 Chênh lệch kết thứ thứ hai thu đƣợc phịng thử nghiệm thứ hai khơng đƣợc lớn 0,45 log10 đơn vị: Các kết thứ hai: log 104,55 = 36 000 log 105,45 = 280 000 Chênh lệch kết thu đƣợc phịng thử nghiệm thứ thứ hai chấp nhận đƣợc phòng thử nghiệm thứ hai thu đƣợc kết không thấp 36 000 không cao 280 000 Phụ lục A cho thấy cách tính cách sử dụng sai lệch tới hạn (CD) để giải thích kết 10.4 Giới hạn tin cậy Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phƣơng pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phƣơng pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác không đƣợc quy định tiêu chuẩn điều đƣợc coi tùy ý nhƣ cố mà ảnh hƣởng đến kết quả: e) kết thử nghiệm thu đƣợc Phụ lục A (tham khảo) Cách sử dụng sai lệch tới hạn (CD) để giải thích kết Trong ví dụ dƣới xem xét đến liệu độ chụm trung bình, mức xác suất 95 % phân tích mẫu Trong thực tế thƣờng sử dụng trung bình vài mẫu Các số đƣợc tính số vi sinh vật lít a) Các điều kiện tái lập Các kết thu đƣợc phịng thử nghiệm thứ (trung bình phép xác định kép): 105 = 100 000 Chênh lệch kết kết thu đƣợc phịng thử nghiệm thứ hai (trung bình n phép xác định: ví dụ n = 2) đƣợc chấp nhận khơng vƣợt q sai lệch tới hạn (CD), theo log10 đơn vị: 74 r giới hạn lặp lại; R giới hạn tái lập Chênh lệch kết thu đƣợc phòng thử nghiệm thứ thứ hai chấp nhận đƣợc phịng thử nghiệm thứ hai thu đƣợc kết không thấp 104,59 = 39 000 không cao 105,41 = 257 000 b) So sánh với giới hạn (thử phía) Giới hạn: 105 = 100 000 Chênh lệch giới hạn kết phịng thử nghiệm (trung bình n phép xác định, ví dụ n = 2) đƣợc so sánh với giới hạn sai lệch tới hạn (CDL): Các kết thử nghiệm đến 105,24 = 174 000 không đƣợc không phù hợp với giới hạn 75 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6848:2007 ISO 4832:2007 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG COLIFORM – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of coliforms – Colony-count technique Lời nói đầu TCVN 6848:2007 thay TCVN 6848:2001 TCVN 6262-1:1997; TCVN 6848:2007 hoàn toàn tƣơng đƣơng với ISO 4832:2007; TCVN 6848:2007 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Do tính đa dạng thực phẩm thức ăn chăn nuôi nên phƣơng pháp khơng thích hợp đến chi tiết cho sản phẩm cụ thể Trong trƣờng hợp này, sử dụng phƣơng pháp khác đặc trƣng cho sản phẩm, hồn tồn lý kỹ thuật Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phƣơng pháp Khi tiêu chuẩn quốc tế ISO 4832 đƣợc sốt xét cần phải tính đến thông tin liên quan đến phạm vi mà phƣơng pháp đếm đĩa phải tuân theo nguyên nhân gây sai lệch so với phƣơng pháp trƣờng hợp sản phẩm cụ thể Việc hài hòa phƣơng pháp thử khơng thực đƣợc vài nhóm sản phẩm tồn tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn Trong trƣờng hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm phải tuân theo tiêu chuẩn Thơng thƣờng tiêu chuẩn nhƣ đƣợc sốt xét, chúng phải đƣợc sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, cho cuối sai lệch với phƣơng pháp đếm đĩa lý kỹ thuật đƣợc thừa nhận Kỹ thuật mơ tả tiêu chuẩn có độ xác cao so với kỹ thuật mơ tả TCVN 4882 (ISO 4831), nhƣng không cho phép kiểm tra vi sinh vật thực mẫu thử lớn Do đó, phƣơng pháp thích hợp mẫu thử có mặt coliform với số lƣợng lớn Hơn nữa, định nghĩa “coliform” hai tiêu chuẩn khác nhau, nên vi sinh vật