Từ 12 mẫu đất đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột, số lượng vi khuẩn dao động trong khoảng 1,52 x 106 CFU/g – 6,23 x 106 CFU/g. Tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn T1 và T12 có khả năng phân giải tinh bột mạnh với kích thước vòng phân giải đạt 25,33 mm – 25,67 mm.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số (2020) PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI TINH BỘT TỪ HỒ NUÔI THỦY SẢN Ở VÙNG PHÁ TAM GIANG, THỪA THIÊN HUẾ Hoàng Dương Thu Hương*, Nguyễn Thị Hồng Thảo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế *Email:thuhuongcnk32@gmail.com Ngày nhận bài: 26/6/2020; ngày hoàn thành phản biện: 3/7/2020; ngày duyệt đăng: 02/10/2020 TÓM TẮT Từ 12 mẫu đất phân lập 60 chủng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột, số lượng vi khuẩn dao động khoảng 1,52 x 106 CFU/g – 6,23 x 106 CFU/g Tuyển chọn hai chủng vi khuẩn T1 T12 có khả phân giải tinh bột mạnh với kích thước vịng phân giải đạt 25,33 mm – 25,67 mm Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy rằng, hai chủng vi khuẩn có tích lũy sinh khối hoạt tính enzyme mạnh mơi trường có pH 6,5 – 7,0 sau 48 – 60 Từ khóa: Chủng vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy, phân giải tinh bột MỞ ĐẦU Tam Giang vùng đầm phá nước lợ lớn khu vực Đông Nam Á, nằm hệ đầm phá Tam Giang - Cầu Hai, thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế Trong năm gần đây, nghề nuôi thủy sản phát triển mạnh mẽ, hàng năm khai thác hàng nghìn hải sản, cá, tơm loại [4] Tuy nhiên, ảnh hưởng ngành nuôi trồng thủy sản đến môi trường, đặc biệt nguồn nước nói chung ao hồ nói riêng tình trạng nhiễm đáng báo động gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái sức khỏe người dân khu vực Hiện nay, việc sử dụng biện pháp sinh học để xử lí nước thải chứng minh có hiệu suất xử lý cao biện pháp hóa lý khác [2] Cơ sở việc xử lý chất thải ao nuôi vi sinh vật (VSV) sử dụng VSV để phân giải chất nhiễm hữu có chất thải, bã thải Nhờ hoạt động VSV, chất nhiễm chuyển hóa nồng độ cho phép, mức không gây hại tới môi trường Để tìm hiểu khả phân giải chất hữu tinh bột vi khuẩn chất thải ao ni tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm ứng dụng phương pháp xử lí sinh học, làm sở cho nghiên cứu tạo chế phẩm VSV hữu ích làm 107 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ ni thủy sản … chất thải góp phần xử lý ô nhiễm môi trường, tiến hành phân lập chủng vi khuẩn từ hồ nuôi thủy sản vùng Tam Giang, Thừa Thiên Huế PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, địa điểm thời gian thực Các chủng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột phân lập từ mẫu đất hồ nuôi thủy sản vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế Địa điểm thu mẫu: Vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2019 đến tháng 4/2020 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập đếm số lượng tế bào Sử sụng phương pháp Koch để phân lập vi khuẩn có khả phân giải tinh bột môi trường thạch Vinogradski thạch đĩa thay nguồn carbon tinh bột [3] Xác định số lượng tế bào vi khuẩn mẫu phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc môi trường thạch đĩa [3] 2.2.2 Sơ tuyển chủng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột Các chủng vi khuẩn cấy vạch lên bề mặt thạch đĩa, ni cấy thời gian nhiệt độ thích hợp sau nhuộm màu thuốc nhuộm Lugol [1] 2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán thạch