Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ MAI HƯƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHƠNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Cơng nghệ Thực phẩm Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ MAI HƯƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHƠNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Cơng nghệ Thực phẩm Lớp: K48 - CNTP Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2016 - 2020 Người hướng dẫn: TS Lương Hùng Tiến Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Đề tài “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả tách chiết tinh dầu từ Trầu không đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu” nội dung em chọn để nghiên cứu làm khóa luận tốt nghiệp sau bốn năm theo học chương trình đai học, chuyên ngành Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nơng lâm Thái Ngun Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến tồn q thầy Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, với quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho em suốt bốn năm học tập rèn luyện trường Sáu tháng thực tập hội cho em tổng hợp thêm hệ thống hóa lại kiến thức học, đồng thời kết hợp với thực tế để nâng cao kiến thức chuyên môn Qua trình thực tập này, từ chỗ cịn bở ngỡ thiếu kinh nghiệm, em gặp phải nhiều khó khăn với giúp đỡ tận tình thầy TS Lương Hùng Tiến giúp em có kinh nghiệm quý báu để hoàn thành tốt tập viết lên báo cáo hoàn chỉnh Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn em - thầy TS Lương Hùng Tiến, người nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn em thực báo cáo Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phạm Thị Phương tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư cách làm việc khoa học cho em Cuối em xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân ln động viên, giúp đỡ em suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Với việc hạn chế kiến thức kinh nghiệm thực tiễn nên khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp quý báu Thầy Cô bạn Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 30 tháng năm 2020 Sinh viên ii DANH MỤC VIẾT TẮT CFU Colony fomat unit DNA Deoxyribo Nucleic Acid E coli Escherichia coli E ictaruli Edwardsiella ictaruli EAEC Enteroadherent E.coli EHEC Enterohaemorrhagic E.coli EIEC Enteroinvasive E.coli EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxigenic E.coli I Intermediate ( trung gian) MH Mueller-Hinton MIC Minimum Inhibitory Concentration MRSA Methicillin resistance Staphulococcus aureus PBS Phosphate buffer saline PPCĐ Phương pháp cổ điển PPVS Phương pháp vi sóng R Resistante (đề kháng) S Susceptible (nhạy cảm) S aureus Staphylococus areus TNF Tumor necrosis factor TSST Toxic shock syndromme toxin iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Vị trí phân loại thực vật trầu không Bảng 2.2 Thành phần chất chứa trầu tươi .5 Bảng 2.3 Phân loại Staphylococcus aureus .18 Bảng 2.4 Các loại dung huyết tố tụ cầu vàng 22 Bảng 2.5 Phân loại Escherichia coli 26 Bảng 2.6 Phân loại Salmonella 31 Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng 35 Bảng 3.2 Danh mục hóa chất sử dụng 35 Bảng 3.3 Bảng mã hóa điều kiện tối ưu .39 Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lượng tinh dầu từ Trầu không .40 Bảng 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu 42 Bảng 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu 44 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chiết dến hàm lượng tinh dầu 45 Bảng 4.4 Kết ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết tinh dầu từ Trầu không .46 Bảng 4.5 Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình chiết tinh dầu từ Trầu không .47 Bảng 4.6 Ảnh hưởng tinh dầu đến khả kháng khuẩn 49 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây Trầu không Hình 2.2 