Ba triterpene 3β, 5α, 6β-trihydrosterol, ganoderic acid Z, chodrinllasterol đã được phân lập từ thân cây gấc Momordica cochinchinesis. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ nhân 1 chiều và 2 chiều cũng như kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo.
TẠP CHÍ KHOA HỌC SỐ 4/2016 23 CÁC HỢP CHẤT TRITERPENE TỪ THÂN CÂY GẤC (Momordica cochinchinesis) Phạm V n Hoan1(1), Nguyễn Xuân Nhiệm2, Phạm V n Công3 , Đinh Thị Hồng Minh4 Trường Đại học Thủ đô Hà Nội Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Tây Bắc Học viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam Tóm tắt: Ba triterpene 3β, 5α, 6β-trihydrosterol, ganoderic acid Z, chodrinllasterol phân lập từ thân gấc Momordica cochinchinesis Cấu trúc hóa học hợp chất xác định phương pháp phổ cộng hưởng từ nhân chiều chiều kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo Từ khóa: Momordica cochinchinesis, Cucurbitaceae, triterpene MỞ ĐẦU Gấc có tên khoa học Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng, thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae), Violales, chi Mƣớp đắng (Momordica) Cây gấc leo khỏe, chiều dài đến 15 m Thân có tiết diện góc Lá gấc nhẵn, thùy hình chân vịt từ đến dẻ, dài 8-18 cm Gấc lồi đơn tính khác gốc Hoa sắc vàng, hình trịn, sắc xanh, chín chuyển sang màu đỏ cam, đƣờng kính khoảng 15 đến 20 cm [1] Dầu gấc đƣợc dùng trƣờng hợp thể cần vitamin A nhƣ trẻ chậm lớn, bệnh khô mắt, quáng gà, ngƣời ăn mệt mỏi Dùng ngồi, bơi vào vết thƣơng, vết bỏng mau lên da non, chóng lành Ở Anh, số chuyên gia dùng vitamin A liều cao để chữa ung thƣ, có đạt kết nhƣng liều cao dễ gây biến chứng Do 10 năm gần đây, ngƣời ta chuyển sang dùng β-caroten Dầu gấc có tác dụng nhuận tràng, dùng thích hợp cho ngƣời bị táo bón Hạt gấc dùng để chữa mụn nhọt, tràng nhạc lâu ngày không khỏi, quai bị, sƣng v , tắc tia sữa, trĩ, lòi dom Có nơi cịn dùng hạt gấc chữa sốt rét Rễ gấc có vị đắng, tính mát, có tác dụng trừ thấp nhiệt, hoạt huyết, lợi tiểu [1] (1) Nhận ngày 24.04.2016, gửi phản biện duyệt đăng ngày 10.05.2016 Liên hệ tác giả: Phạm Văn Hoan; Email: hoanhoasp@daihocthudo.edu.vn 24 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ ĐÔ HÀ NỘI Dầu gấc có hàm lƣợng β-caroten (hay tiền vitamin A) cao Dƣới tác dụng men carotenaza có gan thành ruột, phân tử β-caroten đƣợc chuyển thành hai phân tử vitamin A Viện Quân y 108 phối hợp với Bộ môn Di truyền trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN tiến hành xác định tác dụng dầu gấc lên men thuộc chủng Mortimer (Mỹ) nhạy cảm với tia xạ So với đối chứng, dầu gấc có khả phục hồi rõ rệt làm bền vững nấm men bị nhiễm xạ Thêm vào đó, hoạt tính kháng ung thƣ dịch chiết gấc đƣợc Jung K cộng nghiên cứu in vitro in vivo Theo đó, dịch chiết lồi có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào ung thƣ tuyến đại tràng với trọng lƣợng khối u giảm đến 23,6% so với lơ đối chứng Hơn nữa, dịch chiết lồi có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thƣ ruột tế