Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm tạo được chitosan khối lượng phân tử thấp, tan trong nước và có khả năng kháng bệnh thán thư hại rau quả (xoài, chuối, ớt) từ chitosan bằng phương pháp cắt mạch bởi hydrogen peroxide. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - LÊ THANH LONG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHITOSAN TAN TRONG NƯỚC TRONG KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI, ỚT SAU THU HOẠCH Chuyên ngành : Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số : 9540105 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HỊA - 2019 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG Trường Đại học Nha Trang PGS.TS VŨ NGỌC BỘI Trường Đại học Nha Trang Phản biện 1: GS.TS NGUYỄN THỊ HIỀN Đại học Bách Khoa Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS NGUYỄN DUY THỊNH Đại học Bách Khoa Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS HOÀNG THỊ LỆ HẰNG Viện Nghiên cứu Rau Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án Trường Đại học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng …… năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Trường Đại học Nha Trang TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan nước kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Nghiên cứu sinh: Lê Thanh Long Người hướng dẫn: Mã số: 9540105 Khoá: 2012 PGS.TS Trang Sĩ Trung PGS.TS Vũ Ngọc Bội Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đạt số kết đóng góp vào lĩnh vực nghiên cứu: 1) Luận án xác định điều kiện cắt mạch chitosan thương mại độ deacetyl 85 - 90% H2O2 thu hồi chitosan hòa tan nước (WSC) đạt hiệu suất cao nhất: nồng độ H2O2 5,4%, nhiệt độ 47,1oC thời gian 3,4 với hiệu suất thu hồi đạt 85,6 ± 2,5% WSC có khối lượng phân tử trung bình 31,5 KDa cấu trúc có cấu trúc mạch phân tử không thay đổi so với chitosan ban đầu 2) Luận án phân lập định danh loài nấm: C gloeosporioides L2 từ xoài, C musae D1 từ chuối C capsici B4 từ ớt gây bệnh thán thư điển hình Trong đó, chủng C gloeosporioides L2 từ xồi C musae D1 từ chuối có mối quan hệ di truyền gần 3) Luận án đánh giá khả kháng nấm C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 gây bệnh thán thư điển hình tương ứng xồi, chuối ớt sau thu hoạch điều kiện in vitro WSC Kết cho thấy WSC ức chế mạnh phát triển chủng C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 môi trường rắn PDA môi trường lỏng PDB WSC gây ức chế biến đổi hình thái rõ rệt mầm bào tử nấm C gloeosporioides L2 C musae D1 C capsici B4 4) Luận án đánh giá khả kháng bệnh thán thư điển hình tương ứng xồi, chuối ớt sau thu hoạch điều kiện in vivo WSC WSC có tác dụng khống chế rõ rệt hình thành phát triển vết bệnh bệnh thán thư sau thu hoạch nấm C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 lây bệnh nhân tạo tương ứng xoài, chuối ớt Đồng thời, việc xử lý WSC cho biểu kích kháng rõ rệt thơng qua thay đổi hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase tích lũy hợp chất phenolic mơ vỏ 5) Luận án đánh giá tác dụng bảo quản xử lý tạo màng WSC với nồng độ 0,5 - 2% xoài, chuối 0,25 - 1% ớt sau thu hoạch Màng WSC thể khả làm chậm biến đổi hoá lý (hao hụt khối lượng, biến đổi độ cứng cường độ màu), sinh hố (chất khơ hồ tan, acid tổng số, cường độ hô hấp sinh etylen) giúp kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch xoài, chuối ớt nhiệt độ 25 - 28oC Kết nghiên cứu sở đề xuất ứng dụng dẫn xuất chitosan tan nước bảo quản xoài, chuối ớt sau thu hoạch sở khoa học cho nghiên cứu hoạt tính kháng nấm chitosan dẫn xuất CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS Trang Sĩ Trung PGS.TS Vũ Ngọc Bội NGHIÊN CỨU SINH Lê Thanh Long DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Lê Thanh Long, Hà Thị Thuý, Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội (2013) Nghiên cứu khả kháng bệnh thán thư xoài chitosan hoà tan nước Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 334-339 Lê Thanh Long, Trang Si Trung, Vu Ngoc Boi (2015) Optimization of chitosan hydrolysis for making water-soluble chitosan and its antifungal ability against postharvest anthracnose from mango Acta Horticulturae 1088, ISHS, 371-376 Lê Thanh