PCR

Kỹ thuật PCR  !"# $%&' (!)*+, /)0*+,123! 4#567894 :7 ;. <=5>!3'? "@A6/ )*++ Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng đợc coi là một bớc ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách mạng "thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh học hiện đại .( J. Watson) B!CD9E(!! F@!D5G8#H HI4JC 8:;(!KLADM(   35J35N3 ;3OP3… Khái niệm !DBQ RD7ID9 KLA!C7J!SH D7T6HEU. A8VW A8VW    O 8  XY  W&KLA&ZR 6" D 9 KLA N  9 [ 4 02 B  (I  H -  @  9 B’ W9KLA 8HH;    \ [ ]  O 0$ [ C   \^ả O20 -_ `/ O2–đầ ự  KLAô  LAKaJ0bc 3 C Z a  JDI+1?B2  d9OOAb_  ' ee 3dung dịch đệm3/3. Các giai đoạn trong phản ứng PCR *. fF XV 0O2g /  W $ XV Q    N J D  0+dc +1  2. \. fV02gAJD" #"X7011ch^  2Z V(!KLAB#8V 6]W6&BB. QO!96]KLA0LAKX2g "#%RiKLAJ N&KLA&(h1cj12ZQ O!96]8V6](I 5. Khuôn ADN được biến đổi thành 2 sợi đơn (94oC, 5 phút) Gắn primer vào chân ADN (55-60 oC, 30 giây) Tổng hợp chuỗi ADN mới (65-75oC, 2-5 phút) Biến đổi để tách thành đơn (94oC, 30 giây) Chu trình PCR k"# Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bớc đợc lập đi lập lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu đợc hàng triệu bản copy của một đoạn ADN nào đó, đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau. Hỗn hợp phản ứng PCR GĐ1 GĐ2 GĐ3 Bắt đầu chu kỳ mới (2) Nhắc đi nhắc lại n chu kỳ Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) PCR-Chu kỳ 1 PCR-Chu kỳ 2 [...]... polymeraza, có độ chính xác cao hơn nhưng tốc độ tổng hợp ADN và hiệu suất phản ứng PCR không cao bằng Taq-polymeraza Recombinant Taq polymerase có tính đồng nhất cao độ phân gii cao hơn Các thao tác sau PCR Sau khi chạy PCR, sn phẩm được nhận biết bằng cách chạy điện di trên gel Cỏc yu t khỏc nh hng n hiu qu nhõn PCR tinh sch ca ADN khuụn Hot ng ca Enzyme ADN polymerase (Enzyme Th.polymerase.. .PCR- Chu k 3 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 30 40 chu kỳ của 3 bước Bước 1: biến tính 1 phút 94oC Bước 2: gắn primer 45 giây 54oC Primer Bước 3: polymer hoá 2 phút 72oC dNTP Tốc độ tổng hợp ADN của phản ứng PCR Chu kỳ thứ Chu kỳ thứ 4 3 Đoạn gen cần nhân bản Số phân tử ADN được tổng hợp tăng theo hàm số... ADN) Nng cỏc loi nucleotid Nng cỏc dung dch m Mg++, MgCl2 ưu điểm nổi bật của kỹ thuật PCR -Có thể sử dụng trực tiếp ADN vừa chiết xuất, không cần tinh chế -Chuỗi ADN làm khuôn không cần tách chiết, v tính đặc hiệu của phn ứng do các oligo nucleotid làm mồi quyết định Các ứng dụng chủ yếu của PCR Sử dụng PCR để tách dòng các đoạn ADN chưa biết trật tự nucleotít Chuẩn đoán nhanh, nhạy tất... xác cao các thủ phạm hỡnh sự từ nh ng dấu vết rất nhỏ: giọt máu, nước dãi, sợ tóc Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục triệu nm ng dng PCR trong tỏch/nhõn dũng gen ng dng PCR trong chn oỏn bnh (HIV) ng dng PCR trong chn oỏn bnh hng cu hỡnh li lim ... môi Bn chất ca DNA Hỡnh Mi quan h ca Tm vi hm lng G Vớ d: Cp mi nhõn gen chng bnh o ụn (nm trờn NST 12) lỳa nh PCR: CAGCTGTTCAGTCGTTTGCAGCTGTTC 27 NUCLEOTID ATACCGTTATGGGCATTAAGGAAT 24 NUCLEOTID Cp mi nhõn gen chng bnh bc lỏ lỳa Xa21 (gen khỏng bc lỏ, nm trờn nST 21-pTA-248) nh PCR: AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGAG 24 NUCLEOTID AGCGCGGTGTAATCGAAAGATGAAA 25 NUCLEOTID Giai đoạn 3: polymer hoá phân... Thời gian càng ngắn, tính gắn đặc hiệu càng cao nhưng làm giảm hiệu suất của quá trình tổng hợp ADN primer Sợi ADN mới ADN đích Sợi ADN mới Thi t k primer cho PCR Vic thit k mi cn phi cú thụng tin v trỡnh t ADN mc tiờu Cỏc lu ý khi thit k mi cho PCR : d i : Quá ngắn ko đặc hiệu Quá dài giảm hiệu quả lai Thường từ 18-25 Mi cú trỡnh t phự hp vi khuụn (template), khong cỏch gia cỏc mi xuụi v ngc khụng... tính của enzym và có thể gây biến tính sợi khuôn  Nhiệt độ cao gây biến tính phân tử ADN và giãn xoắn hai sợi đơn 2 Sợi ADN sau khi giãn xoắn Sợi ADN ban đầu 95oC Mg2+ Việc bổ sung Mg2+ vào phản ứng PCR giúp làm ổn định các mối tương tác giữa: oligonucleotít và sợi ADN khuôn ADN Polymeraza và sợi khuôn Giai đoạn 2: Gắn Primer (priming) Nhiệt độ giảm đi 15 25oC Các đoạn mồi (primer) gắn vào... xuụi v ngc khụng di quỏ 1 kb Trỏnh hin tng t bt cp gia cỏc mi mi xuụi v ngc cn cú trỡnh t khụng b sung vi nhau Cú khong 45- 60% G/C Cỏc mi cú kớch thc ớt khỏc nhau, cú Tm gn ging nhau tng hiu qu ca PCR Cỏc y u t nh h ng Tm c a primer: Chiu di ca primer Hm lng G/C i vi cỏc primers cú 15 - 26 nucleotides, tớnh Tm theo cụng thc Wallace (1989): T = [2(A+T) + 4(G+C)] C m ối với mồi > 20 35 bazơ . nhau. Hỗn hợp phản ứng PCR GĐ1 GĐ2 GĐ3 Bắt đầu chu kỳ mới (2) Nhắc đi nhắc lại n chu kỳ Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) PCR- Chu kỳ 1 PCR- Chu kỳ 2 PCR- Chu kỳ 3 Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 30 40 chu kỳ. ADN mới (65-75oC, 2-5 phút) Biến đổi để tách thành đơn (94oC, 30 giây) Chu trình PCR k"# Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bớc đợc lập đi lập lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu. Kỹ thuật PCR  !"# $%&' (!)*+, /)0*+,123! 4#567894 :7 ;. <=5>!3'? "@A6/