Nghiên cứu chọn tạo giống lúa mới có năng suất cao, thích ứng với biến đổi khí hậu đang là thử thách đối với các nhà khoa học. Việc cần thiết phải ứng dụng các kỹ thuật hiện đại như chuyển gen, chỉnh sửa gen, đột biến định hướng, chỉ thị phân tử để đẩy nhanh quá trình tạo giống mới. Khả năng tái sinh in vitro ở cây lúa có vai trò quan trọng trong quá trình tạo giống thông qua mô sẹo (phôi soma). Mời các bạn tham khảo!
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA (Oryza sativar L.) PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Lã Văn Hiền1, Nguyễn Văn Thành1, Nguyễn Xuân Vũ1, Bùi Tri Thức1, Nguyễn Thị Tình1, Ngơ Xn Bình1, 2, Nguyễn Tiến Dũng1* TĨM TẮT Nghiên cứu chọn tạo giống lúa có suất cao, thích ứng với biến đổi khí hậu thử thách nhà khoa học Việc cần thiết phải ứng dụng kỹ thuật đại chuyển gen, chỉnh sửa gen, đột biến định hướng, thị phân tử để đẩy nhanh trình tạo giống Khả tái sinh in vitro lúa có vai trị quan trọng q trình tạo giống thơng qua mơ sẹo (phơi soma) Tuy nhiên q trình chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố có giống mơi trường ni cấy Đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng 2,4-D, BAP kinetin đến q trình phát sinh mơ sẹo, khả tái sinh in vitro giống lúa trồng phổ biến khu vực phía Bắc gồm Nếp 87, Khang Dân, Bao thai Đoàn Kết Kết nghiên cứu cho thấy môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D thích hợp cho hình thành mơ sẹo giống lúa nghiên cứu, tỷ lệ mô sẹo dao động từ 78 đến 92% Trong giống Khang Dân Nếp 87 có tỷ lệ tạo mơ sẹo 91 92% sau 28 ngày nuôi cấy Tỷ lệ tái sinh chồi dao động từ 78 đến 83%, hệ số nhân chồi từ 4,3 đến 11,3 chồi/cụm mô sẹo môi trường MS + 1,0 mg/l BAP Kết nghiên cứu cho thấy giống nguồn vật liệu tốt sử dụng nghiên cứu tạo giống kỹ thuật chuyển gen, chỉnh sửa gen Từ khóa: BAP, in vitro, mơ sẹo, kinetin, 2,4-D ĐẶT VẤN ĐỀ Lúa (Oryza sativar L.) lương thực người dân châu Á Khoảng 40% dân số giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực 110 quốc gia sản xuất tiêu thụ gạo Tuy nhiên với gia tăng dân số nhanh giới vài thập niên gần đây, nhiều quốc gia phải đối mặt với tình trạng thiếu lương thực nghiêm trọng Vì vậy, việc chọn tạo giống lúa có suất cao, chất lượng tốt, có khả chống chịu sâu bệnh điều kiện khác nghiệt thời tiết, đáp ứng nhu cầu lương thực, bảo vệ môi trường ổn định sản xuất nhiệm vụ cấp thiết nhà khoa học Một giải pháp nhà khoa học quan tâm tới tạo giống kỹ thuật chuyển gen ứng dụng để tạo vật liệu khởi đầu có giá trị cho nghiên cứu chọn tạo giống nhiều đối tượng trồng khác nhau, có lúa (Sahoo et al., 2011; Yukoh Hiei Toshihiko Komari, 2006, 2008) Trên giới có nghiên cứu, thử nghiệm tạo lúa mang gen cải thiện chất lượng, gia tăng kích Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên Email: nguyentiendung@tuaf.edu.vn Bộ Khoa học Công nghệ * thước hạt trì sinh trưởng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens có kết bước đầu (Daisuke et al., 2013, Zhang, 2013) Ở lúa, hiệu chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố giống mơi trường ni cấy hai yếu tố Nhiều nhóm nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen lúa trọng việc sàng lọc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro thông qua mô sẹo (Sahoo et al., 2011; Daisuke et al., 2013) Ở Việt Nam, Cao Lệ Quyên cộng (2008), Phan Thị Hương cộng (2014) tiến hành nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa Tổng cộng có 63 giống lúa Việt Nam (chủ yếu giống lúa nương) đánh giá nhằm tìm giống lúa có khả tái sinh tốt để làm vật liệu nghiên cứu chuyển gen Tuy nhiên để lựa chọn giống lúa có khả tái sinh tốt, đáp ứng yêu cầu chuyển gen cần tiếp tục nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành nghiên cứu khả tái sinh in vitro giống lúa khu vực miền núi phía Bắc Kết thu góp phần lựa chọn vật liệu tối ưu hóa quy trình tái sinh nhằm phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống lúa Việt Nam thông qua mô sẹo đột biến, chuyển gen hay chỉnh sửa gen Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 11/2020 11 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu hạt chín giống lúa Công ty Giống trồng Thái Bình cung cấp trồng phổ biến tỉnh miền núi phía Bắc Bảng Danh sách giống lúa nghiên cứu TT Tên giống