Bài viết tiến hành nghiên cứu môi trường tái sinh chồi từ mẫu, môi trường giai đoạn nhân nhanh, môi trường quá trình ra rễ, loại giá thể thích hợp cho cây con nuôi cấy mô để nhân giống in vitro khoai sọ cụ cang.
Vì Thị Xuân Thủy nnk (2020) (20): - 15 TẠP CHÍ KHOA HỌC – ĐẠI HỌC TÂY BẮC Khoa học Tự nhiên Công nghệ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO KHOAI SỌ CỤ CANG (Colocasia esculenta L Schott), HUYỆN THUẬN CHÂU, TỈNH SƠN LA Vì Thị Xuân Thủy*, Phayvong Duangngeun, Phạm Hoàng Đan, Nguyễn Thị Thúy An, Đinh Thị Phương, Vũ Thị Nự Trường Đại học Tây Bắc Tóm tắt: Khoai mơn sọ (Colocasia esculenta L Schott) trồng quan trọng sản xuất lương thực Việt Nam Giống khoai sọ Cụ Cang huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La, nguồn gen địa quý, có chất lượng cao Việt Nam Tuy nhiên, để mở rộng diện tích trồng khoai sọ Cụ Cang gặp nhiều khó khăn thiếu giống Chính nhân giống in vitro nghiên cứu nhằm chủ động nguồn giống chất lượng, bệnh Kết cho thấy, chồi mầm khử trùng kép HgCl2 0,2% phút lần phút lần cho kết khử trùng tái sinh chồi tốt nhất, đạt tỷ lệ mẫu sống, 75,86% Môi trường MS bổ sung 3,0 mg/l BAP thích hợp cho q trình tái sinh chồi từ mẫu chồi nuôi cấy đạt 2,71 chồi/mẫu sinh trưởng tốt Mơi trường MS có 3,0 mg/l BAP 0,5 mg/l α-NAA phù hợp cho trình nhân nhanh chồi đạt 9,83 chồi/mẫu mơi trường MS có 0,5 mg/l α-NAA thích hợp cho việc rễ với 8,23 rễ/chồi dài 7,45 cm Giá thể Tribat cho tỷ lệ sống sinh trưởng in vitro vườn ươm cao với tỷ lệ sống 91,84% sinh trưởng tốt Từ khóa: Cụ Cang, khoai mơn sọ, in vitro, Sơn La, Thuận Châu Đặt vấn đề Khoai môn sọ (Colocasia esculenta L Schott) có lịch sử trồng trọt lâu đời thích nghi với nhiều vùng sinh thái khác Khoai sọ sử dụng đa dạng làm rau, lương thực, thức ăn gia súc làm thuốc Tại nhiều tỉnh miền núi, khoai sọ đóng vai trị quan trọng việc đảm bảo an toàn lương thực hộ gia đình nơng dân [6] Thuận Châu huyện miền núi tỉnh Sơn La, có vị trí địa lý địa hình phức tạp, tạo nên đa dạng điều kiện sinh thái Nơi có phong phú tài nguyên di truyền thực vật, hình thành nên nhiều giống trồng đặc sản cho vùng Tây Bắc, có khoai sọ với tên địa phương Cụ Cang Khoai sọ Cụ Cang thuộc nhóm môn sọ, biết đến hương thơm đặc biệt dùng làm thức ăn, có khả thích nghi cao với điều kiện sinh thái, phù hợp với tập quán canh tác huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La nguồn gen địa quý, có chất lượng cao Tuy nhiên, việc canh tác chủ yếu tự phát trồng diện tích nhỏ, kỹ thuật thâm canh thấp, sản lượng chưa cao chất lượng có xu hướng giảm Chính theo định số 79/2005/QĐ–BNN, ngày 5/12/2005 Bộ trưởng Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn trao đổi quốc tế nguồn gen trồng quý hiếm, đó, giống khoai sọ Cụ Cang đưa vào danh sách loại nguồn gen trồng quý Việt Nam hạn chế trao đổi với quốc tế Hiện nay, khoai sọ Cụ Cang sau thu