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus .19 Hình 2.3 Trực khuẩn Escherichia coli .27 Hình 2.4 Tụ cầu khuẩn Salmonella 32 Hình 4.1 Bề mặt đáp ứng hàm lượng tinh dầu Trầu khơng 48 Hình 4.2 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu hàm lượng tinh dầu Trầu khơng48 Hình 4.3 Kích thước vịng kháng khuẩn tinh dầu Trầu không chủng vi sinh vật thử nghiệm .50 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv MỤC LỤC v PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn dề 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Trầu không 2.1.1 Phân loại đặc điểm thực vật học trầu không 2.1.2 Thành phần hóa học công dụng trầu không .5 2.1.3 Một số nghiên cứu trầu không 2.2 Một số phương pháp tách chiết chất từ thực vật 10 2.2.1 Khái niệm mục đích chiết 10 2.2.2 Các phương pháp tách chiết 10 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 12 2.3.1 Những yếu tố thuộc thành phần, cấu tạo dược liệu .12 2.3.2 Những yếu tố thuộc dung môi 14 2.3.3 Những yếu tố thuộc kỹ thuật 15 2.4 Giới thiệu chung vi sinh vật thử nghiệm .17 2.4.1 Tổng quan Staphylococus aureus (S aureus) 17 vi 2.4.2 Tổng quan Escherichia coli (E coli) 25 2.4.3 Tổng quan Salmonella (Sal) 30 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 35 3.1 Vật liệu nghiên cứu 35 3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 36 3.3 Nội dung nghiên cứu 36 3.4 Phương pháp nghiên cứu 36 3.4.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 36 3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam III .36 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 37 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 41 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .42 4.1 Kết nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả chiết tách tinh dầu từ Trầu không 42 4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu 42 4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu .43 4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu 45 4.1.4 Tối ưu hóa q trình tách chiết tinh dầu từ Trầu không 46 4.2 Kết nghiên cứu khả kháng khuẩn tinh dầu Trầu không 48 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn dề Cây Trầu khơng có tên khoa học Piper betle L thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae), loài thực vật nhiệt đới quan trọng khu vực châu Á, trồng rộng rãi Ấn Độ, Sri Lanka, Malaysia, Thái Lan, … Tên thường gọi Trầu (tiếng Việt) Betle (tiếng Anh), Paan (tiếng Ấn Độ), Phlu (tiếng Thái) Sirih (tiếng Bahasa Indonesia) [33] Lá trầu nghiên cứu cho thấy có chứa số chất dễ bay [35], khoáng chất [30], glycosid [26], enzym, vitamin, axit amin thiết yếu [21] tanin [34] Dịch chiết Trầu chất kháng khuẩn, kháng viêm chống ung thư [31] Các đặc tính chống oxy hóa chống viêm trầu cho thành phần hóa học khác có Lá trầu mà có hàm lượng phenol flavonoid cao có hoạt tính chống oxy hóa chống ung thư cao [36,32] Chống lở loét hàm lượng flavonoid trầu cao Người ta thấy chiết tách tinh dầu có Trầu có khả chữa lành vết loét dày [35] Còn nước ta, y học cổ truyền Việt Nam, trầu sử dụng cho nhiều mục đích khác nhai trầu để răng, chữa viêm mủ chân răng, nước sắc trầu để rửa đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm, trầu ngâm nước sôi dùng nhỏ mắt để chữa bệnh viêm kết mạc [10] Ở Việt Nam PGS.TS Nguyễn Quang Linh cộng Khoa Thủy sản – Đại học Nông Lâm Huế chế tạo hợp chất Bokashi Cho dịch chiết Trầu lên men với vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu Eugenol, Chavicol, Estradiol, Cadinen, hợp chất phenol vi sinh vật chủ yếu nhóm Lactobacillus Chế phẩm vừa có khả kháng khuẩn có khả tăng cường vi sinh vật có lợi đường tiêu hóa động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi trường, không gây tồn dư thể động vật thủy sản; ao nuôi tôm bổ sung chế phẩm, tôm khỏe có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng so với tôm không bổ sung Bokashi trầu nồng độ 