Bao thai Đoàn Kết Khang Dân Nếp 87 Loài Nguồn gốc phụ Indica Cơng ty Giống trồng Thái Bình Indica Cơng ty Giống trồng Thái Bình Indica Cơng ty Giống trồng Thái Bình Indica Cơng ty Giống trồng Thái Bình 2.2 Phương pháp nghiên cứu bổ sung 30 g/l đường, 6,5 g/l agar điều chỉnh pH = 5,7 trước hấp khử trùng Điều kiện nuôi cấy chiếu sáng 16 h/ngày, 25oC±2 3-6 tuần Cơng thức thí nghiệm bố trí sau: Cơng thức (CT) Nồng độ BAP kinetin CT1 mg/l CT2 0,5 mg/l CT3 1,0 mg/l CT4 1,5 mg/l CT5 2,0 mg/l Tỷ lệ tái sinh chồi tính sau: Số mẫu tái sinh chồi Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = Số mô sẹo nuôi cấy Ghi chú: Môi trường MS gồm: MS (Murashige Skoog, 1962) + MS vitamin + 100 mg/l Myoinostol + 30g/l đường Mỗi cơng thức thí nghiệm tiến hành theo dõi 100 mẫu 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 2.2.1 Cảm ứng tạo mơ sẹo Hạt lúa chín, khỏe mạnh có khả nảy mầm tốt bóc vỏ trấu khử trùng sơ cồn 70% phút, tráng - lần nước cất vô trùng Khử trùng NaOCl 2,5% 10 phút, tráng nước cất - lần Ngâm hạt nước cất phút, sau để hạt giấy thấm cho khô nước Cấy 25 hạt vào đĩa petri (phi 10 cm) môi trường cảm ứng tạo mô sẹo gồm MS + 6,5 g/l agar (pH = 5,6) bổ sung 2,4-D nồng độ 1,0; 2,0 3,0 mg/l Sau 28 ngày mơ sẹo hình thành tiến hành chuyển sang môi trường tái sinh chồi Điều kiện ánh sáng 2.000 lux, nhiệt độ phịng 25oC±2 Cơng thức thí nghiệm bố trí sau: Cơng thức (CT) Nồng độ 2,4-D CT1 mg/l CT2 1,0 mg/l CT3 2,0 mg/l CT4 3,0 mg/l Tỷ lệ mơ sẹo tính sau: Số mẫu tạo mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = x 100 (%) Số mẫu nuôi cấy 2.2.2 Tái sinh chồi Mơ sẹo có màu vàng tươi, kích thước đồng chuyển sang mơi trường tái sinh MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng BAP kinetin nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l để đánh giá khả tái sinh chồi giống Môi trường nuôi cấy 12 x 100 (%) Kết thí nghiệm xử lý thống kê phần mềm Excel 2003 IRRISTAT 5.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ảnh hưởng 2,4-D đến khả tạo mô sẹo Kết nghiên cứu cho thấy khả tạo mơ sẹo có khác biệt môi trường 2,4-D Ở nồng độ 1,0 mg/l 2,4-D giống có tỷ lệ mơ sẹo dao động từ 78 đến 88% Tỷ lệ mô sẹo tăng lên đáng kể môi trường 2,0 mg/l 2,4-D, dao động từ 78 đến 92% Tuy nhiên tỷ lệ giảm nồng độ 3,0 mg/l 2,4-D Kết nghiên cứu cho thấy khả tạo mơ sẹo có khác giống Trong giống Đoàn Kết cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nồng độ 1,0 mg/l (88%), giống cịn lại cho tỷ lệ tạo mơ sẹo cao nồng độ 2,0 mg/l, Nếp 87 (92%), Khang Dân (91%), Bao thai (82%) (Bảng 2, hình 1) Khả tái sinh mơ sẹo lúa phụ thuộc chủ yếu vào môi trường nuôi cấy chất di truyền giống Cao Lệ Quyên cộng (2008) nghiên cứu khả tái sinh mô sẹo 59 giống lúa môi trường MS cho thấy có 32 giống có khả hình thành mô sẹo, dao động từ 30 đến 98% môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l 2,4-D 19 giống lúa không tái sinh mô sẹo loại môi trường thử nghiệm Tương tự, Phan Thị Thu Hiền (2012) nghiên cứu khả tạo mô sẹo 31 giống lúa nương thu thập khu vực miền núi phía Bc trờn cỏc mụi Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - THáNG 11/2020 KHOA HC CễNG NGHỆ trường khác cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo dao động từ 28,3 đến 85% Phan Thị Hương cộng (2014) nghiên cứu khả tạo mô sẹo giống lúa, có giống thuộc loài phụ japonica giống indica Kết cho thấy tỷ lệ tái sinh mô sẹo dao động từ 53 đến 86,7% môi trường MS bổ sung 2-3,0 mg/l 2,4-D Từ kết nghiên cứu cho thấy nồng độ 1,0 mg/l 2,4-D phù hợp để tạo mơ sẹo giống lúa Đồn Kết Các giống lại bao gồm Bao thai, Khang Dân, Nếp 87 cho tỷ lệ mô sẹo cao nồng độ 2,0 mg/l 2,4-D Bảng Ảnh hưởng 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo số giống lúa (sau 14 ngày) Giống 2,4-D (mg/l) Bao thai Đoàn Kết Khang Dân Nếp 87 Tỷ lệ (%) Hình thái mơ sẹo - Tỷ lệ (%) Hình thái mơ sẹo - Tỷ lệ (%) Hình thái mơ sẹo - Tỷ lệ (%) Hình thái mô sẹo - 1,0 78a + 88a +++ 86a ++ 80a +++ 2,0 82b ++ 78b ++ 91b ++ 92c +++ 3,0 b ++ c 81 63 + 85 a +++ b 85 ++ Ghi chú: -: Không phát sinh mô sẹo; +++: mô sẹo màu vàng tươi, độ đồng cao; ++: Mơ sẹo màu vàng nhạt, kích thước không đồng đều; +: Mô sẹo màu trắng đục, mềm, kích thước rời rạc; chữ a, b, c, d khác cột thể sai khác có ý nghĩa cơng thức với mức ý nghĩa α