Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro và cảm ứng rễ tơ ở cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debeaux)

Trong nghiên cứu này, loài Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debeaux), một cây dược liệu quý, thu thập từ Quản Bạ, tỉnh Hà Giang, Việt Nam được khảo sát khả năng tái sinh in vitro và cảm ứng rễ tơ.

TNU Journal of Science and Technology 226(05): 139 - 146 STUDY ON IN VITRO REGENERATION SYSTEM AND HAIRY ROOT INDUCTION IN CHINESE ACONITE (ACONITUM CARMICHAELII DEBEAUX) PLANT Hoang Thi Thu Hoan1,2, Tran Thi Hong1, Nguyen Huu Quan1, Nguyen Thi Ngoc Lan1*, Chu Hoang Mau1 1TNU 2Tan - University of Education Trao University, Tuyen Quang ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 11/3/2021 In this study, Chinese aconite (Aconitum carmichaelii Debeaux), a precious medicinal plant, collected from Quan Ba, Ha Giang province, Vietnam, was investigated for in vitro regeneration and hairy root induction The optimal medium for multi-shoot induction from stem segments was MS + 30 g L-1 saccharose + g L-1 agar + 1.5 mg L-1 BAP with the result of 4.57 shoots per explants The maximum roots per shoot after weeks of culture was achieved with MS medium supplemented with 0.5 mg L-1 IBA at 2.70 ± 0.04 (roots /a shoot) Hairy roots were produced from root explants of A carmichaelii infected by Agrobacterium rhizogenes strain ATTC 15834 and cultured on MS + 30 g L-1 saccharose + 500 mg L-1 cefotaxime + 100 μmol L-1 AS The highest fresh weight of hairy roots was obtained in liquid medium under shaking conditions, with 3.22 g of fresh weight After weeks, the hairy root mass was increased 5.85-fold compared to the initial mass In vitro regeneration system will be used for gene expression analysis, and hairy root lines will be used to obtain bioactive compounds Revised: 18/4/2021 Published: 23/4/2021 KEYWORDS Aconitum carmichaelii Hairy root induction In vitro regeneration Multiple shoots Stem segments NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO VÀ CẢM ỨNG RỄ TƠ Ở CÂY Ô ĐẦU (ACONITUM CARMICHAELII DEBEAUX) Hoàng Thị Thu Hoàn1,2, Trần Thị Hồng1, Nguyễn Hữu Quân1, Nguyễn Thị Ngọc Lan1*, Chu Hoàng Mậu1 1Trường 2Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên Đại học Tân Trào, Tuyên Quang THÔNG TIN BÀI BÁO Ngày nhận bài: 11/3/2021 Ngày hoàn thiện: 18/4/2021 Ngày đăng: 23/4/2021 TỪ KHÓA Aconitum carmichaelii Cảm ứng rễ tơ Đa chồi Đoạn thân Tái sinh in vitro * TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, lồi Ơ đầu (Aconitum carmichaelii Debeaux), dược liệu quý, thu thập từ Quản Bạ, tỉnh Hà Giang, Việt Nam khảo sát khả tái sinh in vitro cảm ứng rễ tơ Môi trường tối ưu cho cảm ứng đa chồi từ đoạn thân MS + saccharose 30 g L-1 + agar g L-1 + BAP 1,5 mg L-1 cho 4,57 chồi/mẫu cấy Số rễ tối đa chồi sau tuần ni cấy đạt mơi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg L-1 2,70 ± 0,04 (rễ /chồi) Rễ tơ tạo từ đoạn rễ in vitro sau nhiễm Agrobacterium rhizogenes ATTC 15834 nuôi cấy MS + saccharose 30 g L -1 + cefotaxime 500 mg L-1 + AS 100 μmol L-1 Khối lượng rễ tơ tươi cao thu môi trường lỏng điều kiện nuôi lắc 3,22 g Sau tuần, khối lượng rễ tơ tăng gấp 5,85 lần so với khối lượng ban đầu Hệ thống tái sinh in vitro sử dụng phân tích biểu gen, dịng rễ tơ sử dụng để thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học Corresponding author Email: ntnlan.dhsptn@tnu.