Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đóan viêm gan siêu vi

Ứ g dụng sinh học phân tử chẩn đóan viêm gan siêu vi Các câu hỏi th ng gặp Viêm gan siêu vi B Tơi thử máu có kết dương tính HBsAg, có bị không? HBsAg kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B Một người thử máu thấy HBsAg dương tính tức người bị nhiễm virus viêm gan B Như có bị nguy hiểm khơng? có cần phải điều trị hay không? Đa số người bị nhiễm virít viêm gan B có đáp ứng miễn dịch bảo vệ, tức tạo kháng thể chống HBsAg (gọi anti-HBsAg) tiêu diệt virus viêm gan B Người thử máu dương tính anti-HBsAg Tuy nhiên có số người hệ miễn dịch lại tạo kháng thể bảo vệ nên thử máu lúc dương tính với HBsAg Trong thể người có đấu tranh qua lại hệ miễn dịch virus Nếu hệ miễn dịch cân hay ưu kiềm hãm khơng cho virus nhân thành virus hoàn chỉnh, mà khơng có hay có virus hoàn chỉnh vào máu Những trường hợp gọi người lành mang virus, thử máu thấy HBsAg dương tính dấu hiệu cho thấy có virus hồn chỉnh HBV-DNA, tức acid nhân virus, thường âm tính hay dương tính với số lượng (số copies) thấp (105) Chính mà bị chẩn đoán bị viêm gan B mạn tính (tiêu chuẩn chẩn đốn HBV-DNA 105 copies/ml, ALT cao gấp lần bình thường hay xét nghiệm sinh thiết fibroscan thấy tổ chức gan bị tổn thương) thiết phải điều trị đặc hiệu để kiềm chế không cho virus nhân để gây tổn thương gan Nhiều nghiên cứu cho thấy 169 không điều trị để khống chế số lượng virus hồn chỉnh máu bệnh nhân ln ngưỡng phát nguy xơ gan hay ung thư gan người cao Vậy làm để biết tơi điều trị có hiệu quả? tơi cần phải điều trị bao lâu? Sau bắt đầu điều trị đặc hiệu khoảng tháng, bác sĩ cho xét nghiệm lại máu bệnh nhân để đếm số lượng virus viêm gan B (xét nghiệm định lượng HBV-DNA) có máu Nếu lượng HBV-DNA máu giảm trước điều trị 100 lần có nghĩa điều trị có hiệu quả, xét nghiệm phải làm liên tục tháng lần xét nghiệm định lượng HBV-DNA cho kết ngưỡng phát Kể từ trở bác sĩ cần cho xét nghiệm phát HBVDNA mà không cần phải định lượng tháng lần để theo dõi xem có tái phát khơng Thời gian điều trị đặc hiệu kéo dài nhiều năm nhà y học đạt đến thành công khống chế virus không cho nhân loại trừ virus chúng tồn tế bào gan dạng cccDNA (covalently closed circular DNA) không bị tác động thuốc kháng virus Một điều chắn virus viêm gan B bệnh nhân từ trước điều trị hay trình điều trị mà DNA chúng bị đột biến vùng gen tiền lõi (precore mutation), đặc biệt có đột biến vùng khởi động (promoter mutation), nguy bệnh nhân bị xơ gan và/hay ung thư gan cao, nên bệnh nhân này, bác sĩ phải điều trị đặc hiệu cho họ suốt đời mà không phép ngưng điều trị Xin cắt nghĩa cho rõ đột biến ♣ ✁✂✄ ✁☎✂✄ ✁ promoter gì? Làm để biết tơi có mang virus viêm gan B bị đột biến ♣ ✁✂✄ ✁☎✂✄ ✁ promoter? Trước bắt đầu điều trị đặc hiệu, tơi có cần làm xét nghiệm để biết có mang virus viêm gan B bị đột biến ♣ ✁✂✄ ✁☎✂✄ ✁ promoter không? Trong gen (DNA) virus viêm gan B có gene gọi gene tiền lõi, mã hố thơng tin di truyền giúp virus sinh kháng nguyên e (HBeAg) kháng nguyên virus tiết nhân Do máu bệnh nhân có xuất HBeAg có nghĩa có nhân virus thể Nếu hệ thống miễn dịch bệnh nhân thắng virus bị chặn lại không nhân đồng thời máu bệnh nhân xuất kháng thể chống HBeAg (gọi anti-HBeAg) Trường hợp y học gọi có chuyển đổi huyết chứng minh hệ miễn dịch 170 thắng với kết xét nghiệm cho thấy HBeAg trở nên âm tính, anti-HBeAg dương tính, HBV-DNA khơng