hoạch phần củ nhỏ bảo quản làm giống, phần lớn củ sử dụng làm thực phẩm Vì vậy, số lượng củ để làm giống cho vụ sau ít, số củ giống bị hỏng nhiều q trình bảo quản Diện tích trồng khoai sọ Thuận Châu số huyện khác tỉnh Sơn La gần không phát triển thời gian gần nguồn giống không đủ Như vậy, vấn đề tạo đủ lượng giống để mở rộng diện tích sản xuất, đưa khoai sọ Cụ Cang lên tầm vị trí xứng đáng vấn đề cấp thiết Để khắc phục khó khăn nhân giống phương pháp nhân giống in vitro khơng nhân nhanh dịng giống có triển vọng, mà cịn phục tráng làm bệnh dịng giống khoai sọ bị thối hố nhiễm bệnh [3] Ở nước ta, số tác giả nghiên cứu nhân giống khoai môn sọ nuôi cấy in vitro Trần Thị Lệ cs (2011) nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro hai giống khoai sọ Hà Tĩnh khoai sọ Tây Nguyên, kết cho thấy thời gian khử trùng thích hợp cho chồi khoai sọ Hà Tĩnh khoai sọ Tây Nguyên 12 phút với HgCl2 0,2%, môi trường MS có mg/l BAP thích hợp cho q trình tái sinh chồi từ mẫu tạo đa chồi [5] Vũ Ngọc Lan cs (2015) nghiên cứu lưu giữ in vitro nguồn gen khoai môn địa cho kết khử trùng mẫu khởi đầu tốt HgCl2 0,1% phút + HgCl2 0,1% phút [3] Các kết nghiên cứu sở để tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro khoai sọ Cụ Cang (Colocasia esculenta L Schott) Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu - nghiên cứu: chồi khoai sọ Cụ Cang thu thập Cụ Cang xã Chiềng Ly, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La 2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu phương pháp khử trùng phù hợp để vào mẫu in vitro khởi đầu Nghiên cứu môi trường tái sinh chồi từ mẫu Nghiên cứu môi trường giai đoạn nhân nhanh Nghiên cứu môi trường trình rễ Nghiên cứu loại giá thể thích hợp cho nuôi cấy mô 2.3 Phương pháp nghiên cứu Môi trường điều kiện nuôi cấy Môi trường sử dụng nghiên cứu môi trường MS [7], tùy theo mục đích thí nghiệm mà bổ sung độc lập hay phối hợp chất điều hòa sinh trưởng khác Thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2.500 lux, nhiệt độ 25 ± 2°C độ ẩm khơng khí 75 - 85% Phương pháp nghiên cứu tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu Chồi khoai sọ Cụ Cang không sâu bệnh có kích thước 1cm x 1cm x 0,5cm rửa vịi nước chảy, sau rửa lại với xà phịng lỗng 20 phút Sau chồi ngâm cồn 70o phút, rửa lại lần với nước cất vô trùng Sử dụng dung dịch HgCl2 0,2% để thăm dò khả khử trùng mẫu chồi khoảng thời gian khác từ - 16 phút, 30 bình/ cơng thức, 01 mẫu cấy/ bình Các tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu nhiễm (%), tỷ lệ mẫu sống tạo (%),tỷ lệ mẫu chết (%) Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh chồi Sử dụng môi trường MS + 20 g/l saccharose + g/l agar, pH môi trường 5,8 bổ sung Benzylaminopurine (BAP) với nồng độ khác (0,0 – 4,0 mg/l), 30 bình/ cơng thức, 01 mẫu cấy/ bình Các tiêu theo dõi: số chồi/ mẫu, chất lượng