cong nghe pcr

KỸ THUẬT PCR Polymerase Chain Reaction Sự phát minh ra kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR hay còn đ ợc gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymeraza đ ợc Kary Mullis phát minh vào năm 1983. Hai năm sau (1985), phát minh này đ ợc chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế. Bằng công trình này, Kary Mullis đ ợc tặng giải th ởng Nobel Hoá học năm 1993. Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng đ ợc coi là một b ớc ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách mạng !thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh học hiện đại .( J. Watson) Phơngphápnàycóđộnhạyrấtcaovàngàynayđãtrở thànhmộtcôngcụnghiêncứuđầutaytrongphầnlớncác phòngthínghiệmcóliênquanđếngenvàADNthuộccác lĩnhvựckhoahọcsinhhọc,nôngnghiệp,môitrờng,ytế,d ợcphẩm,phápy Khỏi nim Kỹ thuật PCR là một ph ơng pháp cho phép nhân nhanh số l ợng lớn một đoạn ADN. Sự tái bản DNA trong cơ thể sống Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymeraza để nhân bản một đoạn ADN nhờ hai đoạn mồi oligonucleotít (primer) t ơng hợp với hai đầu 3 ở hai mạch đơn của đoạn ADN Kỹ thuật này đợc phát minh nhờ sự phát hiện ra Taq polymerase,làmộtDNApolymerasetừvikhuẩnThermus aquaticussốngởsuốinớcnóng C¸c yªu cÇu cÇn thiÕt cho PCR  2 måi tæng hîp oligonucleotide (mçi måi cã kho ng 20-50 ả nucleotide) ( u 3' OH t do)đầ – ự  ADN khuôn  DNA polymerase chÞu nhiÖt (Tag- polymerase)  4 lo¹i nucleotide dNTP's: A, T, G, C  Mg ++ , dung dịch đệm, pH, etc. Cỏc giai on trong phn ng PCR Có 3 giai đoạn chính trong 1 phản ứng PCR và chúng đ ợc lặp lại từ 20-40 lần. Việc này đ ợc tự động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng làm tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời gian rất ngắn 1. Giãn xoắn (denaturation): Hai sợi của chuỗi xoắn kép đ ợc tách ra nhờ nhiệt độ cao (94-95 o C). 2. Gắn primer (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng đ ợc giảm xuống (55-60 o C) để các primer gắn vào các sợi ADN t ơng ứng theo nguyên tắc bổ sung của các bazơ nitơ. 3. Kéo dài mạch bổ sung ADN (DNA extension): Phản ứng trùng hợp phân tử ADN đ ợc thực hiện nhờ enzym ADN polymeraza (65-75oC) để kéo dài mạch bổ sung theo nguyên tắc bổ trợ với sợi khuôn từ đầu 3 đến 5 . 1 0 2 0 3 2 4 4 5 8 6 16 7 32 8 64 9 128 10 256 11 512 12 1024 13 2048 14 4096 15 8192 16 16.384 17 32.768 18 65.536 19 131.072 20 265.144 21 524.288 22 1.048.576 23 2.097.152 24 4.194.304 25 8.388.608 26 16.777.216 27 33.544.432 Gắn mồi vào chuỗi DNA (30-65 o C) 30 giây Tách thành sợi đơn DNA (94 o C, 30 giây) Tổng hợp chuỗi mới (65-75 o C, 2-5 phút) Khuôn DNA được biến đổi thành 2 sợi đơn (94 o C, 5 phút Chu trình PCR Chu kỳ phản ứng PCR Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 b ớc đ ợc lập đi lập lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu đ ợc hàng triệu bản copy của một đoạn ADN nào đó, đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau. Hỗn hợp phản ứng PCR GĐ1 GĐ2 GĐ3 Bắt đầu chu kỳ mới (2) Nhắc đi nhắc lại n chu kỳ Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) Cycling Program Step 1: 94 o C for 30 sec Step 2: 94 o C for 15 sec Step 3: 55 o C for 30 sec Step 4: 72 o C for 1.5 min Step 5: Go to step 2 for 35 times Step 6: 72 o C for 10 min Step 7: 4 o C forever Step 8: END PCR-Chu kỳ 1 [...]