phát hay phát số lượng thấp Cũng trình đấu tranh virus với hệ miễn dịch cũa thể, có chủng virus viêm gan B bị đột biến precore/core promoter tạo nên mã kết thúc gene mà virus tổng hợp kháng nguyên HBeAg, lúc virus gọi bị đột biến precore với kết xét nghiệm cho thấy HBeAg âm tính, AntiHBeAg dương tính, HBV-DNA dương tính với số lượng cao, đồng thời men gan trồi sụt thất thường phản ảnh tình trạng cân hệ miễn dịch khả nhân phá huỷ tế bào gan virus Trường hợp bạn cần làm xét nghiệm phát đột biến precore thử nghiệm cho kết HBV-DNA dương tính 105 copies/ml, HBeAg âm tính anti HBeAg dương tính Tại phải làm xét nghiệm phát đột biến precore trường hợp này? bác sĩ phải phân biệt với tình trạng chuyển đổi huyết Nếu đột biến precore mà chuyển đổi huyết bác sĩ xem xét ngưng điều trị cho bạn sau thời gian điều trị mà bác sĩ cho cần thiết Còn đột biến precore chắn bác sĩ khơng thể ngưng mà phải điều trị cho bạn suốt đời Xét nghiệm phát đột biến precore cơng ty Nam Khoa thực giải trình tự với nguyên tắc dùng PCR khuếch đại đoạn dài 250 bases vùng gene preS chứa điểm bị đột biến giải trình tự trực tiếp để phát xem có đột biến điểm (và hai vị trí quan trọng liên quan đến khả sinh ung thư vị trí promoter) hay khơng Ngồi ra, bệnh nhân q trình điều trị mà HBV-DNA dương tính trở lại HBeAg âm tính mà antiHBeAg dương tính phải định làm đột biến precore để xem có phải đột biến xãy bệnh nhân điều trị hay khơng? Nếu có đột biến precore khơng thể ngưng điều trị bệnh nhân mà họ phải điều trị suốt đời Ch❃c phải điều trị thuốc kháng virus thời gian dài rồi!!✳✳✳Các thuốc có hiệu khơng bị virus dề kháng khơng? làm để biết thuốc sử dụng bị đề kháng? Do phải điều trị thuốc kháng virus thời gian dài nên virus có hội tiếp xúc với thuốc kháng virus chúng có hội bị đột biến để kháng thuốc Do thời gian điều trị, xét nghiệm theo dõi virus HBV-DNA nhiên bị trở lại 171 dương tính lượng HBV-DNA bị tăng lên dần dấu hiệu cho biết virus có khả kháng lại thuốc điều trị Lúc cần phải xét nghiệm để phát xem thuốc có bị virus đề kháng khơng? Hiện cơng ty Nam Khoa phát triển phương pháp giải trình tự đoạn gen 550bases vùng gene preS virus để phát nhiều điểm đột biến gây nên tình trạng virus viêm gan B đề kháng lamivudine adefovir hai thuốc kháng virus sử dụng Việt Nam Kỹ thuật vượt trội nhiều kỹ thuật khác nhờ khả phát nhiều vị trí đột biến cung cấp cho bác sĩ nhiều thơng tin định xác liệu có nên thay đổi thuốc khơng Nói tóm lại, tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B Việt Nam dân số cao (>15%) Tuy nhiên bị nhiễm virus viêm gan B cần phải điều trị mà cần phải phân biệt họ có phải người lành mang virus người bị viêm gan virus B mạn tính Bác sĩ nên điều trị cho người xác định bị viêm gan virus B mạn tính mà thơi, xét nghiệm sinh học phân tử cần thiết để định bệnh nhân xét nghiệm phát định lượng HBV-DNA Khi điều trị cho bệnh nhân ngồi xét nghiệm định lượng HBV-DNA để theo dõi hiệu điều trị xét nghiệm sinh học phân tử khác cần thiết phải định bệnh nhân, ví dụ xét nghiệm phát đột biến precore cần phải cho bệnh nhân HBeAg âm tính, anti-HBeAb dương tính mà HBV-DNA cịn dương tính để xác định bệnh nhân có bị đột biến precore hay không mà định xem liệu có phải điều trị suốt đời cho bệnh nhân khơng Ngồi xét nghiệm phát đột biến gây kháng thuốc cần thiết phải định trình điều trị nhiên HBV-DNA bệnh nhân dương tính với số lượng tăng lên trở lại Tôi