4,5 ppm có khả ức chế hoạt động nồng độ 7,5 ppm có khả tiêu diệt vi khuẩn: Vibrio, Aeromonas, E coli, Coliform, Staphylococcus Còn nồng độ 5.000 ppm đến 10.000 ppm có khả ức chế nấm: Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces ký sinh trùng: Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Gregarine Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi trầu có khả ức chế nấm Lagenium Fusarium Còn kết nghiên cứu nhà khoa học Trường đại học Cần Thơ cho thấy, tinh dầu Trầu không biểu hoạt tính kháng vi sinh vật tốt Nó có khả kháng vi khuẩn Gram dương Bacillus subtillis loại nấm gây hại Aspergillus niger Fusarium oxysporum Kết cho thấy tiềm kháng khuẩn kháng nấm tinh dầu Trầu không ứng dụng vào thực tế Qua nghiên cứu cho ta thấy khả kháng vi sinh vật tinh dầu Trầu nhằm đóng góp sở khoa học cho tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn nấm tinh dầu Trầu không, đồng thời tinh dầu Trầu khơng có giá trị kinh tế cao, mặt hàng có nhu cầu lớn thị trường sử dụng nhiều mỹ phẩm, y học ngành nông nghiệp Đồng thời bước đầu sử dụng thủy hải sản Xuất phát từ thực trạng em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả tách chiết tinh dầu từ Trầu khơng đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu” 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả tách chiết tinh dầu từ Trầu khơng - Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu - Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu - Tối ưu hóa q trình tách chiết tinh dầu từ Trầu không - Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Trầu khơng 43 muối NaCl 20% tương ứng với hàm lượng tinh dầu 1,13% cao khoảng 0,63% so với hàm lượng tinh dầu chiết nồng độ muối NaCl 10% cao 0,38% so với hàm lượng tinh dầu chiết nồng độ muối NaCl 15% Do việc thêm muối NaCl vào q trình chưng cất nhằm mục đích tăng hiệu suất ly trích NaCl hịa tan nước tạo thành dung dịch điện ly dẫn đến làm tăng nhiệt độ sơi nước, tinh dầu trích ly nhiều [29] Cịn ta tăng nồng độ muối NaCl lên đến 25% hàm lượng tinh dầu lại có xu hướng giảm cịn 0,90% Do chưng cất với nồng độ NaCl lớn hơn, lượng tinh dầu thu giảm, điều giải thích sử dụng muối nồng độ cao lớp biểu bì bên ngồi chứa tinh dầu bị co lại, ngăn cản khuếch tán tinh dầu ngồi Vì vậy, nồng độ muối NaCl thích hợp để thực q trình tách chiết tinh dầu từ Trầu không 20% 4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng tinh dầu thu Trong q trình trích ly phương pháp lôi nước, gia nhiệt hỗn hợp nguyên liệu nước, nước thẩm thấu vào lớp tế bào, làm phá vỡ túi tinh dầu lôi tinh dầu theo nước Nếu lượng nước q khơng đủ hịa tan chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu, làm tinh dầu khơng Sử dụng nhiều dung mơi để trích ly khả khuếch tán tinh dầu vào dung môi lớn [2] Dung môi dễ dàng thẩm thấu vào nguyên liệu hòa tan cấu tử cần trích ly nên lượng tinh dầu dung môi cao [11] Tuy nhiên, giới hạn định lượng tinh dầu thu hồi tăng lên không đáng kể dù tăng lượng dung môi giảm lượng nước nhiều gây tổn thất tinh dầu chưng cất lâu [5] Bên cạnh dùng lượng dung mơi lớn gây lãng phí, thời gian chưng cất lâu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu thu được, tốn dung môi, tốn thời gian chi phí cao Cho nên, thí nghiệm tiến hành để khảo sát ảnh hưởng thể tích nước cất thêm vào đến hàm lượng tinh dầu trích ly từ Trầu tươi cách tiến hành chưng cất tinh dầu với thể tích nước khác nhau, cố định nồng độ dung dịch NaCl Mục đích nhằm xác định thể tích nước tối ưu cho trình chưng cất, tránh sử dụng lượng nước q dư, khơng có lợi cho việc chiết tách tinh 44 dầu tinh dầu chứa nhiều hợp chất dễ tan nước Kết thể Bảng 4.2: Bảng 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu Hàm lượng tinh dầu (l/kg) (%) CT1 2/1 0,51c CT2 2,5/1 0,95a CT3 3/1 1,05a CT4 3,5/1 0,73b Công thức Ghi chú: chữ số một cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thớng kê mức α