bào ung thƣ gan HepG2 Các nghiên cứu sâu tác dụng kháng ung thƣ dịch chiết gấc đƣợc nghiên cứu Nghiên cứu trình gây hoại tử tế bào ung thƣ đại tràng từ chiết suất gấc trình apoptosis Phƣơng pháp xác định kháng nguyên immunoblotting cho thấy cyclin A, Cdk2, p27 waf1/kip1 giảm xuống mức quy định [2] THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Dây gấc đƣợc thu hái Hà Nội vào tháng 9/2013 Tên khoa học đƣợc PGS.TS Ninh Khắc Bản, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giám định Mẫu tiêu đƣợc lƣu giữ Viện Hoá Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2.2 Hóa chất, thiết bị Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát chất đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm 365 nm dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun lên mỏng, sấy khơ hơ nóng từ từ đến màu Sắc ký cột (CC): Đƣợc tiến hành với chất hấp phụ Silica gel pha thƣờng pha đảo Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (240 - 430 mesh) Silica gel pha đảo YMC (30 - 50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo máy Bruker AM500 Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Phổ khối lượng (LC-MS): Đo máy Agilent 1100 Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2.3 Phân lập hợp chất TẠP CHÍ KHOA HỌC SỐ 4/2016 25 Dây gấc M cochinchinesis sau phơi khô đƣợc nghiền thành bột (1,2 kg) đƣợc chiết lần với methanol, siêu âm (ở 50oC, lần giờ) Dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, gom loại bỏ dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 40 g cặn chiết methanol Cặn chiết đƣợc hịa tan vào lít nƣớc cất tiến hành chiết phân bố với chloroform thu đƣợc cặn chloroform (9 g) cặn nƣớc (30 g) Cặn cloroform (9 g) đƣợc hịa tan dung mơi dichloromethane bổ sung silica gel tỉ lệ 1/2 Quay loại dung môi đến khô nghiền mịn Hỗn hợp phân tách thành năm phân đoạn C1-C5 sắc kí cột silica gel pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải tăng dần n-hexane/acetone: 10/1→1/1 (v/v) Phân đoạn C2 (1g) tiếp tục đƣợc phân tách thành phân đoạn C2.1 C2.2 sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi acetone/ nƣớc: 6/1 (v/v) Hợp chất (5.0 mg) thu đƣợc sau tinh chế phân đoạn C2.2 (260 mg) sắc ký cột silica gel pha thƣờng sử dụng hệ dung môi hexane/acetone: 2/1 (v/v) Phân đoạn C3 (1,2g) đƣợc phân tách sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi acetone/nƣớc: 2/1 (v/v) thu đƣợc bốn phân đoạn C3.1-C3.4 Hợp chất (10.0 mg) thu đƣợc tinh chế phân đoạn C3.2 (300 mg) sắc ký cột sephadex với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/ methanol: 1/3 (v/v) Phân đoạn C4 (1,5g) tiếp tục đƣợc phân tách thành hai phân đoạn C4.1 C4.2 cột sắc ký silica gel pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/ methanol/ nƣớc: 7/1/0.1 Tinh chế phân đoạn C4.1 (600 mg) sắc kí cột silica gel pha đảo với hệ dung mơi rửa giải acetone/ methanol: 1/8 (v/v) thu đƣợc hợp chất (15.0 mg) 3β,5α,6β-trihydrosterol (1): Chất bột màu trắng; công thức phân tử CTPT C28H46O3; khối