Long, Nguyễn Thị Thủy Tiên, Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Hiền Trang, Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội (2015) Ảnh hưởng chitosan tan nước đến nấm thán thư Colletotrichum gloeosporioides L2 điều kiện in vivo biến đổi sinh hố xồi sau thu hoạch Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 4, 207-214 Lê Thanh Long, Nguyễn Văn Toản, Nguyễn Văn Huế, Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội (2016) Nghiên cứu ảnh hưởng chitosan hoà tan nước đến nấm Colletotrichum musae D1 gây bệnh thán thư chuối điều kiện in vitro Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 119, 5, 56-65 Le Thanh Long, Le Van Tan, Vu Ngoc Boi, Trang Si Trung (2018) Antifungal activity of water-soluble chitosan against Colletotrichum capsici in postharvest chili pepper Journal of Food Processing and Preservation, 42 (1) DOI: 10.1111/jfpp.13339 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Luận án Chitosan, sản phẩm deacetyl chitin, polymer tự nhiên không độc hại với nhiều đặc tính sinh học quan trọng như: tương hợp sinh học, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hố, kích thích chế phịng vệ thực vật nên ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống thực phẩm, y dược, nông nghiệp, bảo vệ mơi trường, Tuy vậy, chitosan có trọng lượng phân tử lớn, hịa tan mơi trường acid tan tạo dung dịch có độ nhớt cao nên khó sử dụng thực tế Một số nghiên cứu giới cho thấy từ chitosan thủy phân tạo thành chitosan có trọng lượng phân tử nhỏ với nhiều nhóm NH2 tự hịa tan nước Do đặc điểm trên, chitosan có khối lượng phân tử nhỏ có nhiều đặc tính sinh học cao chitosan khả kháng khuẩn, kháng nấm kích thích sinh trưởng nên sử dụng nhiều lĩnh vực hơn, đặc biệt nông nghiệp để bảo vệ trồng bảo quản rau sau thu hoạch Hiện có số phương pháp cắt mạch chitosan tạo chitosan trọng lượng phân tử nhỏ, hịa tan nước phương pháp hóa học, phương pháp sử dụng enzyme, Trong đó, phương pháp cắt mạch hóa học nhiều nhà khoa học sử dụng có lợi dễ ứng dụng qui mô công nghiệp thời gian thủy phân ngắn Bệnh thán thư bệnh phổ biến gây hại nghiêm trọng số rau sau thu hoạch (xoài, chuối, đu đủ, cà chua, ớt ) nấm bệnh Colletotrichum spp gây nên Chúng gây nên tổn thương mô tế bào vỏ thối gây ảnh hưởng lớn đến giá trị cảm quan, dinh dưỡng sản phẩm rau sau thu hoạch Để khống chế bệnh thán thư phát triển rau sau thu hoạch, người ta thường xử lý rau loại thuốc diệt nấm tổng hợp Imazalil, Benomyl, dẫn tới việc lạm dụng thuốc hoá học gây nên mối nguy sức khỏe người tiêu dùng gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường Để khắc phục tình trạng lạm dụng hóa chất, nhà nghiên cứu quan tâm đến tác nhân sinh học, có nguồn gốc tự nhiên, khơng độc hại, có hoạt tính kháng nấm phịng trừ bệnh thán thư rau quả, Trong đó, chitosan đặc biệt chitosan khối lượng phân tử thấp số nhà nghiên cứu quan tâm Chitosan khối lượng phân tử thấp có khả kháng nấm cao dễ tạo màng bám rau nên giúp hạn chế biến đổi sau thu hoạch kéo dài thời gian bảo quản rau Vì vậy, luận án “Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan nước kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch” theo hướng nghiên cứu tạo chitosan khối lượng phân tử thấp, tan nước có khả kháng bệnh thán thư hại rau (xoài, chuối, ớt) từ chitosan phương pháp cắt mạch hydrogen peroxide có ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn cao Kết nghiên cứu minh chứng bổ sung vào sở lý thuyết sản xuất dẫn xuất tan nước có hoạt tính sinh học cao từ chitosan khả kháng bệnh thán thư số loại rau điển hình (xồi, chuối, ớt), kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch Mục tiêu Luận án Tạo chitosan khối lượng phân tử thấp, tan nước có khả kháng bệnh thán thư hại rau (xoài, chuối, ớt) từ chitosan phương pháp cắt mạch hydrogen peroxide Vật liệu phạm vi nghiên cứu 3.1 Vật liệu Chitosan thương mại có độ deacetyl trung bình (DD = 85 - 90) Nấm bệnh Colletotrichum spp phân lập từ mẫu xồi, chuối, ớt có vết bệnh thán thư điển hình Xồi thuộc giống xồi cát Hồ Lộc cát Chu, chuối giống chuối tiêu AAA (Musa cavendish) tiêu hồng, ớt thuộc giống ớt sừng trâu (Capsicum annuum) 3.2 Phạm vi nghiên cứu (1) Nghiên cứu