đếm đƣợc không cần thiết phải giống Đối với sản phẩm cụ thể kỳ phƣơng pháp đƣợc chọn đƣợc quy định tiêu chuẩn sản phẩm Đối với mục đích phƣơng pháp thử thực tế, định nghĩa “coliform” đƣa điều đƣợc sử dụng làm sở cho quy trình khơng cần thiết phải giống hệt với 76 định nghĩa tƣơng ứng đƣa ấn khác Phƣơng pháp mô tả tiêu chuẩn phát hiện, theo trung bình, khoảng 90 % chủng vi sinh vật liên quan đến ấn khác “coliform (giả định)” (ví dụ: chủng Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella) (xem [2]) VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG COLIFORM – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of coliforms – Colony-count technique Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đƣa hƣớng dẫn chung định lƣợng coliform Tiêu chuẩn áp dụng cho: - thực phẩm thức ăn chăn nuôi, - mẫu môi trƣờng khu vực sản xuất chế biến thực phẩm kỹ thuật đếm khuẩn lạc môi trƣờng đặc sau ủ 30 °C 37 °C CHÚ THÍCH Nhiệt độ cần đƣợc thỏa thuận bên có liên quan Trong trƣờng hợp sữa sản phẩm sữa, nhiệt độ ủ 30 °C Kỹ thuật đƣợc khuyến cáo sử dụng số lƣợng khuẩn lạc cần tìm dự kiến lớn 100 mililit gam mẫu thử Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên đƣợc nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6507 (ISO 6887) (tất phần), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn gia súc – Nguyên tắc chung kiểm tra vi sinh vật TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa sản phẩm sữa – Hƣớng dẫn chung chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of cultute media in the laboratory (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Hƣớng dẫn chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy – Phần 1: Các 77 hƣớng dẫn chung để đảm bảo chất lƣợng cho việc chuẩn bị mơi trƣờng ni cấy phịng thử nghiệm) ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Hƣớng dẫn chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy – Phần 2: Các hƣớng dẫn thực hành phép thử môi trƣờng nuôi cấy) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 coliform (coliorms) vi khuẩn nhiệt độ quy định (nghĩa 30 °C 37 °C nhƣ thỏa thuận) hình thành khuẩn lạc đặc trƣng thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể phép thử khẳng định có lên men lactoza có sinh khí dƣới điều kiện thử quy định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị hai môi trƣờng đặc chọn lọc, lấy lƣợng mẫu thử theo quy định sản phẩm ban đầu chất lỏng, lấy lƣợng huyền phù ban đầu theo quy định sản phẩm dạng khác Chuẩn bị cặp đĩa môi trƣờng chọn lọc khác điều kiện, dùng dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu 4.2 Ủ đĩa 30 °C 37 °C (nhƣ thỏa thuận) 24 h 4.3 Đếm khuẩn lạc đặc trƣng cần, số khuẩn lạc đƣợc khẳng định lên men lactoza 4.4 Số coliform có mililit gam mẫu thử đƣợc tính từ số khuẩn lạc đặc trƣng thu đƣợc đĩa đƣợc chọn [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Môi trƣờng nuôi cấy dịch pha loãng 5.1 Khái quát Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 ISO/TS 11133-2 việc chuẩn bị, pha chế thử tính mơi trƣờng cấy 5.2 Dịch pha loãng Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra 78 5.3 Môi trƣờng đặc chọn lọc: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL) 5.3.1 Thành phần Dịch thủy phân mô động vật enzym 7g Cao men 