lƣợng phân tử M=430 1H-NMR (500 MHz, DMSO) 13C-NMR (125 MHz, DMSO), xem Bảng Ganoderic acid Z (2): Chất bột màu trắng; CTPT C30H48O3; khối lƣợng phân tử M=456 1H- NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), xem Bảng 1 Chodrinllasterol (3): Chất bột màu trắng; CTPT C28H48O; khối lƣợng phân tử M=412 H- NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), xem Bảng Hình Cấu trúc hóa học hợp chất 26 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ ĐÔ HÀ NỘI KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hợp chất thu đƣợc dƣới dạng chất bột màu trắng Phổ 1H-NMR( Bảng 1) xuất tín hiệu cộng hƣởng nhóm methyl bậc ba singlet δH 0,54 (3H, s, H-18) 0,90 (3H, s, H-19) nhóm methyl doublet δH 0,99 (3H, d, J=6,5, H-21), 0,83 (3H, d, J=6,5, H-26), 0,81 (3H, d, J=7,0, H-27), 0,89 (3H, d, J=6,5, H-28) Tín hiệu proton δH 5,19 (1H, dd, J=15,5; 8,0, H-22) 5,25 (1H, dd, J=15,5; 7,0, H-23) cho thấy tín hiệu liên kết đôi với số J nằm khoảng 12-16 chứng tỏ vị trí trans Ngồi phổ pronton cịn xuất tín hiệu proton olefinic triplets δH 5,08 (1H, t, 2,5, H-7) Phổ 13C-NMR phổ DEPT xuất tín hiệu 28 ngun tử cacbon có cacbon bậc có cacbon olefin δC 139,.71 (C-8) cacbon bậc lại δC 74,49 (C-5); 42,27 (C-13); 36,66 (C-10); 11 cacbon bậc có cacbon olefin δC 135,28 (C-22); 131,39 (C-23); 119,42 (C-7) cacbon bậc lại δC 72,13 (C-6); 65,98 (C-3); 55,32 (C-17); 54,17 (C-14); 42,27( C-9); 42,00 (C-24); 40,09 (C-20); 32,46 C-25); cacbon bậc δC 40,19 (C-4); 39,00 (C-12); 32,92 (C-2); 31,17 (C-1); 27,71 (C-16); 22,59 (C-15); 21,33 (C-11); cacbon bậc δC 20,97 (C-21); 19,74 (C-26); 19,46 (C-27); 17,70 (C-19); 12.07 (C-18) Từ liệu phổ nêu hợp chất đƣợc dự đốn 3β,5α,6β-trihydroxysterol Thơng qua tƣơng tác trực tiếp H-C phổ HSQC, độ chuyển dịch hóa học proton đƣợc gán xác với cacbon tƣơng ứng (Bảng 1) So sánh số liệu phổ NMR hợp chất thấy hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ 3β,5α,6β-trihydroxysterol [3] giá trị tƣơng ứng Thêm vào cấu trúc hợp chất lần đƣợc khẳng định thêm dựa tƣơng tác HMBC Qua phân tích liệu phổ hợp chất với liệu phổ hợp chất tham khảo, lần khẳng định hợp chất 3β,5α,6β- trihydroxysterol Bảng Dữ liệu phổ NMR hợp chất No 10 11 12 13 δC δCa,b 3,6 33.9 67,6 41,9 76,2 74,3 120,5 141,6 43,8 38,1 22,5 40,0 43,8 31,17 32,92 65,98 40,19 74,49 72,13 119,42 139,71 42,27 36,66 21,33 39,00 47,86 $ δHa,c mult (J, Hz) 3.77 (m) 5,08 (t, 2,5) δC δCa,b 31,6 34,7 218,2 47,6 51,5 19,7 199,1 133,5 135,5 37,2 21,3 31,2 44,8 30,11 25,73 76,11 37,61 44,26 18,19 25,91 134,07 134,73 36,94 20,96 31,03 44,56 δHa,c mult (J, Hz) 3.43 (br s) δC δCa,b 37,1 26,1 71,0 34,2 40,2 29,6 117,4 139,6 49,4 34,2 21,5 39,4 43,3 38,02 31,50 71,08 37,17 40,30 29,66 117,48 139,58 49,48 34,24 21,57 39,49 43,31 © δHa,c mult (J, Hz) 5,16 (m) TẠP CHÍ KHOA HỌC SỐ 4/2016 14 15 16 17 18 19 20 21 22 55,3 23,5 28,5 56,12 12,6 18,8 40,8 21,5 136,2 54,17 22,59 27,71 55,32 12,07 17,70 40,09 20,97 135,38 23 132,2 131,39 24 25 26 27 28 29 30 43,2 33,4 20,2 19,9 