điều trị thuốc kháng virus cách tháng, cách vài ngày tơi có làm xét nghiệm HBV-DNA kết âm tính, HbeAg tơi cịn [+] với trị số OD cao Tơi nghe nói HbeAg [+] HBV-DNA phải [+], trường hợp HbeAg [+] mà HBV-DNA lại [-]? Đúng vậy, HbeAg [+] chứng minh HBV thể bệnh nhân họat động nhân bản, mà có virus hịan chỉnh máu, có HBVDNA [+] Tuy nhiên trường hợp bạn, điều trị thuốc kháng virus (hiện có nhiều thuốc kháng virus dành cho nhiễm HBV hiệu quả), nên virus 172 bị ngăn chận khơng cho nhân bản, HBV-DNA biến khỏi máu sớm HbeAg, biến khỏi máu chậm Chính HBV-DNA dấu ấn tốt để theo dõi đáp ứng sớm điều trị nên nhà y học thống sử dụng HBV-DNA làm số theo dõi đáp ứng điều trị HbeAg Viêm gan siêu vi C Tơi thử máu có kết dương tính anti-HCV, có bị khơng? Anti-HCV kháng thể đặc hiệu virus viêm gan C (HCV) Bạn dương tính anti-HCV tức máu bạn có kháng thể đặc hiệu HCV có nghĩa bạn bị nhiễm virus viêm gan C bị nhiễm virus khỏi Như vậythì làm để biết bị nhiễm HCV? Một người bị nhiễm virus viêm gan C thường hệ miễn dịch người tạo miễn dịch bảo vệ chống virus, xuất kháng thể đặc hiệu HCV (anti-HCV) khơng có ý nghĩa thể có miễn dịch bảo vệ loại trừ virus Chỉ có số may mắn khỏi nhờ hệ thống chống đở không đặc hiệu khác thể loại trừ virus, lại đa số trường hợp, virus tồn tại, nhân tế bào gan phóng thích virus vào máu Do để xác định người có bị nhiễm HCV, bác sĩ phải định làm xét nghiệm phát HCV-RNA, tức tìm thành phần acid nhân virus viêm gan C máu Nếu xét nghiệm cho kết HCV-RNA dương tính có nghĩa máu bệnh nhân có diện virus viêm gan C, tức bệnh nhân bị nhiễm HCV Xét nghiệm HCV-RNA xét nghiệm thuộc loại gì, thực được? Mặc dù khoa học lôi ánh sáng từ năm 1985 ngày hôm chưa có nhìn thấy virus viêm gan C qua kính hiển vi điện tử hay ni cấy virus Tuy nhiên nhờ biết rõ gene virus nên người ta giả định cấu tạo virus Có thể tóm tắt loại virus có lõi, hay gọi nơm na nhân virus có cấu tạo RNA Xét nghiệm phát HCV-RNA xét nghiệm tìm máu bệnh nhân diện RNA virus Đây xét nghiệm sinh học phân tử, thông thường thực kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) kỹ thuật nhân DNA ống nghiệm qua chu kỳ nhiệt độ Để làm xét nghiệm, máu bệnh nhân sau lấy tách huyết hay huyết tương sau phịng thí 173 nghiệm tách chiết RNA virus mẫu huyết tương huyết để đưa vào ống nghiệm Trong ống nghiệm này, RNA virus phiên mã ngược thành DNA bổ sung, gọi cDNA, cDNA nhân thành hàng tỷ để phát Nhờ nhân lên từ gốc thành hàng tỷ phát hiện, nên xét nghiệm có độ nhạy cảm cao đủ sức để phát RNA virus có mẫu thử dù với số lượng thấp Ngồi ra, ngày người ta cịn đếm số lượng gốc RNA HCV có từ ban đầu mẫu thử dựa vào kỹ thuật PCR định lượng, gọi qPCR hay real-time PCR Về mặt nguyên tắc qPCR giống PCR có thêm tính giúp định lượng số lượng gốc ban đầu có mẫu thử nhờ hệ thống quang học có khả phát phản ứng xãy ống nghiệm nhân xãy Tôi biết có nhiều nơi làm xét nghiệm phát định lượng HCVRNA kết có lại khác dù thử bệnh nhân!! Do làm để tin tưởng kết xét nghiệm HCV-RNA xét nghiệm mà chi phí bệnh nhân phải trả khơng phải ít? Đúng Xét nghiệm HCV-RNA xét nghiệm dựa kỹ thuật PCR kỹ thuật hoàn toàn mở nên người làm xét nghiệm tự pha thuốc thử để làm xét nghiệm mà bị lệ thuộc kit xét nghiệm mua từ hãng nước đắt tiền Tuy nhiên hệ thống mở nên muốn kết xét nghiệm xác người làm xét nghiệm phải thực đủ chứng để kiểm sốt khơng có sơ sót xãy trình làm xét nghiệm chứng phải hiển thị kết