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 139 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 139 - 146 Giới thiệu Việt Nam biết đến quốc gia đa dạng sinh học, nơi có tiềm cao nguồn dược liệu Do áp lực khai thác không bền vững để đáp ứng nhu cầu dược liệu ngày cao, nhiều loài thuốc quý bị đe dọa biến với tốc độ nhanh Lồi Ơ đầu (A carmichaelii) thuộc chi Aconitum, họ Ranunculaceae, thường mọc hoang vùng núi cao phía Bắc Việt Nam [1], khó tìm thấy Ơ đầu tự nhiên Ô đầu loại dược liệu quý y học cổ truyền phương Đơng Các hợp chất Ơ đầu aconitin, flavonoid, polysacharid axit hữu khác chủ yếu tập trung rễ củ Các chất có tác dụng giảm đau, chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, chúng ngăn chặn gia tăng tế bào ung thư phá hủy chất pentobarbital natri gây tế bào tim [2]-[5] Ngồi ra, Ơ đầu người dân địa phương trồng rộng rãi theo truyền thống loại rau ăn củ Trung Quốc [6] Ở Việt Nam, cháo Ơ đầu ăn ưa thích người miền núi phía Bắc Việt Nam nay, Ô đầu trồng để chiết xuất hợp chất có hoạt tính sinh học cung cấp nguyên liệu để làm dược phẩm [7] Vì vậy, thiết lập hệ thống tái sinh in vitro cảm ứng tạo rễ tơ quan tâm nhiều cho mục đích tăng thu nhận chất có hoạt tính sinh học Một số loài thuộc chi Aconitum nhân giống in vitro thành công Aconitum balfourii [8], Aconitum heterophyllum [9], Aconitum violaceum [10] Aconitum ferox [11] Tuy nhiên, đến chưa tìm báo cáo kết tái sinh đa chồi nuôi cấy rễ tơ Ơ đầu cơng bố Nghiên cứu trình bày kết khảo sát khả tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen cảm ứng rễ tơ Ô đầu Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu thực vật để ni cấy in vitro khử trùng mẫu Củ Ơ đầu thu huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang trồng chậu vườn thí nghiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Khi Ô đầu - đốt thân, tiến hành thu đoạn thân chứa đốt để sử dụng làm mẫu cấy (Hình 1) Mẫu cấy ngâm xà phịng lỗng 15 - 30 phút, tráng nước cất vơ trùng Sau mẫu cấy khử trùng cồn 70% phút tráng nước cất vô trùng Tiếp tục khử trùng bề mặt HgCl2 0,1% (w/v) 3, 5, 7, 11 phút Cuối mẫu cấy rửa lại - lần nước cất vơ trùng Hình Cây Ô đầu trồng từ củ thu huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang vườn thí nghiệm Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên (Ảnh chụp tác giả) 2.2 Thiết lập hệ thống nuôi cấy cảm ứng tạo đa chồi http://jst.tnu.edu.vn 140 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 226(05): 139 - 146 Các đoạn thân mang mắt tái sinh môi trường MS [12], bổ sung kích thích sinh trưởng Tái sinh in vitro điều kiện phịng ni cấy với nhiệt độ 25±2°C độ ẩm 60 80%, cường độ chiếu sáng 2000 lux, với chu kỳ quang 16 Tái sinh đa chồi môi trường MS bổ sung saccharose 30g L-1 agar 9g L-1 BAP kinetin (Kin) với nồng độ từ 0,5 đến 2,0mg L-1 Các mẫu đối chứng nuôi cấy môi trường MS bổ sung saccharose 30g L-1 agar 9g L-1, khơng có BAP Kin Mỗi thí nghiệm nuôi cấy thực 30 mẫu Đánh giá khả tạo chồi sau 2, 4, 6, tuần nuôi cấy 2.3 Tạo rễ in vitro Các chồi sinh trưởng đạt kích thước khoảng - cm, có - chuyển mơi trường tạo rễ (MS bổ sung saccharose 30 g L-1 agar g L-1 IAA IBA dao động từ 0,3 đến 0,9mg L-1 ) Khả cảm ứng tạo rễ in vitro đánh giá sau 4, 6, tuần nuôi cấy 2.4 Cảm ứng rễ tơ Lá, cuống lá, đoạn rễ Ô đầu in vitro sau tuần nuôi cấy dùng làm nguyên liệu để tạo rễ tơ Chủng A rhizogenes ATTC 15834 nuôi phục hồi nuôi cấy mơi trường rắn 48 28°C, sau khuẩn lạc đơn lẻ chuyển sang nuôi lắc mơi trường LB lỏng 28°C với 200 vịng/phút lắc 16 Dung dịch A rhizogenes ATTC 15834 ly tâm để thu sinh khối Hỗn dịch chủng A rhizogenes ATTC 15834 pha lỗng với mơi trường MS0 lỏng xác định mật độ vi khuẩn máy quang phổ bước sóng 600 nm, sau thêm acetosyringone (AS) 100 mmol L-1 Các mẫu cấy gây tổn thương ngâm dung dịch A rhizogenes 15 phút lắc nhẹ, sau chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường MS + 30 g L-1 saccharose) tối ngày Tiếp theo, mẫu cấy chuyển sang môi trường rắn MS0 có bổ sung cefotaxime 500 mg L-1 (MS + saccharose 30g L-1 + cefotaxime 500 mg L-1) Các mẫu ủ 28°C tối tuần Rễ tơ nuôi tăng trưởng môi trường MS với trạng thái khác bao gồm rắn (0,9% thạch), bán lỏng (0,45% thạch) lỏng (khơng có thạch) để khảo sát khả sinh trưởng chúng Môi trường ni cấy có pH = 5,8 giữ 25 ± 2°C, chu kỳ quang 14 h với cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux Rễ tơ sau thu hoạch sấy khô đến khối lượng không đổi cân để xác định khối lượng khô 2.5 Phân tích số liệu Các số liệu xử lý thống kê phần mềm SPSS, sử dụng Test Duncan với P