3g Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g Natri clorua 5g Muối mật (bile salts) 1,5 g Đỏ trung tính 0,03 g Tím tinh thể 0,002 g Thạch 12 g đến 18 ga Nƣớc 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông thạch 5.3.2 Chuẩn bị Tiến hành nhƣ sau để giữ đƣợc tính chọn lọc đặc trƣng môi trƣờng Trộn kỹ thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh khơ nƣớc để n vài phút Chỉnh pH cho sau đun sôi pH 7,4 ± 0,2 25 °C Đun đến sôi khuấy cho tan hết Giữ sôi phút Làm nguội môi trƣờng nồi cách thủy (6.5) nhiệt độ 44 °C đến 47 °C Để tránh làm nhiệt, không đun môi trƣờng q lâu nhƣ khơng đun lại Do đó, khơng khử trùng nồi áp lực cần kiểm tra độ vô trùng môi trƣờng thời điểm sử dụng (xem 9.2.2) Sử dụng mơi trƣờng vịng h sau chuẩn bị 5.3.3 Kiểm tra tính đảm bảo chất lƣợng môi trƣờng cấy Đối với việc xác định tính chọn lọc hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1 Kiểm tra tính thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL) theo ISO/TS 111332:2003, Bảng B.1 5.4 Môi trƣờng khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng 79 5.4.1 Thành phần Dịch thủy phân casein emzym 10 g Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g Mật bị khơ 20 g Lục sáng (Brilliant green) 0,0133 g Nƣớc 000 ml 5.4.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trƣờng hồn chỉnh khơ nƣớc cách đun nóng nhẹ, cần, nồi cách thủy (6.5) Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,2 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển 10 ml môi trƣờng vào ống nghiệm (6.7) chứa ống Durham (6.8) Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực (6.1) 121 °C Các ống Durham khơng đƣợc chứa bọt khí sau khử trùng Thiết bị dụng cụ thủy tinh Sử dụng thiết bị thơng thƣờng phịng thử nghiệm vi sinh [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể sau: 6.1 Thiết bị để trùng khô (tủ sấy) để trùng ƣớt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.2 Tủ ấm, hoạt động 30 °C ± °C 37 °C ± 1°C 6.3 Đĩa Petri, thủy tinh chất dẻo có đƣờng kính từ 90 mm đến 100 mm 6.4 Pipet xả hết, có dung tích danh định ml 6.5 Nồi cách thủy, thiết bị tƣơng tự có khả hoạt động từ 44 °C đến 47 °C 100 °C 6.6 Thiết bị đếm khuẩn lạc, gồm nguồn chiếu sáng dụng cụ đếm học điện tử 6.7 Ống nghiệm, kích thƣớc khoảng 16 mm x 160 mm 6.8 Ống Durham, có kích thƣớc phù hợp với ống nghiệm (6.7) 6.9 Bình chai, để đun sôi bảo quản môi trƣờng cấy 6.10 pH met, xác đến ± 0,1 đơn vị pH 25 °C 80 6.11 Que cấy vòng, platin-iridi niken-crom, đƣờng kính khoảng mm, loại vòng cấy dùng lần Lấy mẫu Lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp sản phẩm tƣơng ứng Nếu khơng có tiêu chuẩn nhƣ bên liên quan cần thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể bên liên quan thỏa thuận với vấn đề Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dịch pha loãng Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) dung dịch pha loãng TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO 8261) tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra 9.2 Cấy ủ ấm mẫu 9.2.1 Chuẩn bị hai đĩa sản phẩm dạng lỏng và/hoặc pha loãng chọn Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào tâm đĩa ml mẫu thử sản phẩm lỏng dung dịch pha lỗng thích hợp Sử dụng pipet vô trùng cho dung dịch pha lỗng 9.2.2 Rót khoảng 15 ml mơi trƣờng