Các chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi cấy lắc tốc độ 120 rpm nhiệt độ phịng với thời gian thích hợp Ly tâm dịch ni máy ly tâm lạnh, tốc độ 8000 rpm 10 phút để thu phần dịch Chuẩn bị đĩa petri chứa thạch - chất: gồm 2% thạch 0,5% chất tinh bột Tạo giếng thạch có đường kính 12 mm, dùng micropipette hút 0,7 ml dịch enzyme vào giếng Làm lạnh 12 (4 - 6ᵒC) đưa vào tủ ấm 28 - 30ᵒC ủ 36 Nhuộm màu Lugol đo đường kính vịng phân giải chất [1] 2.2.4 Xác định sinh khối vi khuẩn Phần sinh khối tái huyền phù để tiến hành đo OD máy quang phổ kế bước sóng 610 nm, dựa vào đồ thị chuẩn để xác định sinh khối tạo thành 108 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số (2020) 2.2.5 Xác định số đặc điểm hình thái Quan sát đại thể môi trường thạch đĩa, sử dụng phương pháp làm tiêu phiến kính để quan sát hình thái tế bào [3] 2.2.6 Thăm dò số điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase vi khuẩn Tối ưu hóa số điều kiện ni cấy: thời gian, pH thích hợp cho sinh trưởng phát triển sinh tổng hợp enzyme vi khuẩn phương pháp “ lúc – biến” (one – variable – at – a – time – method) 2.2.7 Xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm Excel 2016 phân tích ANOVA (Duncan’s test p < 0,05) chương trình SPSS 20.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột 3.1.1 Tìm hiểu số lượng vi khuẩn Từ 12 mẫu đất đáy hồ nuôi thủy sản vùng phá Tam Giang - Thừa Thiên Huế tiến hành phân lập đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn có khả phân giải tinh bột môi trường thạch (chứa tinh bột) Kết số lượng vi khuẩn phân giải tinh bột trình bày bảng Bảng Số lượng vi khuẩn mẫu đất hồ nuôi thủy sản STT Ký hiệu mẫu 10 11 12 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 RC1 RC2 RC3 RC4 CT7 CT8 Địa điểm thu mẫu Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản Rú Chá Hồ nuôi thủy sản Rú Chá Hồ nuôi thủy sản Rú Chá Hồ nuôi thủy sản Rú Chá Hồ nuôi thủy sản Cồn Tè Hồ nuôi thủy sản Cồn Tè pH Thời gian thu mẫu 6,8 4,2 5,0 4,1 4,2 4,0 5,5 5,3 4,2 4,2 3,7 4,1 6/12/2019 6/12/2019 6/12/2019 6/12/2019 6/12/2019 6/12/2019 7/1/2020 7/1/2020 7/1/2020 7/1/2020 3/2/2020 3/2/2020 Số lượng vi khuẩn CFU/g (x106) 6,26 3,45 6,32 3,75 2,98 3,31 4,14 3,56 2,88 3,11 1,52 3,37 Từ kết bảng cho thấy, số lượng vi khuẩn có khác biệt dao động tùy vị trí lấy mẫu Số lượng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột cao mẫu 109 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản … CT3 (6,23 x106 CFU/g đất khô) lấy từ hồ nuôi thủy sản Cồn Tè, số lượng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột thấp mẫu CT7 (1,52 x106 CFU/g đất khô) lấy địa điểm Như vậy, địa điểm lấy mẫu thời điểm khác số lượng vi khuẩn khơng giống nhau, điều phụ thuộc vào nhiệt độ, pH thời gian thu mẫu khác 3.1.2 Đánh giá khả phân giải tinh bột vi khuẩn Bảng Khả phân giải tinh bột chủng phân lập Khả phân giải Yếu Trung Bình Mạnh Rất mạnh Chiều rộng vạch phân giải w < 10 10 ≤ w < 15 15 ≤ w < 20 w ≥ 20 Số chủng 26 18 Tỷ lệ (%) 15,00 43,33 30,00 11,67 Từ kết bảng cho thấy, tất chủng vi khuẩn phân lập có khả phân giải tinh bột mức độ khác Có 26 chủng có khả phân giải tinh bột trung bình, chiếm tỷ lệ cao (43,33%) Các chủng có khả phân giải tinh bột mạnh chiếm tỷ lệ lớn (30,00%) Thông qua sơ tuyển phát chủng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột mạnh chiếm tỷ lệ 11,67% Hình Vạch phân giải tinh bột số chủng vi khuẩn mạnh 3.1.3 Hoạt lực phân giải tinh bột chủng