xét nghiệm Với xét nghiệm phát HCV-RNA, kết phải hiển thị: (1) chứng dương để chứng minh khâu khuếch đại trình xét nghiệm đủ nhạy cảm, (2) chứng âm để chúng minh trình thao tác xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm gây kết dương tính giả, (3) chứng nội chứng âm để chứng minh khâu tách chiết RNA từ mẫu thử đạt độ nhạy, (4) đồng thời mẫu âm tính phải có chứng nội để chứng minh âm tính thật âm tính khơng phải âm tính giả Đối với xét nghiệm định lượng HCV-RNA kết phải hiển thị đường biểu diển chuẩn để chứng minh thao tác định lượng đạt chuẩn thông qua hệ số tương quan (R) mẫu chuẩn phải đạt 0.990 hiệu phản ứng (E) phải đạt 90-105% đồng thời chứng minh kết định lượng tính tốn từ kết mẫu chuẩn chạy song hành 174 với mẫu thử khơng phải tính tốn từ cơng thức có sẵn Ngồi ra, muốn kết luận kết âm tính kết định lượng phải hiển thị mẫu dương tính với chứng nội để đảm bảo âm tính âm tính thật khơng phải âm tính giả phản ứng khuếch đại bị ức chế Nếu kết xét nghiệm HCV-RNA tơi dương tính tơi có cần thiết phải điều trị đặc hiệu không? Và cần phải điều trị đặc hiệu thời gian phải điều trị bao lâu? Một người sau nhiễm virus viêm gan C thường khơng có triệu chứng hay có triệu chứng không đặc hiệu mơ hồ Tuy nhiên virus âm thầm xâm nhập nhân tế bào gan trình diễn tiến lâu hàng chục năm dẫn đến tế bào gan bị tàn phá dần gây hậu viêm gan mạn tính đến xơ gan, từ xơ gan dẫn đến ung thư gan Nguy người bị nhiễm HCV dẫn đến viêm gan mạn tính xơ gan đến ung thư gan cao (có thể 17-20%) Do vậy, khác với nhiễm virus viêm gan B cần phải xác định bị viêm gan B mạn tính (ALT tăng cao hay có bất thường tổ chức gan phát qua sinh thiết hay fibroscan) cần phải điều trị đặc hiệu; người bị xác định nhiễm virus viêm gan nên định điều trị đặc hiệu mà khơng cần phải có dấu hiệu chứng minh gan bị thương tổn viêm gan mạn tính Do trường hợp bạn nên điều trị đặc hiệu không cần phải đợi đến lúc men gan ALT cao gấp đơi bình thường hay sinh thiết fibroscan thấy có thương tổn tế bào gan điều trị Tuy nhiên trước điều trị, bạn phải thiết định làm hai xét nghiệm: định lượng HCV-RNA định genotype HCV để bác sĩ theo dõi hiệu điều trị định thời gian điều trị đặc hiệu bạn Để xác định điều trị đặc hiệu mà bác sĩ cho định bạn có hiệu quả, sau tháng điều trị bác sĩ phải định xét nghiệm định lượng HCV-RNA lần Nếu kết định lượng cho thấy lượng virus không giảm hay giảm 100 lần bác sĩ phải cân nhắc thay đổi phương thức điều trị hay phải ngưng điều trị bệnh khơng đáp ứng với điều trị đặc hiệu Nếu kết định lượng cho thấy lượng virus giảm 100 lần (chuyên môn gọi giảm log) bác sĩ đánh giá phát đồ điều trị đặc hiệu bạn hiệu Lúc bác sĩ phải định thời gian điều trị cho bạn bao lâu, định tuỳ thuộc vào genotype HCV mà bạn bị nhiễm loại nào, thông tin bác sĩ lấy từ lần xét nghiệm 175 định trước định điều trị cho bạn Nếu không may mà bạn bị nhiễm genotype HCV type bác sĩ phải điều trị cho bạn thêm tháng tức tổng thời gian điều trị phải 12 tháng Nếu bạn bị nhiễm genotype HCV 1, mà hay (tại Việt Nam, phát genotype HCV 3, 4, 5) bác sĩ cần điều trị cho bạn thêm tháng tức tổng thời gian điều trị tháng Trước định chấm dứt điều trị cho bạn bác sĩ phải định xét nghiệm phát HCV-RNA xem có cịn máu bạn hay không Nếu xét nghiệm cho kết dương tính bác sĩ chưa thể ngưng điều trị mà phải tiếp tục thêm tháng kết trở nên âm tính Sau chấm dứt điều trị, bác sĩ thường xuyên