tối ưu hố q trình thu nhận WSC (water soluble chitosan) từ chitosan phương pháp sử dụng H2O2 để phân cắt (2) Phân lập định danh số chủng Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối ớt sau thu hoạch (3) Đánh giá khả kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch chế phẩm WSC điều kiện in vitro in vivo (4) Đánh giá khả bảo quản xoài, chuối ớt sau thu hoạch xử lý tạo màng WSC Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp phân tích, nghiên cứu đại: Phân tử lượng trung bình (Mw) chitosan xác định thơng qua độ nhớt tính theo công thức Mark–Houwink theo No cộng (2003); Phổ hấp phụ hồng ngoại (FTIR) đo máy Vertex 70, Brucker; Định danh nấm bệnh cấp độ loài phương pháp giải trình tự vùng gen ITS (White et al., 1990; Kosuke et al., 2012) đánh giá mối quan hệ di truyền chủng bệnh thán thư thơng qua quan hệ phát sinh lồi (phylogenetic tree) theo phương pháp Neighbour-Joining (Saitou Nei, 1987); Đánh giá khả kháng nấm điều kiện in vitro thông qua phát triển môi trường nhân tạo (Cronin et al., 1996; Al-Hetar et al., 2011); Đánh giá khả kháng nấm điều kiện in vivo thông qua thay đổi hoạt độ enzyme kháng ngoại bào vỏ lây bệnh nhân tạo (Abeles & Forrence, 1970; Dai et al., 2011); Xác định biến đổi tiêu lý hoá sinh hoá phương pháp thiết bị đại (thiết bị đo độ cứng Shimpo, đo cường độ màu NF 333- Nippon Densoku, đo nồng độ khí CO2 kiểu ICA 250/ICA đo hàm lượng etylen ICA56) Các kết thí nghiệm xử lý thống kê, kiểm định so sánh giá trị trung bình phần mềm SAS; thiết kế thí nghiệm, phân tích liệu, xây dựng mơ hình bậc hai tối ưu hóa phần mềm Design Expert; quan hệ phát sinh loài phần mềm MEGA Ý nghĩa khoa học thực tiễn Luận án - Ý nghĩa khoa học: Lần Việt Nam, luận án tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa việc thu nhận WSC từ chitosan thương mại phương pháp cắt mạch sử dụng hydrogen peroxide sử dụng WSC để kháng bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) nhằm kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch xoài, chuối ớt Kết nghiên cứu luận án minh chứng bổ sung lý thuyết kỹ thuật sản xuất chitosan tan nước, có hoạt tính sinh học kháng bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch - Ý nghĩa thực tiễn: Kết nghiên cứu luận án tiền đề để doanh nghiệp sử dụng WSC phòng chống bệnh thán thư nhằm kéo dài thời gian bảo quản rau sau thu hoạch - sở để tạo nơng nghiệp “sạch” bền vững hướng tới đẩy mạnh xuất rau Kết cấu Luận án Luận án gồm 146 trang, bao gồm trang mở đầu, 31 trang tổng quan, 17 trang phương pháp nghiên cứu, 90 trang kết nghiên cứu, trang kết luận, 26 bảng, 90 hình, 220 tài liệu tham khảo (39 tài liệu tiếng Việt, 181 tài liệu tiếng Anh) 79 trang phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ WSC (WATER SOLUBLE CHITOSAN) 1.1.1 Khái quát chitosan WSC Chitosan dẫn xuất deacetyl hoá chitin, loại polymer sinh học phổ biến tự nhiên sau cellulose Chitosan dễ tan dung dịch HCl, acid lactic, acid acetic loãng số acid hữu khác, không tan cồn, môi trường trung tính kiềm Độ hịa tan chitosan thơng số khó kiểm sốt, phụ thuộc nhiều vào mức độ deacetyl hóa, khối lượng phân tử, nồng độ ion, pH, phân bố nhóm acetyl mạch polymer chitosan, phương pháp, điều kiện tách chiết, thu hồi sấy chitosan Khác với chitosan, sản phẩm thủy phân chitosan hịa tan nước mạch phân tử ngắn có mặt nhóm NH2 tự có mắt xích D-glucosamine Tùy thuộc mức độ polymer hóa (DP) q trình thủy phân chitosan chia sản phẩm thủy phân chitosan thành loại: chitosan có khối lượng phân tử thấp (low molecular weight chitosan-LMWC) chitosan oligosaccharides (oligochitosan) Oligochitosan có khả hịa tan nước tốt LMWC có độ DP thấp (thường DP từ - 10, khối lượng phân tử 10 kDa), nhiên việc phân biệt LMWC oligochitosan thông qua DP không rõ ràng 1.1.2 Các phương pháp thuỷ phân cắt mạch chitosan Chitosan bị thuỷ phân cắt mạch tác nhân vật lý, hoá học enzyme Để điều chế LMWC oligochitosan, phương pháp hóa học enzyme nghiên cứu, ứng dụng phổ biến Trong đó, phương pháp thủy phân hóa học sử dụng chủ yếu qui mô công nghiệp Phương pháp thủy phân cắt mạch chitosan enzyme có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học vật lý nhờ giảm thiểu khả biến đổi hóa học