vi khuẩn tuyển chọn Trong số chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tơi chọn 10 chủng có kích thước vạch phân giải lớn để tiến hành tuyển chọn phương pháp khuếch tán thạch đĩa Kết trình bày bảng 110 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số (2020) Bảng Kích thước vịng phân giải tinh bột chủng vi khuẩn STT 10 Chủng T1 T6 T12 T14 T15 T17 T30 T43 T47 T55 Kích thước (mm) 25,33a 20,67bc 25,67a 21,33b 16,33de 18,67cd 21,00b 16,67de 17,33d 19,67c Ghi chú: Sự sai khác chữ cột biểu sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) Trong 10 chủng xác định hoạt tính enzyme, chủng T1 T12 có vịng phân giải lớn nhất, kích thước vịng phân giải 25,33 mm 25,67 mm Do chúng tơi chọn chủng T1 T12 làm đối tượng cho nghiên cứu Hình Vịng phân giải tinh bột chủng vi khuẩn mạnh 3.2 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 3.2.1 Chủng T1 - Khuẩn lạc hình trịn, kích thước 2-3 mm, bề mặt trơn, nhẵn, màu trắng sữa, độ dày 1-2 mm 111 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản … - Tiến hành nhuộm Gram âm chủng T1 quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x100, cho thấy tế bào chủng T1 bắt màu hồng, có hình que dài đứng riêng lẻ Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng T1 (x100) 3.2.2 Chủng T12 - Khuẩn lạc hình trịn, kích thức 2-3 mm, bề mặt trơn, nhẵn, màu trắng trong, dộ dày 1-2 mm - Tiến hành nhuộm Gram âm chủng T12 quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x100, cho thấy tế bào chủng T12 bắt màu hồng có hình trịn đứng riêng lẻ Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng T12 (x100) 3.3 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng, phát triển hoạt tính enzyme vi khuẩn Để thăm dị ảnh hưởng thời gian ni cấy đến sinh trưởng phát triển hoạt tính enzyme vi khuẩn, tiến hành nuôi cấy lắc hai chủng vi khuẩn mơi 112 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số (2020) trường Vinogradski dịch thể Sau mốc thời gian 12, 24, 36, 48, 60, 72 xác định hoạt tính amylase sinh khối chủng vi khuẩn Kết nghiên cứu cho thấy, sau 12 giờ, tích lũy sinh khối hoạt tính amylase bắt đầu tăng mạnh hai chủng vi khuẩn đạt cực đại 48 chủng T1 60 chủng T12 Sau khoảng thời gian này, hoạt tính amylase sinh khối bắt đầu giảm Bảng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển hoạt tính amylase hai chủng T1 T12 T1 Thời gian nuôi cấy (giờ) 12 24 36 48 60 72 Sinh khối khô (mg/ml) 1,31f 1,66d 1,83b 2,03a 1,72c 1,50e T12 Đường kính vịng phân giải (mm) Sinh khối khơ (mg/ml) Đường kính vòng phân giải (mm) 13,67f 23,00c 25,33b 27,00a 20,33d 14,67e 0,41f 4,45e 0,87d 1,51b 2,07a 1,39c 17,33e 19,67d 20,00cd 22,33b 25,67a 20,33c Ghi chú: Sự sai khác chữ cột biểu sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) 3.3 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng, phát triển hoạt tính enzyme vi khuẩn pH môi trường điều chỉnh mức 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 đệm phosphate; sau thời gian ni cấy thích hợp (48 chủng T1 60 chủng T12) xác định hoạt tính amylase sinh khối chủng vi khuẩn Kết nghiên cứu cho thấy, hai chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng phát triển khoảng pH rộng chủng T1 thích hợp pH 6,5 chủng T12 thích hợp pH Khi pH môi trường tăng lên, sinh khối hoạt tính enzyme chủng vi khuẩn giảm Bảng Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển hoạt tính amylase hai chủng T1 T12 T1 pH 5,0 5,5 6,0 Sinh khối khơ (mg/ml) 1,00g 1,35f 