17,9 42,00 32,46 19,74 19,46 17,27 0,54 (s) 0,90 (s) 0,99 (d, 6,5) 5,19 (dd, 15,5; 8,0) 5.25 (dd, 15,5; 7,0) 0,83 (d, 6,5) 0,81 (d, 7,0) 0,89 (d, 6,5) 27 49,91 31,2 28,1 50,6 16,1 18,8 36,6 18,8 49,91 30,81 28,23 50,33 15,77 18,48 36,38 18,53 36,3 34,85 27,0 26,90 147,4 126,2 20,7 173,8 21,6 26,4 24,5 145,73 6,89 (t, 7,5) 126,59 11,99 172,73 22,12 0,87 (s) 28,04 0,97 (s) 24,26 0,88 (s) 0,69 (s) 0,99 (s) 0,94 (d, 6,5) 55,1 23,0 28,5 55,9 12,0 13,0 40,8 21,1 138,2 129,4 51,2 31,9 19,0 21,4 25,4 12,4 55,14 23,02 28,40 55,92 12,07 0,55 (s) 13,05 0,80 (s) 40,76 20,93 1,03 (d, 6,5) 138,12 5,03 (dd, 15,0; 8,5) 129,52 5,17 (dd, 15,0; 8,5) 51,24 31,83 18,83 0,79 (d, 6,0) 21,35 0,85 (d, 6,5) 25,39 12,44 0,81 (t, 7,5) $ δC 3β,5α,6β-trihydroxysterol [3] #δC 3β-hydroxy-7-oxo-5α-lanosta-8,24(E)dien-26-oic acid [4]; ©δC chodrinllasterol [5] Hợp chất thu đƣợc có dạng chất bột vơ định hình màu trắng Phổ proton 1H-NMR (Bảng 2) xuất tín hiệu cộng hƣởng nhóm methyl bậc ba singlet δH 0,69 (3H, s, H-18), 0,87 (3H, s, H-28), 0,88 (3H, s, H-30), 0,97 (3H, s, H-29) 0,99 (3H, s, H-19); methyl doublet với số J=6,5Hz δH 0,94 (3H, d, J=6,5, H-21); tín hiệu proton vinyl methyl singlet δH 1,84 (3H, s, H-26) Bên cạnh phổ proton xuất tín hiệu proton olefinic triplet với J=7,5Hz δH 6,89 (1H, t, J=7,5, H-24) Và tín hiệu proton δH 3,43 (1H, br s, H-3) Phổ 13C-NMR phổ DEPT xuất tín hiệu 30 ngun tử cacbon có cacbon bậc với nhóm cacboxycacbonyl δC 172,73(C-27) cacbon olefin δC 126,59(C-25); 134,07(C-8); 134,73(C-9) nhóm cacbon bậc cịn lại δC 36,94(C-10); 37,61(C-4); 44,56(C13); 49,91(C-14) cacbon bậc gồm cacbon olefin δC 145,73(C-24) 36,38(C-20); 44,26(C-5); 50,33(C-17); 76,11(C-3) 10 cacbon bậc δC 18,19(C-6); 20,96(C-11); 25,73(C-2); 25,91(C-7); 26,90(C-23); 28,23(C-16); 30,11(C-1); 30,81(C-15); 31,03(C-12); 34,85(C-22) cacbon bậc δC 11,99(C-26); 15,77(C-18); 18,48(C-19); 18,53(C21); 22,12(C-28); 24,26(C-30); 28,04(C-29) Thông qua tƣơng tác trực tiếp H-C phổ HSQC, độ chuyển dịch hóa học nguyên tử proton đƣợc gán với cacbon tƣơng ứng (Bảng 1) So sánh với số liệu phổ hợp chất ganoderic acid Z thấy hoàn toàn phù hợp vị trí tƣơng ứng Cấu trúc đƣợc khẳng định thêm dựa kết phân tích phổ chiều HMBC Qua phân tích phổ nhƣ kết hợp với liệu tài liệu tham khảo khẳng định hợp chất ganoderic acid Z Đây lần số liệu phổ ganoderic acid Z đƣợc công bố 28 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ ĐƠ HÀ NỘI Hình Các tƣơng tác HMBC Hợp chất thu đƣợc dạng tinh thể hình kim màu trắng Phổ proton 1H-NMR (Bảng 3) xuất tín hiệu cộng hƣởng nhóm methyl bậc ba singlet δH 0,55 (3H, s, H-18) 0,80 (3H, s, H-19) Tín hiệu cộng hƣởng nhóm methyl bậc doublet δH 0,79 (3H, d, J=6,0, H-26), 0,85 (3H, d, J=6,5, H-27) nhóm metyl triplet δH 0,81 (3H, t, J=7,5, H-29) Bên cạnh phổ proton cịn xuất tín hiệu δH 5,19 (1H, dd, 15,0; 8,5, H-22) 5,03 (1H, dd, 15,0; 8,5, H-23) cho thấy tín hiệu liên kết đôi với số J nằm khoảng 12-16HZ cho thấy vị trí trans Ngồi phổ 1HNMR cịn cho thấy tín hiệu