khơng có lợi tăng hoạt tính sinh học sản phẩm thủy phân Tuy vậy, tính đặc hiệu chi phí chiết rút enzyme có khả thuỷ phân chitosan đắt nên khó ứng dụng vào thực tế sản xuất qui mô lớn Với phương pháp hóa học, sử dụng acid vơ (HCl, HNO3, H3PO4), acid hữu (acid acetic) để sản xuất LMWC oligochitosan từ chitosan Mặc dù áp dụng phổ biến qui mô công nghiệp để sản xuất LMWC oligochitosan phương pháp có số nhược điểm như: tạo số chất độc ảnh hưởng không tốt đến môi trường, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp nhiều ảnh hưởng đến cấu trúc sản phẩm thủy phân Hydrogen peroxide (H2O2), tác nhân oxy hóa mạnh có khả phân cắt liên kết β-1,4 glycoside mạch cấu trúc chitosan với chế nghiên cứu lý giải H2O2 khơng bền mơi trường trung tính kiềm, dễ bị phân hủy theo phản ứng toả nhiệt tạo thành nước oxy phân tử nên phương pháp ảnh hưởng đến mơi trường, sử dụng trực tiếp sản phẩm thủy phân cách an toàn Tuy nhiên, điều kiện nhiệt độ phản ứng nồng độ H2O2 cao, thời gian kéo dài việc phân cắt chitosan H2O2 gia tăng tỷ lệ monosaccharides chitosan làm giảm hoạt tính sản phẩm Ngoài việc thay đổi cấu trúc chitosan hình thành gốc cacboxyl loại bỏ gốc amin cần xem xét lựa chọn điều kiện phản ứng cắt mạch H2O2 1.1.3 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm kích kháng chitosan Với cấu trúc amino-polysaccharides dạng hoà tan trong dung môi khác chitosan thể polycation với nhiều hoạt tính sinh học hố lý đặc biệt Chitosan dẫn xuất có chức kép độc đáo: kháng vi sinh vật (kháng khuẩn, kháng nấm virút) kích thích chế bảo vệ tế bào thực vật Ngoài chúng cịn xem loại thuốc diệt nấm có hiệu việc ức chế nảy mầm bào tử, ngăn kéo dài ống mầm, làm chậm tăng trưởng sợi nấm hạn chế sản sinh độc tố nấm bệnh Đã có số chế đề xuất giải thích cho hoạt tính kháng vi sinh vật chitosan dẫn xuất Cơ chế chấp nhận phổ biến dựa tương tác nhóm tích điện dương phân tử chitosan nhóm tích điện âm màng ngồi vách tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi cấu trúc tính thấm màng sinh chất, gây rị rỉ thành phần có chất protein thành phần khác nội bào, làm thay đổi chức sinh hóa sinh lý vi sinh vật dẫn đến khả tái tạo gây chết vi sinh vật Bên cạnh đó, với vai trị chất keo hấp phụ có chọn lọc lấy ion kim loại quan trọng tế bào vi sinh vật, gây ức chế phát triển hạn chế sản sinh độc tố vi sinh vật Chitosan với khối lượng phân tử thấp xâm nhập vào tế bào chất vi sinh vật thông qua liên kết chúng với DNA (polyanion), gây ức chế trình phiên mã tổng hợp mRNA protein tế bào Ngoài chế trên, chitosan với chức chất kích kháng (elicitor) ngoại bào liên quan đến phản ứng phòng vệ tế bào vật chủ chống lại công tác nhân gây bệnh rau Chitosan kích hoạt tế bào mơ chủ bị nhiễm bệnh tích luỹ protein liên quan đến kháng bệnh (pathogenesis-related proteins_PRs) chitinases β-1,3-glucanase có khả khoảng nồng độ khảo sát (0,05 - 0,8%): y = 29,30.ln(x) + 115,94 (R² = 0,9212); IC50 MIC90 tương ứng 0,11 0,43% - Trên đối tượng C capsici B4: Hiệu lực ức chế đạt 100% nồng độ 0,32% Tương quan nồng độ WSC (x) IC (y) khoảng nồng độ khảo sát (0,02 - 0,32%) xác định: y = 13,19.ln(x) + 118,63 (R2 = 0,9228) ; IC50 MIC90 tương ứng 0,007% 0,45% ĐC (0%) 0,1% 0,05% 0,2% 0,4% Hình 19 Nấm C gloeosporioides L2 sau 10 ngày môi trường PDB bổ sung WSC 25 - 28oC ĐC (0%) 0,05% 0,2% 0,1% 0,4% 0,8% Hình 20 Nấm C musae D1 sau 10 ngày môi trường PDB bổ sung WSC 25 - 28oC ĐC (0%) 0,02% 0,04% 0,08% 0,16% 0,32% Hình 21 Nấm C capsici B4 sau 10 ngày môi trường PDB bổ sung WSC 25 - 28oC c Sự nảy mầm bào tử nấm WSC gây ức chế rõ rệt nảy mầm bào tử nấm C gloeosporioides L2 C musae D1 C capsici B4 môi trường PDB: sau giá trị PISG50 MIC90 tương ứng C gloeosporioides L2 0,13% 0,51%; sau 12 giờ, giá trị PISG50 MIC90 tương ứng C musae D1 C capsici B4 0,24% 0,54%, 0,08% 0,27% A B 0% (ĐC) 0,05% 0,1% 0% (ĐC) 0,05% 0,1% % % % % % % 0,2% 0,4% 0,8% 0,2% 0,4% 0,8% Hình 22 Ảnh hưởng WSC đến nảy mầm bào tử nấm C gloeosporioides L2 sau (A) % (B) nuôi % 25 - 28oC % % % % 17 Khi quan sát kính hiển vi độ phóng đại 100X, WSC tác động trực tiếp lên màng tế bào, gây biến đổi hình thái bào tử nấm C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 (gây biến dạng, ống