... qu ca PCR Hỡnh Mi quan h ca Tm vi hm lng G Vớ d: Cp mi nhõn gen chng bnh o ụn (nm trờn NST 12) lỳa nh PCR: CAGCTGTTCAGTCGTTTGCAGCTGTTC27 NUCLEOTID ATACCGTTATGGGCATTAAGGAAT24 NUCLEOTID Cp mi nhõn gen chng bnh bc lỏ lỳa Xa21 (gen khỏng bc lỏ, nm trờn nST 21-pTA-248) nh PCR: AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGAG24 NUCLEOTID AGCGCGGTGTAATCGAAAGATGAAA25 NUCLEOTID Các ứng dụng chủ yếu của PCR Sử dụng PCR để... bản sao 2 3= 8 bản 2 4= 16 bản sao Tc tng hp on DNA mc tiờu c tớnh bng cụng thc (2n - 2n)x n = s chu k x = s bn sao ca DNA khuụn Các thao tác sau PCR Sau khi chạy PCR, s n phẩm đ ợc nhận biết bằng cách chạy điện di trên gel Cỏc yu t nh hng n hiu qu ca PCR - Nng DNA khuụn, nucleotides, cations (c bit Mg2+) v enzyme polymerase - T l bt cp sai ca polymerase (Taq, Vent exo, Pfu) - Thit k mi Mg2+ ions:.. .PCR- Chu k 2 PCR- Chu k 3 Tốc độ tổng hợp ADN của phản ứng PCR Chu kỳ thứ Chu kỳ thứ 4 3 Đoạn gen cần nhân bản Số phân tử ADN đ ợc tổng hợp tăng theo hàm số mũ Chu kỳ thứ 2 Chu kỳ thứ 35 Chu kỳ thứ Sợi ADN khuụn 1 Chu kỳ thứ 2 2 1=... thể hoạt động ở nhiệt độ cao gấp 2 lần so với tag tự nhiên Một số enzym mới đ ợc phát triển gần đây, nh Tli- và Pfu- polymeraza, có độ chính xác cao hơn nh ng tốc độ tổng hợp ADN và hiệu suất phản ứng PCR không cao bằng Taq -polymeraza Recombinant Taq polymerase có tính đồng nhất cao độ phân gi i cao hơn Nhng lu ý khi thit k mi Cỏc c trng ca mi : Tớnh c hiu (Specificity) Dc hiu cho trỡnh t mc tiờu... (trỏnh lai khụng c hiu) Lu ý khi thit k: Tớnh duy nht (Uniqueness) di Thnh phn cỏc Base Tớnh t n nh (Internal Stability) Tớnh n nh (Stability) Nhit núng chy Hỡnh thnh dng si ụi bn vng vi DNA khuụn trong PCR Nhit gn mi Ni cu trỳc Tớnh tng thớch(Compatibility) Mi c dựng nh mt cp nờn cn hot ng c trong cựng iu kin S phự hp ca cp mi Chiu di mi Quá ngắn ko đặc hiệu Quá dài giảm hiệu quả lai Th ờng từ 18-25... dNTP cú th liờn kt li vi nhau Tng cng hot tớnh trựng hp ca polymerase Tng Tm ca s tng tỏc gia mi v DNA khuụn (i.e n nh tng tỏc gia mi v DNA khuụn) Thụng thng, Nng Mg2+ thp thỡ lm gim hiu sut nhõn ca PCR Nng Mg2+ cao dn ờn s tớch ly cỏc sn phm khụng c hiu (s bỏm sai v trớ ca mi- mispriming) Một số nhợc điểm của Taq polymeraza Thiếu chức năng sửa chữa lỗi trong quá trình tổng hợp phân tử ADN mới . times Step 6: 72 o C for 10 min Step 7: 4 o C forever Step 8: END PCR- Chu kỳ 1 PCR- Chu kỳ 2 PCR- Chu kỳ 3 Tốc độ tổng hợp ADN của phản ứng PCR Sợi ADN khuụn Đoạn gen cần nhân bản Chu kỳ thứ 1 Chu. Watson) Phơngphápnàycóđộnhạyrấtcaovàngàynayđãtrở thànhmộtcôngcụnghiêncứuđầutaytrongphầnlớncác phòngthínghiệmcóliênquanđếngenvàADNthuộccác lĩnhvựckhoahọcsinhhọc,nôngnghiệp,môitrờng,ytế,d ợcphẩm,phápy Khỏi nim Kỹ thuật PCR là một ph ơng pháp cho phép nhân nhanh số l ợng lớn một đoạn ADN. Sự tái bản DNA trong cơ thể sống Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác. phút) Khuôn DNA được biến đổi thành 2 sợi đơn (94 o C, 5 phút Chu trình PCR Chu kỳ phản ứng PCR Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 b ớc đ ợc lập đi lập lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có