3,05c T12 Đường kính vịng phân giải (mm) Sinh khối khơ (mg/ml) Đường kính vịng phân giải (mm) 12,33g 21,00d 24,67c 1,95e 2,16d 2,51bc 17,33f 19,00e 24,00d 113 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản … T1 Sinh khối khô (mg/ml) 5,34a 4,24b 2,31d 1,63e pH 6,5 7,0 7,5 8,0 T12 Đường kính vịng phân giải (mm) Sinh khối khơ (mg/ml) Đường kính vịng phân giải (mm) 28,00a 26,33b 18,33e 15,67f 2,73b 3,30a 3,06ab 2,37c 26,67c 45,00a 27,33b 13,67g Ghi chú: Sự sai khác chữ cột biểu sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) KẾT LUẬN Số lượng vi khuẩn có khả phân giải tinh bột phân lập từ mẫu đất hồ nuôi vùng phá Tam Giang dao động khoảng từ 1,52 x 106 CFU/g - 6,32 x 106 CFU/g Trong 60 chủng vi khuẩn phân giải tinh bột phân lập từ 12 mẫu đất, tuyển chọn chủng T1 T12 có khả phân giải tinh bột mạnh Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển hoạt tính enzyme mạnh chủng vi khuẩn: - Chủng T1: thời gian nuôi cấy 48 giờ, pH môi trường 6,5 - Chủng T12: thời gian nuôi cấy 60 giờ, pH môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu, Phạm Văn Ty, 1978 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, Tập Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [2] K Selvam, T Selvankumar, R Rajiniganth, P Srinivasan, C Sudhakar, B Senthilkumar, M Govarthanan (2016), "Enhanced production of amylase from Bacillus sp using groundnut shell and cassava waste as a substrate under process optimization: Waste to wealth approach", Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, Vol.7, pp 250 - 256 [3] Phạm Thị Ngọc Lan, 2012 Giáo trình thực tập Vi sinh vật học, Nxb Đại học Huế [4] https://vi.wikipedia.org/wiki/Phá_Tam_Giang 114 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số (2020) ISOLATION AND SELECTION OF AMYLOLYTIC BACTERIA FROM AQUACULTURE PONDS IN TAM GIANG LAGOON , THUA THIEN HUE PROVINCE Hoang Duong Thu Huong*, Nguyen Thi Hong Thao Faculty of Biology, University of Sciences, Hue University *Email: thuhuongcnk32@gmail.com ABSTRACT In this study, sixty strains of amylolytic bacteria were isolated from 12 soil samples of aquaculture ponds The number of bacteria strains is around 1,52 x 106 CFU/g 6,32 x 106 CFU/g Among this number, two strains called T1 and T12 with strong starch hydrolysis ability with enzyme activity at 25,33 mm - 25,67 mm were seclected This study indicates that these two amylolytic bacteria strains have the best rise of biomass and enzyme at pH 6,5 - 7,0, after 48-60 hours Keywords: Amylolytic, bacteria strains, cultural conditions Hoàng Dương Thu Hương sinh ngày 30/04/1990 Bà tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học năm 2013, tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học năm 2015 Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Từ năm 2013 đến cán giảng dạy Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 115 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản … 116 ... nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản cồn Tè Hồ nuôi thủy sản Rú Chá Hồ nuôi thủy sản Rú Chá Hồ nuôi thủy sản Rú Chá Hồ nuôi. . .Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản … chất thải góp phần xử lý nhiễm mơi trường, tiến hành phân lập chủng vi khuẩn từ hồ nuôi thủy sản vùng Tam Giang, Thừa. .. phân giải tinh bột cao mẫu 109 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản … CT3 (6,23 x106 CFU/g đất khô) lấy từ hồ nuôi thủy sản Cồn Tè, số lượng vi khuẩn có khả phân