mầm bào tử co ngắn, màng bào tử có xu hướng mỏng dần, thay đổi màu sắc trạng thái dịch bào) trình nảy mầm (Hình 22 - 24) A B 0% (ĐC) 0,1% 0,2% 0% (ĐC) 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% 1,6% 0,4% 0,8% 1,6% Hình 23 Ảnh hưởng WSC đến nảy mầm bào tử nấm C musae D1 sau (A) 12 (B) nuôi 25 - 28oC B A 0% (ĐC) 0,05% 0,1% 0% (ĐC) 0,05% 0,1% 0,2% 0,4% 0,8% 0,2% 0,4% 0,8% Hình 24 Ảnh hưởng WSC đến nảy mầm bào tử nấm C musae D1 sau (A) 12 (B) ni 25 - 28oC Tóm lại, điều kiện in vitro WSC không ức chế đáng kể đến phát triển C gloeosporioides L2, C musae D1 (trong khoảng nồng độ 0,05 - 0,8%) C capsici B4 (trong khoảng nồng độ 0,1 - 1,6%) gây bệnh thán thư tương ứng xồi, chuối ớt thơng qua phát triển ĐKTN sinh khối nấm tương ứng mơi trường PDA PDB mà cịn làm chậm trình nảy mầm bào tử, gây biến đổi hình thái nấm trình bào tử nảy mầm 3.3.2 Kết kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt WSC điều kiện in vivo a Ngưỡng gây bệnh nhân tạo C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 tương ứng xoài, chuối, ớt Quá trình xâm nhập trực tiếp từ vết tổn thương bào tử C gloeosporioides L2 xoài tương đồng với nấm C capsici B4 ớt Trong chuối, biến đổi sinh hóa đáng kể mô nhiễm bệnh so với vùng không bị lây nhiễm nồng độ bào tử nấm bệnh đủ cao diễn chậm Nồng độ 105 bào tử/mL xác định ngưỡng gây bệnh thán thư C gloeosporioides L2 C capsici B4 tương ứng xoài ớt; 106 18 bào tử/mL chuối, phù hợp với điều kiện thực nghiệm để sử dụng cho nghiên cứu (Hình 25 - 27) bào tử/mL (ĐC) 103 bào tử/mL 104 bào tử/mL 105 bào tử/mL 106 bào tử/mL Hình 25 Vết bệnh nấm C gloeosporioides L2 xoài lây nhân tạo sau ngày 25 - 28oC bào tử/mL (ĐC) 103 bào tử/mL 104 bào tử/mL 105 bào tử/mL 106 bào tử/mL Hình 26 Vết bệnh nấm C musae D1 chuối lây nhân tạo sau ngày 25 - 28oC bào tử/mL (ĐC) 103 bào tử/mL 104 bào tử/mL 105 bào tử/mL 106 bào tử/mL Hình 27 Vết bệnh nấm C capsici B4 ớt lây nhân tạo sau ngày 25 - 28oC b Ảnh hưởng WSC đến phát triển bệnh thán thư xoài, chuối ớt lây bệnh nhân tạo C goeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 lây nhiễm tương ứng lên xoài, chuối, ớt (nồng độ 105 bào tử/mL xoài, ớt; 106 bào tử/mL chuối) bảo quản 25 - 28oC Kết đánh giá điều kiện in vivo chứng tỏ khoảng nồng độ từ 0,5 2% (trên đối tượng xoài, chuối) 0,2 - 1% (trên ớt), WSC có tác dụng ức chế rõ rệt đến hình thành tốc độ phát triển vết bệnh WSC với nồng độ cao hiệu việc làm chậm tốc độ phát triển C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 lây bệnh nhân tạo tương ứng xoài, chuối ớt lớn Tỷ lệ bệnh 19 giảm thời gian hình thành vết bệnh dài hơn, diện tích vết tổn thương nấm C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 gây bề mặt xoài, chuối ớt giảm dần tăng nồng độ WSC xử lý (Hình 28 - 30) 0,5% ĐC (0%) 2% 1,5% 1% Hình 28 Ảnh hưởng WSC đến hình thành vết bệnh thán thư xồi lây bệnh nhân tạo nấm C gloeosporioides L2 sau ngày 25 - 28oC ĐC (0%) 0,5% 2% 1,5% 1% Hình 29 Ảnh hưởng WSC đến hình thành vết bệnh thán thư chuối lây bệnh nhân tạo nấm C musae D1 sau ngày 25 - 28oC Trên xoài, hiệu lực ức chế thấp nồng độ WSC 0,5% cao nồng độ 2%, tương ứng với giá trị PIRG 21,04% 100% Tương quan nồng độ WSC (x) PIRG (y) khoảng nồng độ khảo sát (0,5 - 2%): y = 55,65.x - 3,80 (R2 = 0,9483) Nồng độ WSC ức chế tối đa 50% phát triển đường kính vết bệnh thán thư nấm C gloeosporioides L2 điều kiện in vivo (IC50) giá trị ức chế tối thiểu 90% (MIC90) tương ứng 0,97% 1,69% ĐC (0%) 0,2% 0,4% 0,6% 0,8% 1% Hình 30 Ảnh hưởng WSC đến hình thành vết bệnh thán thư ớt lây bệnh nhân tạo nấm C capsici B4 sau ngày 25 - 28oC 20 Polyphenol (mg GAE/g FW) β-1,3-glucanase (IU/mg protein) Chitinese (IU/mg protein) Trên chuối, hiệu lực ức chế phát triển đường kính vết bệnh nấm C musae D1 thấp so với C gloeosporioides L2 xoài, đạt tối đa 79,06% tương ứng nồng độ xử lý WSC 2% Tương quan nồng độ WSC (x) PIRG (y) khoảng nồng độ khảo sát (0,5 - 2%): y = 33,04.x + 56,94 (R2 = 0,9671), giá trị IC50 tương ứng 0,82% Hiệu ức chế phát triển nấm C musae D1 điều kiện in vivo phương pháp lây bệnh nhân tạo thấp nhiều so với điều kiện in vitro Trên ớt, so với C gloeosporioides L2 xoài C musae D1 chuối, hiệu lực ức chế phát triển