theo dõi xem bạn có bị tái phát hay tái nhiễm không xét nghiệm phát HCV-RNA máu bạn tháng lần Bất lúc xét nghiệm trở nên dương tính bác sĩ phải xem bạn bị tái phát hay tái nhiễm phải trở lại điều trị đặc hiệu ban đầu ●✆✝✞✟✠✡✆ gì? Xét nghiệm xác định genotype HCV xét nghiệm nào? Làm thực giá thành có cao khơng? Genotype kiểu khác biệt vi sinh vật loài dựa vào khác biệt dấu ấn gene vi sinh vật Cho đến y học xác định HCV phân làm 11 genotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11 Với genotype, HCV lại phân thành type 1a, 1b, 1c 2a, 2b, 2c 3a, 3b 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 5a, 6a, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 10a, 11a Xét nghiệm xác định genotype HCV loại xét nghiệm sinh học phân tử Tại Việt Nam, công ty Nam Khoa phát triển kỹ thuật vừa định lượng HCV-RNA vừa xác định genotype HCV Nguyên tắc kỹ thuật định lượng HCV-RNA trước kỹ thuật qPCR sau giải trình tự sản phẩm qPCR để xác định genotype HCV cách so chuỗi với thư viện genotype HCV NCBI Nhờ phát triển kỹ thuật này, với định vừa định genotype HCV, vừa định lượng HCV-RNA mà bác sĩ phải cho bệnh nhân trước định điều trị đặc hiệu, bệnh nhân phải trả chi phí cho xét nghiệm xác định genotype HCV mà có kết định lượng HCV-RNA Ngoài ra, kỹ thuật định genotype cơng ty Nam Khoa phát triển cịn có lợi kỹ thuật khác sử dụng ngồi nước kết genotype HCV ln phân biệt đến type kết đến type hay khơng thể phân biệt type với Hiện số sở xét nghiệm nước có triển khai xét nghiệm định kiểu gene HCV kỹ thuật 176 real-time PCR mà theo báo cáo tác giả xét nghiệm phân biệt đồng nhiễm genotype Tuy nhiên theo chúng tơi nhận định thật q vội vàng thiếu luận khoa học đồng nhiễm xãy (kinh nghiệm không cas 1000 cas) xét nghiệm lại cho kết đồng nhiễm đến cas 10 cas thử nghiệm Điều chứng tỏ kỹ thuật chưa đạt vội vàng đưa áp dụng cho chẩn đoán, thật nguy hiểm làm lệch hướng điều trị Bác Sĩ Nói tóm lại, tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C, qua xét nghiệm anti-HCV máu dương tính, Việt Nam dân số thuộc nhóm quốc gia có tỷ lệ nhiễm cao giới (2-8%) Nếu phát anti-HCV bị dương tính, bạn nên làm xét nghiệm phát HCV-RNA để xem có thật bị nhiễm HCV hay khơng Nếu dương tính, bạn nên điều trị đặc hiệu nguy dẫn đến xơ gan ung thư gan người nhiễm HCV cao, nữa, y học chữa lành người bị nhiễm HCV với tỷ lệ thành công từ 60% đến 100% Tuy nhiên trước định điều trị đặc hiệu, bạn cần phải định làm xét nghiệm định lượng HCV-RNA định kiểu gen HCV để vào mà bác sĩ đánh giá hiệu điều trị định thời gian điều trị Trước chấm dứt điều trị, bạn thiết phải định làm xét nghiệm phát HCV-RNA để xem máu hết virus không, sau chấm dứt điều trị xét nghiệm phải thường xuyên định thực bạn tháng lần để theo dõi bệnh có tái phát khơng hay bạn có bị tái nhiễm khơng 177 ... ngày hơm với xét nghiệm PCR người ta cịn đếm số lượng gốc DNA ban đầu có mẫu thử dựa vào kỹ thuật PCR định lượng, gọi qPCR hay real-time PCR Về mặt nguyên tắc qPCR giống PCR có thêm tính đếm có... số lượng gốc RNA HCV có từ ban đầu mẫu thử dựa vào kỹ thuật PCR định lượng, gọi qPCR hay real-time PCR Về mặt nguyên tắc qPCR giống PCR có thêm tính giúp định lượng số lượng gốc ban đầu có mẫu... vừa xác định genotype HCV Nguyên tắc kỹ thuật định lượng HCV-RNA trước kỹ thuật qPCR sau giải trình tự sản phẩm qPCR để xác định genotype HCV cách so chuỗi với thư viện genotype HCV NCBI Nhờ phát