proton olefinic δH 5.16 (1H, m, H-7) Phổ 13C-NMR phổ DEPT xuất tín hiệu 29 nguyên tử cacbon có nguyên tử cacbon bậc δC 139,58 (C-8), 43,31 (C-13), 34,24 (C-10) 11 nguyên tử cacbon bậc δC 138,12 (C-22), 129,52 (C-23), 117,48 (C-7), 71,08 (C-3), 55,92 (C-17), 55,14 (C-14), 51,24 (C-24), 49,48 (C-9), 40,76 (C-20), 40,30 (C-5), 31,83 (C-25) nguyên tử cacbon δC 39,49 (C-12), 38,02 (C-1), 37,17 (C-4), 31,50 (C-2), 29,66 (C-6), 28,40 (C-16), 25,39 (C-28), 23,02 (C-15), 21,57 (C-11) nguyên tử cacbon bậc δC 21,35 (C-27), 20,93 (C-21), 18,83 (C-26), 13,05 (C-19), 12,44 (C-29), 12,07 (C-18) Từ số liệu phổ hợp chất với số liệu tài liệu tham khảo thấy hồn tồn phù hợp vị trí tƣơng ứng khẳng định hợp chất chodrinllasterol KẾT LUẬN Bằng phƣơng pháp nghiên cứu truyền thống phân lập đƣợc tinh dầu thân Gấc Sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu đại (sắc kí lỏng hiệu cao HPLC; phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều chiều) phân lập xác nhận đƣợc cấu trúc số cấu tử tinh dầu Đó tritecpen 3β,5α,6βtrihydrosterol, ganoderic acid Z, chodrinllasterol TẠP CHÍ KHOA HỌC SỐ 4/2016 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Huy Bích, Nguyễn Tập (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr.433- 440 Jung K, Chin YW, Chung YH, Park YH, Yoo H, Min DS, Lee B, Kim J (2013), Anti-gastritis and wound healing effect of Momordicae Semen extract and its active component, Immunopharmacology and Immunotoxicology, tr.35, tr.126-132 PiccalliI V, Sica D (1987), Four new tryhydroxylated sterols from the sponge spongionella gracilis, Journal of Natural Products, 50, pp.915-920 Li C, Li Y, H.Sun H (2006), New ganoderic acids, bioactive triterpenoid metabolites from the mushroom Ganiderma lucidum, Natural Product Reseach, 20, pp.985-991 Wandji J, Tillequin F, Mulholland DA, Wansi JD, Fomum TZ, Fuendjiep V, Libot F, Tsabang N (2002), Fatty acid esters of triterpenoids and steroid glycosides from Gambeya africana, Planta Medica, 68, pp.822-826 SOME TRITERPENES FROM TRUNK OF MOMORDICA COCHINCHINESIS Abstract: Some triterpenes as 3β,5α 6β-trihydrosterol, ganoderic acid Z, chodrinllasterol have been isolated from trunk of Momordica cochinchinesis Chemical strucsture of these compounds have been confirmed by NMR (1D and 2D) and compared with references Keywords: Momordica cochinchinesis, Cucurbitaceae, triterpene ... tƣơng tác HMBC Qua phân tích liệu phổ hợp chất với liệu phổ hợp chất tham khảo, lần khẳng định hợp chất 3β,5α,6β- trihydroxysterol Bảng Dữ liệu phổ NMR hợp chất No 10 11 12 13 δC δCa,b 3,6 33.9 67,6... hợp chất thấy hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ 3β,5α,6β-trihydroxysterol [3] giá trị tƣơng ứng Thêm vào cấu trúc hợp chất lần đƣợc khẳng định thêm dựa tƣơng tác HMBC Qua phân tích liệu phổ hợp. .. 13,05 (C-19), 12,44 (C-29), 12,07 (C-18) Từ số liệu phổ hợp chất với số liệu tài liệu tham khảo thấy hồn tồn phù hợp vị trí tƣơng ứng khẳng định hợp chất chodrinllasterol KẾT LUẬN Bằng phƣơng