đường kính vết bệnh nấm C capsici B4 cao khoảng nồng độ WSC khảo sát (0,2 - 1%), đạt 73,12% tương ứng nồng độ xử lý WSC 1% Tương quan nồng độ WSC (x) PIRG (y): y = 58,13.x + 10,33 (R2 = 0,9571) Giá trị IC50 tương ứng 0,68%, thấp so sánh hiệu lực ức chế bệnh thán thư nấm C gloeosporioides L2 xoài C musae D1 chuối c Khả kích kháng WSC đến bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt điều kiện in vivo Bố trí thí nghiệm hồn tồn ngẫu nhiên với công thức: Không lây bệnh, không xử lý WSC (ĐC); Có lây bệnh, khơng xử lý WSC; Có lây bệnh, có xử lý WSC nồng độ 1% đối tượng xoài, chuối 0,5% ớt Việc xử lý WSC tương ứng với nồng độ 1% (trên xoài, chuối) 0,5% (trên ớt) sau lây bệnh thán thư đặc trưng cho biểu kích kháng rõ rệt thơng qua thay đổi hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase tích lũy hợp chất phenolic mơ vỏ Hoạt tính chitinase β-1,3-glucanase mơ có xử lý WSC lây bệnh cao so với mẫu có lây bệnh mẫu ĐC (khơng lây bệnh khơng xử lý WSC) (Hình 31 - 33) Polyphenol (mg GAE/g FW) β-1,3-glucanase (IU/mg protein) Chitinese (IU/mg protein) Hình 31 Ảnh hưởng WSC đến hoạt độ chitinase, β-1,3-glucanase hàm lượng polyphenol tổng số vỏ xồi bảo quản 25 - 28oC Hình 32 Ảnh hưởng WSC đến hoạt độ chitinase, β-1,3-glucanase hàm lượng polyphenol tổng số vỏ chuối bảo quản 25 - 28oC 21 C hiti nes e (IU /mg pro tein ) β 1,3 glu ca na se (I U/ mg pr ote in) P oly phe nol (m g GA E/g FW ) Hình 33 Ảnh hưởng WSC đến hoạt độ chitinase, β-1,3-glucanase hàm lượng polyphenol tổng số vỏ chuối bảo quản 25 - 28oC Tóm lại, điều kiện in vivo khoảng nồng độ 0,5 - 2% xoài, chuối 0,2 - 1% ớt, WSC có tác dụng kháng bệnh thán thư sau thu hoạch rõ rệt không làm chậm phát triển vết bệnh lây nhiễm nhân tạo giải thích tương tác trực tiếp lên nấm bệnh WSC mà cịn kích hoạt hệ thống tự bảo vệ, tăng cường sức đề kháng thông qua biến đổi hoạt tính chitinase β-1,3-glucanase, gia tăng hàm lượng phenolic mô vỏ xử lý WSC nồng độ 1% đối tượng xoài, chuối 0,5% ớt 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA WSC ĐẾN MỘT SỐ BIẾN ĐỔI SINH LÝ, HỐ SINH CỦA XỒI, CHUỐI, ỚT TRONG Q TRÌNH BẢO QUẢN 3.4.1 Biến đổi hố lý xồi, chuối, ớt trình bảo quản Xử lý WSC ảnh hưởng không đáng kể đến hao hụt khối lượng sau - ngày bảo quản 25 - 28oC có khác biệt rõ rệt mẫu có xử lý WSC so với ĐC sau thời điểm ngày xoài ngày chuối ớt Ảnh hưởng việc xử lý WSC đến biến đổi độ cứng có số khác biệt với biến đổi hao hụt khối lượng Độ cứng sau 9, 10 12 ngày bảo quản giảm rõ rệt tương ứng xoài, chuối ớt so với ĐC (Hình 34 - 36) Hình 34 Ảnh hưởng WSC đến hao hụt khối lượng & độ cứng xoài bảo quản 25 - 28oC Kết nghiên cứu cho thấy xử lý WSC làm chậm q trình chín thơng qua thay đổi cường độ màu vỏ Giá trị độ sáng L giảm mạnh, số a*, b* H thay đổi không nhiều sau ngày bảo quản xoài Khác với xoài, 22 chuối giá trị L, a* thay đổi giá trị b* H thay đổi đáng kể tương ứng với tượng chuyển màu vỏ sau 10 ngày bảo quản Trên ớt, xử lý WSC khoảng nồng độ 0,5 - 1% WSC làm giảm độ sáng L vỏ Sau 12 ngày, xử lý WSC khoảng nồng độ 0,5 - 1% làm giảm độ sáng vỏ so với ĐC (Hình 37 42) Hình 35 Ảnh hưởng WSC đến hao hụt khối lượng & độ cứng chuối bảo quản 25 - 28oC Hình 36 Ảnh hưởng WSC đến hao hụt khối lượng & độ cứng ớt bảo quản 25 - 28oC Hình 37 Ảnh hưởng WSC đến biến đổi cường độ màu vỏ xoài sau ngày bảo quản 25 - 28oC 23 ĐC (0%) 0,5% 1,5% 1% 2% Hình 38 Quả xồi xử lý WSC với nồng độ khác sau ngày bảo quản 25 - 28oC Hình 39 Ảnh hưởng WSC đến biến đổi cường độ màu vỏ chuối sau 10 ngày bảo quản 25 - 28oC ĐC(0%) 0,5% 1% 1,5% 2% Hình 40 Quả chuối xử lý WSC với nồng độ khác sau 10 ngày bảo quản 25 - 28oC Hình 41 Ảnh hưởng WSC đến thay đổi độ sáng ớt bảo quản 25 - 28oC 24 ĐC (0%) 0,25% 0,5% 0,75% 1% Hình 42 Quả ớt xử lý WSC với nồng độ khác sau 12 ngày bảo quản 25 - 28oC 3.4.2 Biến đổi sinh hố xồi, chuối, ớt q trình bảo quản Chất khơ hồ tan có mơ thịt xoài tăng theo thời gian bảo quản gia tăng khác biệt hàm lượng chất khô mẫu có xử lý WSC so với ĐC chậm Trong đó, acid tổng số có xu hướng giảm nhanh khác biệt so với ĐC quan sát thấy mẫu xử lý WSC 0,5% sau ngày bảo quản 25 - 28oC (Hình 43) Hình 43 Ảnh hưởng WSC đến hàm lượng chất khô & acid tổng số xoài