VRBL (5.3) 44 °C đến 47 °C vào đĩa Petri Thời gian tính từ kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 1/10 sản phẩm lỏng) đến thời điểm rót môi trƣờng vào đĩa không vƣợt 15 phút Trộn dịch cấy với môi trƣờng hỗn hợp đông đặc lại cách đặt đĩa Petri mặt phẳng ngang, mát Đồng thời chuẩn bị đĩa kiểm tra với 15 ml môi trƣờng để kiểm tra độ vơ trùng 9.2.3 Sau đơng đặc hồn tồn, rót khoảng ml mơi trƣờng VRBL (5.3) 44 °C đến 47 °C lên bề mặt môi trƣờng cấy Để cho đông lại nhƣ mô tả 9.2.4 Lật ngƣợc đĩa cấy để vào tủ ấm (6.2) 30 °C 37 °C (nhƣ thỏa thuận) 24 h ± h 9.3 Đếm khuẩn lạc Sau thời gian ủ quy định (xem 9.2.4), có thể, chọn đĩa Petri có từ 10 khuẩn lạc trở lên đến 150 khuẩn lạc Dùng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.6) để đếm khuẩn lạc màu đỏ ánh tía có đƣờng kính 0,5 mm lớn (đơi có vùng mật tủa đỏ bao 81 quanh) Các khuẩn lạc đƣợc coi coliform điển hình khơng cần phải thử khẳng định tiếp Đối với chi tiết kỹ thuật đếm khuẩn lạc, xem TCVN 6404 (ISO 7218) Cũng đếm khẳng định khuẩn lạc điển hình (ví dụ kích cỡ nhỏ hơn), tất khuẩn lạc có nguồn gốc từ sản phẩm sữa có chứa đƣờng khơng phải lactoza, sau ủ theo 9.4 Việc chuyển hóa đƣờng khơng phải đƣờng lactoza làm cho khuẩn lạc có hình dạng nhìn tƣơng tự nhƣ coliform điển hình CHÚ THÍCH Vẻ bề ngồi vùng mật tủa đỏ bao quanh khuẩn lạc phụ thuộc vào loại coliform chất lƣợng môi trƣờng 9.4 Khẳng định Cấy năm khuẩn lạc loại khơng điển hình, sẵn có, cho vào ống nghiệm canh thang mật lactoza lục sáng (5.4) Ủ ống nghiệm tủ ấm (6.2) đặt 30 °C 37 °C (theo thỏa thuận) 24 h ± h Các ống Durham cho thấy có sinh khí đƣợc coi có chứa Coliform Lấy kết đếm phép tính (điều 10) 10 Biểu thị kết Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 11 Độ chụm Căn vào phân bố Poission vi sinh vật chất nền, mà giới hạn tin cậy phƣơng pháp biến đổi theo số đếm khuẩn lạc ± 16 % đến ± 52 % (xem Tài liệu tham khảo [3]) Trên thực tế , sai lệch chí cịn lớn Trong nghiên cứu cộng tác khác nhau, độ lệch chuẩn độ lặp lại (sr) 0,20 log đơn vị, độ lệch chuẩn độ tái lập (sR) 0,35 log đơn vị (xem Tài liệu tham khảo [4] [5]) Chi tiết giới hạn tin cậy, xem TCVN 6404 (ISO 7218) 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ra: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phƣơng pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phƣơng pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thƣờng khác ảnh hƣởng tới kết quả; - kết thử nghiệm thu đƣợc; - độ lặp lại đƣợc kiểm tra, nêu kết cuối thu đƣợc 82 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC TRẠNG HOẠT ĐỘNG GIẾT MỔ VÀ Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỊT LỢN 83 84 85 ... tài: ? ?Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn sở giết mổ Hoàng Long địa bàn thành phố Hải Dương? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định đƣợc mức độ ô nhiễm vi sinh vật thịt. .. ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn sở giết mổ Hoàng Long 41 4.3.1 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt lợn sở giết mổ Hoàng Long 41 4.3.2 Kiểm tra tình trạng. .. vi khuẩn ô nhiễm thịt lợn CSGM Hoàng Long 51 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Ngọc Sơn Tên đề tài: Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ ô nhiễm vi sinh vật thịt lợn sở