chồi Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ α-NAA BAP đến khả tạo đa chồi Mơi trường MS có bổ sung BAP với nồng độ 3,0 mg/l bổ sung α-naphthaleneacetic acid (α-NAA) với nồng độ khác (0,0 – 0,7 mg/l), 30 bình/ cơng thức, 01 cây/ bình Các tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi (%), số chồi/ mẫu, chất lượng chồi Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ α-NAA đến khả tạo rễ Khi chồi in vitro khoảng 4-5 cm tiến hành cấy môi trường MS + 30 g/l saccharose + g/l agar bổ sung α-NAA với nồng độ khác (0,0 – 1,0 mg/l), 30 bình/ cơng thức, 01 cây/ bình Các tiêu theo dõi: Chiều dài rễ (cm), số lá/ chồi, chiều cao (cm) Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới sinh trưởng giai đoạn Để nghiên cứu loại giá thể đóng bầu thích hợp cho in vitro, sử dụng công thức với giá thể, tỷ lệ phối trộn khác sau: Công thức 1: Đất đồi- Cát đen - Phân vi sinh Công thức 2: Đất đồi - Xơ dừa - Phân vi sinh Công thức 3: Đất đồi -3 Trấu hun -2 Phân vi sinh Công thức 4: Giá thể Tribat công ty TNHH Công nghệ sinh học Sài Gòn xanh cung cấp (thành phần: chất hữu cơ: 24.91% - chất mùn: 14.45% - K2O tổng số: 0.73% - P2O5 tổng số: 0.30% - pH: 5.8-6.5 - CEC: 44.69 meq/100g; trung lượng vi lượng: - Mg, Mn, Zn, B, Cu, Mo, sắt dạng chelate - tỷ lệ cịn lại cấp hạt khác nhau) Thí nghiệm bố trí 30 bầu/cơng thức, bầu Các tiêu theo dõi: tỷ lệ sống (%), chất lượng 2.3 Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành từ tháng 03 năm 2019 đến tháng 01 năm 2020 trại trung tâm Thực hành- Thí nghiệm, trường Đại học Tây Bắc Kết nghiên cứu thảo luận Khử trùng mẫu vật Khoai môn sọ mẫu khó khử trùng, củ nằm đất, khơng có vảy bảo vệ mắt ngủ, vỏ củ xù xì có độ nhớt cao nên bị nhiễm khuẩn, việc khử trùng khó khăn để làm hồn tồn mẫu cấy [3, 6] Trong nhân giống in vitro, tạo nguồn vật liệu khởi đầu bước quan trọng có ý nghĩa định đến thành cơng quy trình Thành cơng giai đoạn không phụ thuộc vào đối tượng cụ thể, cách lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu mà phụ thuộc vào chất khử trùng thời gian khử trùng Hơn nữa, giai đoạn khử trùng mẫu vật yêu cầu không đạt tỷ lệ nhiễm thấp mà cần tỷ lệ sống cao mẫu sinh trưởng tốt Sử dụng HgCl2 0,2% để khử trùng chồi khoai sọ Cụ Cang thời gian khác Kết sau 30 ngày theo dõi trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng thời gian xử lý HgCl2 0,2% đến hiệu khử trùng mẫu chồi khoai sọ Cụ Cang sau 30 ngày nuôi cấy Công thức Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) CT1: HgCl2 0,2% phút Tỷ lệ mẫu (%) Tỷ lệ mẫu sống tạo Tỷ lệ mẫu chết 73,46a 25,32a 1,22a CT2: HgCl2 0,2% phút 45,17b 50,92b 3,91b CT3: HgCl2 0,2% 11 phút 20,06c 62,53c 16,61c CT4: Lần HgCl2 0,2% phút, lần phút 19,98c 75,86d 4,16b CT5: Lần HgCl2 0,2% 11 phút, lần phút 6,28d 64,53e 29,19d Các chữ khác cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê với p