bảo quản 25 - 28oC Hình 44 Ảnh hưởng WSC đến hàm lượng chất khô & acid tổng số chuối bảo quản 25 - 28oC Trên chuối, hàm lượng chất khô tăng nhanh mẫu ĐC sai khác đáng kể so với mẫu có xử lý WSC thời điểm sau ngày bảo quản Trong acid tổng số có xu hướng 25 tăng lên đạt giá trị cao thời điểm ngày ngày sau giảm dần Xử lý WSC làm chậm tốc độ giảm acid tổng số so với ĐC (Hình 44) Hình 45 Ảnh hưởng WSC đến hàm lượng chất khô & acid tổng số ớt bảo quản 25 - 28oC Trên ớt, ảnh hưởng việc xử lý WSC đến biến đổi hàm lượng chất khô acid tổng số mô khác biệt so với xồi chuối Ở mẫu ĐC, chất khơ hồ tan acid tổng số tăng lên đạt giá trị cao sau ngày sau giảm dần Trong mẫu có xử lý WSC xu hướng biến đổi chậm với khác biệt chất khô hồ tan nồng độ WSC khơng đáng kể và xử lý WSC 0,25 - 0,5% không ảnh hưởng đến biến đổi acid tổng số so với ĐC (Hình 45) Cường độ hơ hấp sinh etylen rau tươi coi số quan trọng để xác định thời hạn bảo quản Xoài loại hô hấp đột biến Trong thời gian theo dõi (9 ngày), xử lý xoài với nồng độ WSC cao (1,5% 2%) với cường độ hô hấp đạt đỉnh chậm so với ĐC mẫu xử lý nồng độ thấp (0,5% 1%) Trong đó, mẫu xử lý WSC 1%, 1,5% 2%, sau ngày cường độ sinh etylen đạt giá trị cao (Hình 46) Hình 46 Ảnh hưởng WSC đến cường độ hơ hấp & sinh etylen xồi bảo quản 25 - 28oC Trên đối tượng chuối, xu hướng biến đổi hô hấp đột biến diễn tương tự xoài 26 Mẫu xử lý WSC với nồng độ 0,5% 1% đạt đỉnh hô hấp sau ngày, phải đến ngày mẫu xử lý WSC 1,5% 2% đạt đỉnh hô hấp Tuy nhiên, giá trị cường độ sinh etylen cao đạt mẫu thí nghiệm thấp đáng kể so với xồi (Hình 47) Hình 47 Ảnh hưởng WSC đến cường độ hô hấp & sinh etylen chuối bảo quản 25 - 28oC Hình 48 Ảnh hưởng WSC đến cường độ hô hấp & sinh etylen ớt bảo quản 25 - 28oC Khác với xồi chuối, cường độ hơ hấp sinh etylen tất mẫu ớt thí nghiệm thấp giảm dần suốt trình bảo quản Ở mẫu ĐC xử lý WSC 0,25%, cường độ hô hấp biến đổi không đáng kể sau ngày, giảm nhanh thời điểm 6, 12 ngày bảo quản Trong đó, cường độ hơ hấp có xu hướng giảm chậm mẫu có xử lý WSC nồng độ 0,5%, 0,75% 1% Ảnh hưởng việc xử lý WSC đến khác biệt cường độ sinh etylen so với ĐC quan sát thấy mẫu xử lý WSC 0,75% 1% thời điểm sau ngày trình bảo quản 25 - 28oC (Hình 48) Tóm lại, xử lý tạo màng WSC với nồng độ 0,5 - 2% xoài, chuối 0,25 - 1% ớt khả ức chế đáng kể xâm nhập phát triển bệnh thán thư sau thu 27 hoạch, màng WSC thể khả làm chậm biến đổi hoá lý (HHKL, biến đổi độ cứng CĐM), sinh hố (hàm lượng chất khơ hồ tan, acid tổng số, biến đổi cường độ hô hấp sinh etylen) so với ĐC bảo quản 25 - 28oC Kết cho thấy, nồng độ WSC xử lý cao (1,5 - 2% xoài, chuối 0,75 - 1% ớt) cho hiệu kháng bệnh làm chậm biến sinh hoá tốt xử lý nồng độ thấp (0,5 - 1% xoài, chuối 0,25 - 0,5% ớt) 3.5 ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH ỨNG DỤNG WSC TRONG KHÁNG BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI, ỚT SAU THU HOẠCH Qui trình đề xuất ứng dụng WSC kháng bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch trình bày hình 49 Chitosan thương mại (DD = 85 - 90) Quả xoài, chuối, ớt bệnh Tinh Xử lý Cắt mạch H2O2 WSC Tạo màng Bảo quản Hình 49 Qui trình ứng dụng WSC kháng bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch * Thuyết minh qui trình - Chitosan thương mại: chitosan thương mại có DD = 85 - 90 công ty Công ty TNHH Hùng Tiến, Tp Cần Thơ cung cấp - Tinh sạch: tiến hành tinh theo trình tự sau: hồ tan acid acetic 2% 24 Sau đó, lọc bỏ tạp chất, cặn không tan điều chỉnh pH hỗn hợp đến dung dịch NaOH 4% thu kết tủa chitosan Tiến hành lọc, rửa kết tủa nhiều lần nước cất sấy khơ 50oC Sau đó, nghiền nhỏ chitosan dùng làm nguyên liệu cho trình cắt mạch - Cắt mạch: tiến hành cắt mạch theo trình tự sau: hồ tan chitosan tinh acid acetic 1% 24 Dung dịch nâng đến nhiệt độ 47,1oC bể ổn nhiệt, 28 bổ sung từ từ H2O2 30% để đạt nồng độ H2O2 dung dịch 5,4%, lắc máy lắc tốc độ 120 vòng/phút 3,4 - WSC: điều chỉnh pH đến dung dịch NaOH 10% lọc bỏ phần kết tủa Bổ sung ethanol 99,5% với lượng gấp đơi thể tích dịch lọc giữ nhiệt độ - 5oC 12 Tách kết tủa, lọc sấy 40 - 50oC thiết bị sấy chân khơng thu sản phẩm WSC - Xồi, chuối, ớt: xoài thuộc giống giống xoài cát Hoà Lộc cát Chu (Mangifera indica), chuối thuộc giống chuối tiêu AAA (Musa cavendish) ớt thuộc giống ớt sừng trâu (Capsicum annuum) Nguyên liệu đạt độ chín thu hoạch lành bệnh - Xử lý: xử lý làm nước làm khô tự nhiên nhiệt độ phòng - Tạo màng: Tiến hành tạo màng làm khô cách nhúng vào dung dịch WSC với nồng độ 1,5 - 2% xoài, chuối 0,75 - 1% ớt 30 giây làm khô tự nhiên - Bảo quản: xoài, chuối, ớt xử lý WSC bảo quản nhiệt độ 25oC, không thấp 10oC với chuối, 12oC với xoài 7oC với ớt nhằm tránh tổn thương lạnh 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu luận án cho phép rút số kết luận sau: 1) Điều kiện tối ưu cho trình cắt mạch tạo WSC từ chitosan thương mại độ deacetyl 85 - 90% H2O2: nồng độ H2O2 5,4%, nhiệt độ 47,1oC thời gian phản ứng 3,4 với hiệu suất thu hồi WSC đạt 85,6 ± 2,5% WSC tạo thành có khối lượng phân tử trung bình 31,5 KDa cấu trúc mạch phân tử không thay đổi so với chitosan thương mại ban đầu 2) Đã phân lập định danh loài nấm thuộc chi Colletotrichum gây bệnh thán thư điển hình: C gloeosporioides L2 từ xồi, C musae D1 từ chuối C capsici B4 từ ớt Trong đó, chủng C gloeosporioides L2 từ xoài C musae D1 từ chuối có mối quan hệ di truyền gần 3) Trong điều kiện in vitro, WSC ức chế mạnh phát triển loài nấm Cụ thể: - Trên PDA, EC50 MIC90 tương ứng 0,09% 0,40%, PIRG đạt 100% nồng độ WSC 0,8% (với C gloeosporioides L2); EC50 MIC90 tương ứng 0,28% 0,88%, PIRG đạt 100% nồng độ WSC 1,6% (với C musae D1); EC50 MIC90 tương ứng 0,16% 0,45%, PIRG đạt 100% nồng độ WSC 0,8% (với C capsici B4) - Trên PDB, IC50 MIC90 tương ứng 0,04% 0,21%, đạt 100% nồng độ WSC 0,4% (với C gloeosporioides L2); IC50 MIC90 tương ứng 0,11% 0,43%, đạt 100% nồng độ 0,8% (với C musae D1); IC50 MIC90 tương ứng 0,007% 0,12%, đạt 100% nồng độ 0,32% (với C capsici B4) - WSC ức chế rõ rệt nảy mầm bào tử nấm: sau giờ, PISG50 MIC90 tương ứng 0,13% 0,51% (đối với C gloeosporioides L2); sau 12 giờ, PISG50 MIC90 tương ứng 0,24% 0,54%, 0,08% 0,27% (đối với C musae D1 C capsici B4) Đồng thời, WSC gây biến đổi hình thái bào tử trình nảy mầm 4) Trong điều kiện in vivo, WSC thể rõ tác dụng kháng bệnh thán thư loài nấm gây Cụ thể: - WSC với nồng độ 0,5 - 2% ức chế rõ rệt hình thành phát triển vết bệnh thán thư nấm C gloeosporioides L2, C musae D1 C capsici B4 gây nhiễm tương ứng xoài, chuối ớt - WSC làm chậm tốc độ phát triển vết bệnh C gloeosporioides L2, C musae 30 D1 C capsici B4 gây nhiễm tương ứng xoài, chuối ớt với giá trị IC50 MIC90 tương ứng 0,97% 1,69% (trên xoài); IC50 0,82% (trên chuối) IC50 0,68% (trên ớt) - Xử lý tạo màng WSC với nồng độ 1% xoài chuối nồng độ 0,5% ớt cho biểu kích kháng bệnh thán thư rõ rệt thông qua thay đổi hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase tích lũy hợp chất phenolic mô vỏ 5) Xử lý tạo màng WSC với nồng độ 0,5 - 2% xoài chuối nồng độ 0,25 1% ớt ức chế đáng kể xâm nhập, phát triển bệnh thán thư làm chậm biến đổi hoá lý, sinh hoá giúp kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch xoài, chuối, ớt nhiệt độ 25 - 28oC Nồng độ WSC xử lý cao (1,5 - 2% xoài, chuối 0,75 - 1% ớt) cho hiệu kháng bệnh làm chậm biến sinh hoá tốt xử lý nồng độ thấp (0,5 - 1% xoài, chuối 0,25 - 0,5% ớt) KIẾN NGHỊ Từ nghiên cứu trên, luận án đề xuất cần tiếp tục thực hiện: - Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng nấm WSC cắt mạch H2O2 từ loại chitosan có khối lượng phân tử DD khác khơng đối tượng rau nhiễm bệnh thán thư mà rau bội nhiễm bệnh làm sở cho việc lựa chọn chế phẩm chitosan phù hợp với đối tượng rau sau thu hoạch - Mở rộng đánh giá hiệu kháng bệnh đối tượng rau đa nhiễm giai đoạn cận thu hoạch nhằm nâng cao hiệu ứng dụng chế phẩm WSC 31 ... học Nha Trang TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan nước kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch Ngành/Chuyên... cứu ứng dụng chitosan tan nước kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch? ?? theo hướng nghiên cứu tạo chitosan khối lượng phân tử thấp, tan nước có khả kháng bệnh. .. định danh số chủng Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối ớt sau thu hoạch (3) Đánh giá khả kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư xoài, chuối, ớt sau thu hoạch chế phẩm WSC